多指標綜合評分-正交試驗法優化參芪益氣膠囊的水提工藝

牛曉靜，張　輝，劉曉龍，張文鑫，段曉穎#

（1.河南中醫學院第一附屬醫院藥學部，鄭州　450000；2.河南中醫學院藥學院，鄭州　450000）

多指標綜合評分-正交試驗法優化參芪益氣膠囊的水提工藝

牛曉靜1＊，張輝1，劉曉龍2，張文鑫1，段曉穎1#

（1.河南中醫學院第一附屬醫院藥學部，鄭州450000；2.河南中醫學院藥學院，鄭州450000）

目的：優化參芪益氣膠囊的水提工藝。方法：以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素提取率等為指標進行綜合評分，以加水倍數、煎煮次數、煎煮時間為考察因素，采用L9（34）正交試驗優化參芪益氣膠囊中藥材的水提工藝并進行驗證試驗。結果：最優提取工藝為加8倍量水煎煮3次，每次2 h；驗證試驗中3批樣品提取后的綜合評分分別為98.95、99.71、99.98 （RSD＜2%，n=3）。結論：采用多指標綜合評分-正交試驗法優化的參芪益氣膠囊的水提工藝穩定、科學、合理。

參芪益氣膠囊；提取工藝；正交試驗；多指標綜合評分

參芪益氣膠囊由人參、黃芪、山茱萸、太子參、蜜款冬花、淫羊藿、矮地茶等12味中藥組成，為河南中醫學院第一附屬醫院（以下簡稱我院）臨床常用驗方，已應用多年，具有補肺益氣、化痰、活血的功效，可減輕炎癥反應、黏液分泌及氣道阻塞，提高免疫功能等，是中醫治療慢性阻塞性肺疾?。–OPD）穩定期肺腎氣虛證的有效藥物［1］。方中君藥為黃芪，主要活性成分為黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等三萜皂苷、黃酮類成分；淫羊藿、矮地茶為佐藥，主要活性成分分別為淫羊藿苷、巖白菜素等黃酮、苯醌類成分。為有效提取出該方藥材的有效成分，增強臨床療效，筆者對方中藥材進行了提取工藝的優化。

1　材料

1.1儀器

e2695型高效液相色譜（HPLC）儀、2424型蒸發光散射檢測器（美國Waters公司）；CP225D型電子天平（德國Satorious公司）。

1.2藥材、藥品與試劑

黃芪、太子參、蜜款冬花、淫羊藿、矮地茶等藥材均購自河南中一醫藥經營有限公司（批號：120113、130209、130124、121008、120910），經我院陳天朝主任藥師鑒定為真品；黃芪甲苷、淫羊藿苷、巖白菜素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110781-200613、110737-200415、111532-200202，純度分別為：93.0%、供含量測定用、94.4%）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號：201001，純度：98.8%）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1黃芪甲苷的含量測定[2]

2.1.1色譜條件色譜柱為Agilent-ZORBAX Eclispe XDBC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（32∶68），流速為1 ml/min；柱溫為30℃；蒸發光散射檢測器，漂移管溫度為80℃，霧化溫度為60%，載氣壓力為30 psi。

2.1.2對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成21.74 mg/L對照品溶液，搖勻，即得。

2.1.3供試品溶液的制備精密吸取正交試驗各提取液50.0 ml，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 ml，合并正丁醇提取液；用氨試液充分洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液；正丁醇液用正丁醇飽和的水充分洗滌2次，每次40 ml，棄去水液；正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，并用甲醇洗滌蒸發皿，溶液和洗滌液一并轉入5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.1.4陰性對照溶液的制備按處方比例分別稱取除黃芪以外的其余藥味，按提取工藝制成缺黃芪的陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.1.5線性關系考察分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液4、8、12、16、20 μl，進樣測定峰面積。以進樣質量濃度的常用對數為橫坐標（x）、峰面積的常用對數為縱坐標（y），繪制標準曲線。結果，回歸方程為y=1.441x+5.415 4（r=0.999 4），表明黃芪甲苷的檢測質量濃度線性范圍為0.086 96～0.434 8 mg/ml。

