木犀草素和木犀草苷在大鼠體內的藥動學研究Δ

鄒曉華，王雙虎，周云芳#

（1.麗水市第二人民醫院藥劑科，浙江麗水　323000；2.麗水市人民醫院臨床藥學實驗室，浙江麗水　323000）

木犀草素和木犀草苷在大鼠體內的藥動學研究Δ

鄒曉華1＊，王雙虎2，周云芳2#

（1.麗水市第二人民醫院藥劑科，浙江麗水323000；2.麗水市人民醫院臨床藥學實驗室，浙江麗水323000）

目的：建立測定木犀草素和木犀草苷在大鼠體內的藥動學方法并測定其藥動學參數。方法：16只SD大鼠隨機分為木犀草素組（舌下iv，1.34 mg/kg）和木犀草苷組（舌下iv，0.64 mg/kg），并于給藥前和給藥后0、15、30 min及1、2、3、4、6、8、12、24、48 h經尾靜脈取血0.5 ml制備血漿，采用超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜法測定血藥濃度，并計算藥動學參數。色譜柱為CORTECSTM UPLC?C1（8100 mm×2.1 mm，1.6 μm），流動相為乙腈-水（含0.1%甲酸），流速為0.4 ml/min，柱溫為40℃，內標為槲皮苷。結果：木犀草素、木犀草苷的線性范圍分別為2.5～500 ng/ml（r=0.998 2）、10～2 500 ng/ml（r=0.993 5），定量下限分別為1、2.5 ng/ml，提取回收率分別為70.75%～87.72%、75.40%～91.18%（n=6），日內、日間RSD均小于10%（n=3）。藥動學參數t1/2分別為（1.88±0.32）、（1.57±0.08）h，CL分別為（0.77±0.18）、（0.06±0.01）L（/h·kg），AUC0-6 h分別為（189.60±40.04）、（1 093.14± 187.36）ng·h/ml，AUC0-∞分別為（195.18±38.37）、（1 097.11±188.07）ng·h/ml。結論：本研究建立的方法可用于木犀草素和木犀草苷在大鼠體內的藥動學研究，兩者在大鼠體內的藥動學符合二室模型。

木犀草素；木犀草苷；血藥濃度；藥動學；超高效液相串聯質譜法

木犀草素（Luteolin）是植物最常見的類黃酮類化合物并被歸為黃酮類。含有木犀草素的植物如金銀花、菊花、荊芥、白毛夏枯草等常作為食物或藥物用于治療各種疾?。?］。木犀草素的藥理活性主要包括抗腫瘤、抗炎、抗感染、治療糖尿病等［2-3］。目前，木犀草素的抗腫瘤活性已得到廣泛研究，其還可有效抑制肝細胞核因子4α（HNF4α）而抑制其表達載脂蛋白B（apoB），但治療糖尿病的機制尚不明確［4-6］。食用木犀草素可抑制肥胖、降低血清和肝臟脂質水平從而改善糖耐量高患者的飲食。木犀草苷（Cynaroside）是木犀草素-7-O-葡萄糖苷，是從許多藥用植物中發現的黃酮類化合物，體外試驗表明它能清除氧自由基、減少低密度脂蛋白的氧化［7］。早期研究報道顯示木犀草苷在離體大鼠心臟中具有抗缺血作用，這可能與它的抗氧化性質有關。

木犀草素和木犀草苷血藥濃度檢測方法主要有高效液相色譜法［8-9］和高效液相串聯質譜法［10-11］。本研究采用超高效液相色譜（UPLC）串聯三重四級桿質譜法建立檢測木犀草素和木犀草苷血藥濃度的方法，研究了兩者在大鼠體內的藥動學過程。本研究建立的測定方法快速、穩定，可用于大鼠體內木犀草素和木犀草苷的藥動學研究。

1　材料

1.1儀器

XEVO-TQD型UPLC-三重四極桿質譜聯用儀（美國Wa-ters公司）；Milli-Q A10型純水系統（美國Millipore公司）；5804R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；XS105DU型電子天平（美國梅特勒-托利多儀器有限公司）；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；TGL-16B型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2藥品與試劑

木犀草素對照品、木犀草苷對照品、槲皮苷對照品（成都曼斯特公司，批號：MUST-15021005、MUST-15012204、MUST-14092105，純度：99%）；甲醇、乙腈（美國Merck Chemicals公司，色譜純）；其他試劑均為分析純，均購自北京國藥化學試劑公司。

1.3動物

清潔級SD大鼠16只，♀♂兼半，體質量（300±20）g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2010-0150。

