辮狀螺旋碳納米纖維類酶活性研究及其對三聚氰胺的檢測

張鵬程，李亞紅，鄭 嬌，陳繼云，陳丹丹，權 英，崔榮靜

(常熟理工學院化學與材料工程學院，江蘇常熟 215500)

三聚氰胺(Melamine)簡稱三胺，學名三氨三嗪，它是一種含氮量較高的重要有機化工原料[1]。三聚氰胺本身毒性較低，但是三聚氰胺在生物體腎臟細胞中會形成不溶于水的大分子復合物沉積下來，長期攝入會形成結石，最終導致腎衰竭[2,3]。目前食品和飼料粗蛋白含量通常采用“凱氏定氮法”來測定[4]，因為三聚氰胺的含氮量高達66.6%，而蛋白質中的含氮量只有16%左右[5]，向產品中加入三聚氰胺可以使檢測出的蛋白質含量虛高。目前檢測三聚氰胺的方法有很多種，傳統檢測方法有苦味酸法、升華法以及電位滴定法[6]，上述三種方法準確度高，但這些方法都達不到國家對食品中三聚氰胺檢測的要求[7]。近些年來發展起來的新檢測方法有高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用法、液相色譜-質譜(LC-MS)聯用法等[8]，上述的檢測方法都有各自的優點，但也存在諸多不足之處，不利于推廣使用。

辮狀螺旋碳納米纖維(Plait-like Carbon Nanocoils，CNCs)是一維納米碳結構的一種特殊形態，它是由碳納米纖維構成的雙螺旋結構。CNCs具有優良的導電性能、較強的催化性能及磁性[9,10]。本文通過合成CNCs并探究其類酶活性，發現該納米材料具有類似辣根過氧化物酶的催化活性，可以催化TMB與H2O2反應，產生藍色產物。同時，三聚氰胺可以與H2O2反應生成一種加成化合物[11]，從而消耗體系的H2O2?；谝陨涎芯?，建立了一種新的檢測三聚氰胺的方法，該方法靈敏度高、操作簡易。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；KKQ-50E型超聲波清洗儀(昆山禾創超聲儀器有限公司)；EL204型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；S-4800掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)；JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡(日本，電子株式會社)。

三聚氰胺(國藥集團化學試劑有限公司)，3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB,上海源葉生物科技有限公司)，聚二丙烯基二甲基氯化銨(PDDA,Sigma公司)，其他試劑為國產分析純。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1CNCs的合成根據文獻方法[12]，通過溶膠-凝膠方法制備NiO納米粒子。稱取20 mg的NiO納米粒子平均分散放入瓷盅后，置入石英玻璃管中，然后在通氫氣的環境下425 ℃反應1 h，然后在乙炔氛圍中425 ℃反應0.5 h，即可獲得產物CNCs。

1.2.2樣品使用前的處理稱取50 mg螺旋碳納米管與10 mL的PDDA(1∶100)及NaCl(0.5 mg/mL)的混合溶液混合，超聲5 min后，用水超聲洗滌5次，將產物配成5 mL溶液，取出2 mL烘干，得其濃度為2.70 mg/mL，剩下的溶液待用。

1.2.3檢測方法的建立依次向離心管中加入一定量的三聚氰胺溶液以及H2O2溶液，待反應完全后再依次加入適量的0.2 mol/L乙酸鹽緩沖溶液(pH=4.0)、CNCs以及TMB溶液，總體積為3.0 mL，使CNCs、TMB濃度分別為25 μg/mL、200 μmol/L，三聚氰胺的濃度分別為0～70 μmol/L，將混合液放在70 ℃的水浴中反應10 min后冰水浴5 min使反應停止，然后置于TU-1901紫外分光光度計中掃描出400～800 nm的紫外圖譜。

1.2.4實際樣品前處理實際樣品按通用方法進行預處理：稱取市售品牌奶粉1.0 g，加入6.5 mL 1% 三氯乙酸溶液和2.2 mL色譜純乙腈，蝸旋振蕩3.0 min，超聲5 min，1 3000 r/min離心10 min，取上清用0.45 μmol/L濾膜，以1%三氯乙酸稀釋至8 mL，待用。

2 結果與討論

2.1 辮狀螺旋碳納米纖維的表征

圖1A為辮狀螺旋碳納米纖維的掃描電子顯微鏡(SEM)的形貌圖，圖1B為CNCs的透射電子顯微鏡(TEM)圖。從圖中可以看出制備好的CNCs大部分都具有辮狀結構，分別由兩個對稱的螺旋結構的碳納米纖維組成，每根螺旋碳納米纖維的直徑大概在70～80 nm之間，其排列規則且分布均勻。