2.1.6方法學考察取經微孔濾膜（0.22μm）濾過后的對照品溶液（10 μl）、供試品溶液（正交試驗3號樣品，20 μl）和陰性對照溶液（20 μl），分別進樣，記錄色譜圖。結果表明陰性對照無干擾。按相關方法操作，精密度試驗RSD=0.85%（n=6）、重復性試驗RSD=1.25%（n=6）；定量限為30 ng/ml；加樣回收率試驗中平均回收率為98.79%（RSD=1.32%，n=6）。黃芪甲苷色譜圖見圖1。

圖1　黃芪甲苷高效液相色譜圖A.黃芪甲苷對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺黃芪陰性對照溶液Fig 1　HPLC chromatogram of astragalosideA.astragaloside control solution；B.test sample solution；C.negative control withoutAstragalus membranaceus

2.2毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、巖白菜素的含量測定

2.2.1色譜條件與系統適用性試驗（分別測定） 色譜柱均為Agilent-ZORBAX Eclispe XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器均為紫外檢測器，柱溫均為30℃，流速均為1 ml/min。（1）毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜條件：流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脫（0→30 min，10%→30%A；30→32 min，30%→100%A）；檢測波長為260 nm。理論板數按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計不低于3 000。（2）淫羊藿苷色譜條件：流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0→17 min，24%A；17→18 min，24%→60%A；18→22 min，60%A；22→30 min，60%→24% A）；檢測波長為270 nm。理論板數按淫羊藿苷峰計不低于1 500。（3）巖白菜素色譜條件：流動相為甲醇-水（15∶85）；檢測波長為275 nm。理論板數按巖白菜素計不低于1 500。

2.2.2對照品溶液的制備分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、巖白菜素對照品適量，分別加甲醇溶解并定容，搖勻，即得20.36、18.76、56.1 mg/L的對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備分別精密吸取正交各提取液20、10 ml，轉入25 ml量瓶中，加入適量甲醇稀釋并定容，搖勻，離心（4 000 r/min，離心半徑12 cm）15 min，取上層清液，分別得供試品溶液a、b。

2.2.4陰性對照溶液的制備按處方比例分別稱取除黃芪、淫羊藿、矮地茶以外的其余藥味，按一定工藝條件分別制成缺黃芪、淫羊藿、矮地茶的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法分別制備陰性對照溶液。

2.2.5線性關系考察分別精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷對照品溶液各2、4、8、12、16、20 μl，巖白菜素對照品溶液1、2、5、10、15 μl，分別按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，并計算回歸方程及其相關系數。以進樣質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），得回歸方程分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷y=4.89×106x-1.49×103（r=0.999 9），淫羊藿苷y=3× 106x-14 675（r=0.999 9），巖白菜素y=6.59×106x-4.06×103（r=0.999 9）；三者線性范圍分別為0.040 72～0.407 2、0.037 52～0.375 2、0.056 1～0.841 5 mg/ml。

2.2.6方法學考察分別取經微孔濾膜（0.22μm）濾過后的對照品溶液（10 μl）、供試品正交試驗3號樣品溶液a、b（a、b號各20、5 μl，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和淫羊藿苷采用a號，巖白菜素采用b號）和陰性對照溶液（20 μl），分別進樣分析，記錄色譜圖，結果表明陰性對照均無干擾。按相關方法進行試驗，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素精密度試驗的RSD分別為0.89%、0.65%、0.47%（n=6），重復性試驗的RSD分別為1.25%、0.98%、1.03%（n=6）；定量限分別為23、15、13 ng/ml；加樣回收率試驗的平均回收率分別為98.99%、101.38%、101.11%（RSD分別為1.13%、1.32%、0.98%，n=6）。三者色譜圖見圖2。