2　方法與結果

2.1UPLC條件

色譜柱：CORTECSTM UPLC?C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相：乙腈-水（含0.1%甲酸），梯度洗脫（0～2 min 20%～95%乙腈，2～2.5 min 95%乙腈，2.5～2.6 min 95%～20%乙腈，2.6～3 min 20%乙腈）；流速：0.4 ml/min；柱溫：40℃；進樣量：2 μl；內標：槲皮苷。

2.2質譜條件

電噴霧離子化源（ESI），負離子檢測模式。毛細管電壓：1.0 kV；木犀草素、木犀草苷、槲皮苷的錐孔電壓：56、60、43 V，碰撞電壓：30、26、20 V；源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃，錐孔氣流量：50 L/h；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；氬氣流量：0.15 ml/min。用于定量分析的離子質荷比：m/z 284.98→133.03（木犀草素）、m/z 447.05→284.96（木犀草苷）、m/z 301.12→151.05（槲皮苷）。

2.3溶液的制備

2.3.1對照品溶液的制備精密稱取木犀草素和木犀草苷對照品各約5 mg，置于10 ml量瓶中，加入乙腈-水（1∶9，V/V）稀釋至刻度，搖勻，得木犀草素和木犀草苷質量濃度均為500 μg/ml的對照品貯備液，4℃貯藏，備用。將木犀草素和木犀草苷對照品貯備液連續以純水稀釋成質量濃度為0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 μg/ml的系列木犀草素對照品溶液和0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 μg/ml的系列木犀草苷對照品溶液，4℃貯藏，備用。

2.3.2內標溶液的制備精密稱取槲皮苷對照品10.01 mg，置于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度為100 μg/ml的內標貯備液。吸取1 ml內標貯備液置于100 ml量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為1 μg/ml內標溶液，4℃貯藏，備用。

2.3.3質控樣品的制備分別吸取不同質量濃度的對照品溶液10 μl，置于1.5 ml塑料離心管中，加入空白血漿100 μl，渦旋30 s，制備得3、50、400 ng/ml的木犀草素和12、250、1 000 ng/ml的木犀草苷質控樣品（即低、中、高濃度的質控樣品）。

2.4血漿處理方法

取大鼠血漿100 μl，加入20 μl內標溶液，再加入200 μl冰乙腈沉淀并渦旋2 min，將樣品于4℃下，以離心半徑為6 cm、13 000 r/min離心10 min，取200 μl上清于進樣瓶中，進樣量為2 μl。

2.5系統適用性與專屬性考查

分別取空白血漿、空白血漿+木犀草素和木犀草苷對照品+內標、給藥1 h后大鼠血漿樣品+內標，按“2.4”項下方法處理后，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，血漿內源性成分不干擾木犀草素和木犀草苷的測定，木犀草素的保留時間為1.61 min，木犀草苷的保留時間為1.04 min，內標的保留時間為1.63 min，3種物質在各自的離子通道中沒有干擾。

圖1　UPLC圖A.空白血漿；B.空白血漿+木犀草素和木犀草苷對照品+內標；C.給藥1 h后大鼠血漿樣品+內標；1.木犀草苷；2.槲皮苷；3.木犀草素；4.總離子流圖Fig 1　UPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+reference substances of luteolin and cynaroside+internal standard；C.plasma sample collected at 1 h after administration+internal standard；1.cynaroside；2.quercetin；3.luteolin；4.TIC

2.6標準曲線的制備

按“2.3.1”項下方法制備對照品系列溶液，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。以木犀草素和木犀草苷的質量濃度（x，ng/ml）為橫坐標，兩者和內標峰面積的比值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得到木犀草素、木犀草苷的回歸方程分別為y=6.545 93e-5x+0.001 331 02（r= 0.998 2）、y=3.086 54e-5x-0.004 089 43（r=0.993 5）。結果表明，木犀草素和木犀草苷質量濃度分別在2.5～500、10～2 500 ng/ml范圍內和內標峰面積比值呈良好線性關系，定量下限分別為1、2.5 ng/ml（RSD分別為5.95%、7.43%）。

2.7精密度試驗

按“2.3.3”項下方法制備低、中、高濃度的木犀草素和木犀草苷質控樣品各6份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下條件分別在同日內和連續3 d內進樣測定。木犀草素和木犀草苷的日內、日間精密度試驗結果見表1。

表1　精密度試驗結果（±s，n=3）Tab 1　Results of precision test（±s，n=3）

表1　精密度試驗結果（±s，n=3）Tab 1　Results of precision test（±s，n=3）

成分　加入量，ng/ml木犀草素3木犀草苷50 400 12 250 2 000日內精密度測得量，ng/ml 3.12±0.28 48.04±3.47 382.15±30.84 12.64±1.04 247.21±15.69 1 937.87±108.38 RSD，% 8.84 7.23 8.07 8.20 6.35 5.59日間精密度測得量，ng/ml 3.12±0.17 47.66±3.75 384.23±26.03 12.84±1.03 250.63±5.97 1 951.20±93.35 RSD，% 5.43 7.87 6.78 8.05 2.38 4.78