圖2　毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素高效液相色譜圖A、B、C.缺黃芪、淫羊藿、矮地茶陰性對照溶液；D、E、F.供試品a、a、b溶液；G、H、I.對照品溶液；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2.淫羊藿苷；3.巖白菜素Fig 2　HPLC chromatogram of calyosin-7-O-β-D-glycoside，icariin and bergeninA，B，C.negative control solution without A.membranaceus，Epimedium brevicornu，or Ardisia japonica；D，E，F.test sample solution a，a，b；G，H，I.substance control solution；1.calyosin-7-O-β-D-glycoside；2. icariin；3.bergenin

2.3提取工藝設計

依據前期的試驗基礎，確定參芪益氣處方的藥效部位為水溶性部分，因此設計提取溶劑為水。在此基礎上，根據初步預試結果，確定加水倍數（A）、煎煮次數（B）、煎煮時間（C）為主要影響因素，選用L9（34）正交表進行試驗，以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、巖白菜素提取率（提取率=有效成分的量/藥材稱量×100%）為評價指標。因素與水平見表1。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

2.4權重系數及綜合評分公式的確定

采用層次分析法（AHP）進行分析［3］，方中黃芪甘溫而補益肺脾之氣并固衛，為方中君藥；淫羊藿、矮地茶為佐藥。在黃芪代表性成分黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷中，前者相對后者更重要，記前者2分；與淫羊藿和矮地茶代表性成分淫羊藿苷和巖白菜素比較，黃芪甲苷相對更重要，記5分；與淫羊藿苷和巖白菜素比較，毛蕊異黃酮葡萄糖苷相對更重要，記3分；淫羊藿苷與巖白菜素相對重要性相同，均記1分；其余以此類推。采用AHP計算最終確定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素的權重系數分別為0.518 2、0.283 8、0.099 02、0.099 02，經一致性檢驗結果得一致性比率（CR）＜0.1，表明權重系數合理、有效。

綜合評分=黃芪甲苷提取率評分+毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率評分+淫羊藿苷提取率評分+巖白菜素提取率評分。黃芪甲苷提取率評分=（黃芪甲苷提取率/黃芪甲苷提取率最大值）×100×0.518 2；毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率評分=（毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率/毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率最大值）× 100×0.283 8；淫羊藿苷提取率評分=（淫羊藿苷提取率/淫羊藿苷提取率最大值）×100×0.099 02；巖白菜素提取率評分=（巖白菜素提取率/巖白菜素提取率最大值）×100×0.099 02。

2.5正交試驗設計與結果

按處方比例稱取各藥味，共計180 g，共9份，按正交設計安排試驗，藥材加適量水、煎煮一定時間和次數后，過濾，合并提取液。分別收集提取液，作為供試品母液，依法測定。正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2　正交試驗結果Tab 2　The orthogonal test results

表3　方差分析結果Tab 3　Results of variance analysis

由直觀分析可知，各因素對綜合評分的影響順序為B＞C＞A。方差分析結果表明，因素B具有顯著性影響，因素A、C無顯著性影響。最終確定最優工藝為A1B3C3，即加8倍量水煎煮3次，每次2 h。根據最優工藝進行提取，驗證試驗中3批樣品提取后4種指標成分提取率的RSD均小于2%（n=3），表明提取工藝穩定，詳見表4。

表4　驗證試驗結果Tab 4　Results of verification test

3　討論

3.1多指標綜合評分法

本試驗采用多指標綜合評分法，其可將試驗過程中多方面的變化予以綜合考慮，并采用適當的數學處理方法使各變化結果具有加和性，從而可全面監測試驗過程。相對單指標而言，多指標綜合評價可使優化的工藝代表性更強，能更全面地反映試驗結果［4-5］。在采用多指標的正交試驗進行工藝優化時，首先要解決指標間量綱不一致和指標間的矛盾問題，然后針對指標間的重要性差異確定各指標權重，綜合評分后再進行統計分析。AHP采用系統分析的方法，根據評價目的所確定的總評價目標，對評價對象進行連續性分解，得到各級（或各層）評價目標，并以最下層作為衡量目標達到程度的評價指標，然后依據這些指標計算出綜合評分指數，以其大小來確定評價對象的優劣等級［3］。