2.8方法回收率試驗

按“2.3.3”項下方法制備低、中、高濃度的木犀草素和木犀草苷質控樣品各6份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，以測得值與加入量的比值計算方法回收率。結果，木犀草素和木犀草苷低、中、高濃度血漿樣品的方法回收率分別為104%、95.3%、96.06%、106.98%、100.25%、97.56%。方法回收率試驗結果見表2。

表2　方法回收率試驗、提取回收率試驗和基質效應結果（±s，n=6）Tab 2　Results of recovery，extraction recovery and matrix effect test（±s，n=6）

表2　方法回收率試驗、提取回收率試驗和基質效應結果（±s，n=6）Tab 2　Results of recovery，extraction recovery and matrix effect test（±s，n=6）

成分木犀草素木犀草苷加入量，ng/ml 3 50 400 12 250 2 000測得量，ng/ml 3.12±0.16 49.51±3.69 388.19±14.45 12.74±1.01 248.92±8.84 1 961.20±99.52方法回收率，% 103.95±5.47 99.02±7.38 97.05±3.61 106.16±8.39 99.57±3.53 98.06±4.98 RSD，% 5.26 7.46 3.72 7.90 3.55 5.07測得量，ng/ml 2.49±0.14 37.31±1.94 295.83±10.50 10.11±8.29 207.47±11.30 1 577.31±69.41提取回收率，% 83.20±4.52 74.62±3.87 73.96±2.63 84.27±6.91 82.99±4.52 78.87±3.47 RSD，% 5.43 5.19 3.55 8.20 5.45 4.40基質效應，% 99.10±3.58 96.83±5.15 95.10±7.58 98.22±7.01 103.40±8.74 99.10±6.01

2.9提取回收率和基質效應

按“2.3.3”項下方法制備低、中、高濃度的木犀草素和木犀草苷質控樣品各6份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下條件下進樣測定，記錄木犀草素和木犀草苷的峰面積A1。另取血漿樣品100 μl，加入200 μl冰乙腈（含有10%的甲醇）沉淀并渦旋2 min，將樣品在4℃下以離心半徑為6 cm、13 000 r/min離心10 min；取上清液加入相應濃度的木犀草素和木犀草苷對照品溶液和內標溶液，配成低、中、高濃度的木犀草素和木犀草苷對照樣品，不經任何處理，取2 μl進樣檢測，記錄標準品的峰面積A2。計算血漿中木犀草素和木犀草苷的峰面積和不經任何處理的木犀草素和木犀草苷峰面積的比值，即得提取回收率，結果見表2。取不同濃度的木犀草素和木犀草苷對照品溶液，加入內標溶液，配成低、中、高濃度的木犀草素和木犀草苷對照品溶液（平行6個樣品），取2 μl進樣檢測，記錄對照品的峰面積A3，將已處理空白血漿配制的對照樣品峰面積A2與相應濃度的對照品直接進樣的峰面積A3比較，計算基質效應，結果見表2。由表2可知，基質基本不干擾檢測，基質效應在85%～115%之間，均符合生物樣品分析方法要求。

2.10穩定性試驗

按“2.3.3”項下方法制備低、中、高濃度的木犀草素和木犀草苷質控樣品各6份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下條件分別于0、2、4、8、12、24 h取樣測定，結果各濃度樣品的RSD均小于5.0%，表明樣品中木犀草素和木犀草苷在24 h內穩定。同法將3種濃度的質控樣品置于-80℃冰箱中保存，分別于第1、5、15、30 d解凍，依法測定；經過3次反復凍融，每次間隔12 h，依法測定。結果各濃度樣品的RSD均小于5.0%，表明樣品在-80℃條件保存30 d內及反復凍融條件下穩定性較好。

2.11藥動學研究

取SD大鼠16只隨機分為木犀草素組（1.34 mg/kg）和木犀草苷組（0.64 mg/kg），單次舌下iv給藥。于給藥前和給藥后0、15、30 min及1、2、3、4、6、8 h經大鼠尾靜脈取血0.5 ml，置于含有肝素的EP管中，以離心半徑為6 cm、3 000 r/min離心10 min，取血漿于-20℃冷凍保存。為保證大鼠血量充足，2 h后大鼠可以自由飲水。血漿按“2.4”項下方法處理后，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，木犀草素和木犀草苷在大鼠體內的濃度-藥時曲線見圖2。血藥濃度數據采用DAS 3.0軟件進行分析。結果顯示木犀草素和木犀草苷在大鼠體內的消除過程屬于一級消除，AUC0-6 h與劑量呈良好的線性關系，符合二室模型，詳見表3。