3.2色譜條件的篩選

在確定淫羊藿苷的色譜條件篩選試驗中，筆者曾參照文獻［6-8］方法及《中國藥典》方法［2］進行試驗。但由于本研究的樣品成分較復雜，各試驗條件下分離效果均不好，淫羊藿苷分離度差，不能達到基線分離。最后綜合各試驗方法，最終確定了本文所述的色譜條件，結果表明能較好地將淫羊藿苷分離。

3.3淫羊藿苷的提取率

在試驗中筆者發現，淫羊藿苷的提取率超過100%（藥材含量為0.3%），懷疑是由于淫羊藿中其他黃酮類成分如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ等，可能在煎煮過程中相互轉化所致；但查閱文獻［8］發現有研究證明淫羊藿苷的生成量并不等同于朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 3種黃酮苷類成分的減少量，由此說明淫羊藿苷并不是全部從其他3種黃酮苷類轉化而來，而是淫羊藿中多成分共同參與的復雜的轉化過程。至于具體是哪種成分轉化而來，有待進一步試驗證明。

3.4有效成分指標的確定

在控制含黃芪類樣品的質量時，目前多以黃芪甲苷含量為指標。本試驗中則增加了黃芪中黃酮類成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為指標。因現代藥理研究證明黃芪中的黃酮類成分具有調節免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突變、清除自由基等多種藥理作用［9-12］，因此，增加黃酮類成分的含量為指標能更全面地反映復方的藥效物質基礎。

［1］李素云，李建生.慢性阻塞性肺疾病中醫藥研究進展［J］.中國中醫藥信息雜志，2002，9（6）：83.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：283、306-307.

［3］任愛農，盧愛玲，田耀洲，等.層次分析法用于中藥復方提取工藝的多指標權重研究［J］.中國中藥雜志，2008，33 （4）：372.

［4］張倩，劉志宏，周欣，等.多指標正交試驗優化葛澤清肝膠囊的提取工藝［J］.中國醫院藥學雜志，2011，31（17）：1 432.

［5］劉蘭萍，段好剛，魏玉輝，等.多指標綜合優化疏乳消塊方的提取工藝［J］.中成藥，2012，34（12）：2 318.

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（編輯：劉萍）

Optimization of Water Extraction Technology for Shenqi Yiqi Capsules with Multi-index Comprehensive Score-orthogonal Test

NIU Xiaojing1，ZHANG Hui1，LIU Xiaolong2，ZHANG Wenxin1，DUAN Xiaoying1
（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，China；2.College of Pharmacy，Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To optimize water extraction technology of Shenqi yiqi capsules.METHODS：The water extraction technology of Shenqi yiqi capsules was optimized by L9（34）orthogonal test with amount of water added，decoction times and decoction time as factors using the extraction rate of astragaloside，calyosin-7-O-β-D-glycoside，icariin and bergenin as index，and the verification test was made.RESULTS：The best extraction technology was as follows as 8-fold water，decocting for 3 times，2 h each time；comprehensive score of 3 batches of samples in validation test were 98.95，99.71 and 99.98（RSD＜2%，n=3）.CONCLUSIONS：The water extraction technology optimized by multi-index comprehensive score-orthogonal test is stable，scientific and reasonable.

Shenqi yiqi capsules；Extraction technology；Orthogonal test；Multi-index comprehensive score

R285.2

A

1001-0408（2016）22-3139-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.34

＊主管藥師，碩士。研究方向：中藥新藥、質量控制。電話：0371-66233639。E-mail：niuxiaojing314@163.com

主任藥師，碩士生導師，碩士。研究方向：中藥新技術、新劑型。E-mail：dxy137@sina.com

2015-12-09

2016-03-01）