圖2　血藥濃度-時間曲線Fig 2　Plasma concentration-time curves

表3　藥動學參數Tab 3　Pharmacokinetic parameters

3　討論

本實驗中木犀草素和木犀草苷血藥濃度檢測采用的是UPLC-三重四極桿質譜聯用儀，具有檢測靈敏度高、檢測時間短等優點，通常檢測一個樣本僅需要3 min，適合于高通量的藥動學實驗。文中涉及的方法學考察參考美國食品與藥品監督管理局（FDA）［12］的方法和歐洲藥品管理局（EMA）2012年2月1日開始實施的《生物樣品分析方法驗證指南》。本實驗采用了沉淀蛋白的方法，先后用高氯酸、甲醇和乙腈沉淀蛋白，結果高氯酸酸性較強、對質譜影響較大［13-14］，甲醇沉淀在質譜中容易出現溶劑峰而影響出峰時間，而乙腈沉淀則不會出現上述問題［15-16］。為了保證大鼠血流量充足，2 h后大鼠可以進行自由飲水，大大減少大鼠采血的壓力，保證了每個采血時間點的準確性。流動相選擇方面先后考察了甲醇和乙腈作為有機相，水、0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、0.3%甲酸水以及0.5%的甲酸水作為水相，結果發現乙腈和0.1%甲酸水配制的流動相具有較好的分離度和響應值。選擇槲皮苷作為內標是因為槲皮苷的結構與木犀草素和木犀草苷相似并且在樣品處理過程中具有良好的回收率。檢測方面，槲皮苷、木犀草素、木犀草苷都是負離子檢測模式并且兩兩之間具有較好的分離度。

藥動學參數顯示，木犀草素和木犀草苷在大鼠體內的分布和消除半衰期較長，在體內的平均滯留時間較短；兩者在大鼠體內呈現特征性的二室動力學特征；兩者在大鼠體內的平均MRT分別為1.27、1.36 h，提示其在大鼠體內的滯留時間較短。木犀草素和木犀草苷均表現出了非線性藥動學特征。

綜上所述，該方法可快速、穩定地檢測大鼠血漿中木犀草素和木犀草苷的濃度，為其臨床合理應用提供依據。

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（編輯：劉明偉）

Pharmacokinetic Study on Luteolin and Cynaroside in Rats

ZOU Xiaohua1，WANG Shuanghu2，ZHOU Yunfang2
（1.Dept.of Pharmacy，Lishui Second People's Hospital，Zhejiang Lishui 323000，China；2.Laboratory of Clinical Pharmacy，Lishui People's Hospital，Zhejiang Lishui 323000，China）

OBJECTIVE：To establish the method for pharmacokinetic study of luteolin and cynaroside in rats and to determine pharmacokinetic parameters.METHODS：16 SD rats were randomly divided into luteolin group（sublingual iv，1.34 mg/kg）and cynaroside group（sublingual iv，0.64 mg/kg）.0.5 ml blood were collected before administration and 0，15，30 min and 1，2，3，4，6，8，12，24，48 h after administration respectively to prepare plasma.UPLC-TQ-MS was adopted to determine plasma concentration，and pharmacokinetic parameters were calculated.A CORTECSTM UPLC?C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）column was used with mobile phase consisted of acetonitrile-water（containing 0.1%formic acid）at a flow rate of 0.4 ml/min，the column temperature was set at 40℃，and quercetin was used as internal standard.RESULTS：The linear range of luteolin and cynaroside were 2.5-500 ng/ml（r=0.998 2）and 10-2 500 ng/ml（r=0.993 5）.The lowest quantitation limits were 1 and 2.5 ng/ml，and extraction were 70.75%-87.72%and 75.40%-91.18%（n=6）；RSD of inter-day and intra-day were all lower than 10%（n=3）.Pharmacokinetic parameters as t1/2were（1.88±0.32）and（1.57±0.08）h；CL were（0.77±0.18）and（0.06±0.01）L/（h·kg）；AUC0-6 hwere （189.60±40.04）and（1 093.14±187.36）ng·h/ml；AUC0-∞were（195.18±38.37）and（1 097.11±188.07）ng·h/ml.CONCLUSIONS：The method can be used for pharmacokinetic study of luteolin and cynaroside in rats，and the pharmacokinetics of them in rats are in line with two-compartment model.

Luteolin；Cynaroside；Plasma concentration；Pharmacokinetics；UPLC-ESI-MS/MS

R969.1

A

1001-0408（2016）22-3058-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.11

浙江省中西醫結合學會臨床藥學科研專項資金（No.2014LYK007）

＊副主任藥師。研究方向：醫院藥學。電話：0578-2317726。E-mail：zouxiaohua2015@126.com

#主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥理學。電話：0578-2780158。E-mail：zyf2808@126.com

2015-09-10

2016-06-16）