2.2 辮狀螺旋碳納米纖維類酶活性的研究

2.2.1pH值對CNCs催化活性的影響圖2(A)為吸光度與pH值的關系曲線，可見當pH值為4.0時催化活性最強，當反應體系為中性或堿性時，催化劑基本不能催化H2O2氧化TMB并產生顏色反應。原因在于，酸性條件下CNCs表現出的是過氧化物酶的催化活性，即CNCs首先催化H2O2產生羥基自由基，同時生成CNCs-自由基復合物，后者與底物 TMB產生顏色反應；在較中性或堿性條件下，CNCs呈現出的是過氧化氫酶的催化活性，即催化H2O2分解產生氧氣和水[13]。

2.2.2溫度對CNCs催化活性的影響圖2(B)為吸光度與溫度的關系曲線，當T=70 ℃時，CNCs催化活性最強，故以下實驗溫度選定為70 ℃。另外，從圖中也可以看出CNCs的溫度適用范圍較廣，彌補了HRP酶在溫度高于40 ℃時失去催化活性的不足[14]。

2.2.3CNCs濃度對催化活性的影響圖3(A)為吸光度與CNCs濃度的關系曲線，當反應溶液中沒有CNCs時，吸光度只有0.1，隨著CNCs濃度的增大，吸光度增強，當濃度增大25 μg/mL時，吸光度達到最大，因此以下實驗CNCs濃度為25 μg/mL。此外，從上圖中可以看出，CNCs具有生物酶微量高效的特點。

2.2.4以H2O2為底物時CNCs的表觀Km值圖3(B)為吸光度與H2O2濃度的關系曲線，從圖3(B)可知在一定范圍內，體系的反應速率隨H2O2濃度的增大而增大，最后趨于平緩，其變化規律符合Michaelis-Menten動力學理論。由圖3(B) 可知，體系的反應速率與H2O2濃度在一定范圍內呈明顯的正相關關系。H2O2的使用濃度過高、過低都會影響檢測，為了能準確的檢測出三聚氰胺，我們將H2O2的濃度確定為100 μmol/L。圖4(A)為吸光度與較低濃度的H2O2的關系曲線，圖4(B)為吸光度的倒數與H2O2濃度的倒數的關系曲線，根據米氏常數的求值公式:1/Acat=(1/Amax)+[Km/(Amax·C)]，CNCs對H2O2的米氏常數Km=0.126 mmol/L。該米氏常數較小，說明H2O2對CNCs親和力較強。

2.2.5以TMB為底物時CNCs的表觀Km值圖5(A)為吸光度與TMB濃度的關系曲線，從圖5(A)可知在一定范圍內，體系的反應速率隨TMB濃度的增大而增大，最后趨于平緩。圖5(B)為吸光度的倒數與TMB濃度的倒數的關系曲線，可得CNCs對TMB的米氏常數Km=0.547 mmol/L。

2.2.6米氏常數對比將CNCs對TMB、H2O2的米氏常數與辣根過氧化物酶(HRP)對其的米氏常數作了對比，如表1中的總結，CNCs對于底物H2O2的Km值比HRP小，說明CNCs對底物H2O2的親和力高于HRP。但對于另一底物TMB而言，CNCs的Km值比HRP大，說明CNCs對底物TMB的親和力低于HRP。造成這一現象的原因可能與CNCs本身有關，也可能與我們采用了PDDA處理CNCs有關。采用PDDA處理可以使CNCs表面帶上正電荷，而CNCs表面的正電荷有助于吸附更多的羥基自由基[15]，從而提高對H2O2的親和力；而TMB是一種多氨基化合物，其在酸性緩沖體系中質子化從而帶正電荷[16]，由于表面和底物TMB之間存在排斥力，所以降低了對TMB的親和力。CNCs對底物H2O2親和力的提高，說明只需要較低濃度的H2O2就可以達到較好的催化效果，有利于三聚氰胺的檢測。

表1 表觀Km值比較

2.3 三聚氰胺的檢測

圖6是吸光度與三聚氰胺濃度的關系曲線，三聚氰胺濃度為5～70 μmol/L。通過圖5可以得出，三聚氰胺的檢出限為1.8 μmol/L，其線性范圍為5～70 μmol/L，低于我國制定的三聚氰胺乳與乳制品臨時管理值(嬰幼兒配方乳粉三聚氰胺限量值為1 mg/kg，液態奶(包括原料乳)、奶粉、其配方乳粉以及含乳15%上其食品中三聚氰胺限量值為2.5 mg/kg)。

2.4 實際樣品檢測

在牛奶樣品中加入不同濃度的三聚氰胺，測其回收率。按照1.2.4進行樣品前處理。結果如表2所示，回收率在92%～104%之間。另外我們還測試了氨基酸分子對檢測結果的影響，實驗結果表明氨基酸分子的存在不會干擾牛奶中三聚氰胺的測定。本方法操作簡便、分析時間短，不需要精密復雜的儀器，適用于食品中三聚氰胺的檢測。

表2 標準加入法檢測牛奶中的三聚氰胺

3 結論

本文合成了一種具有辮狀螺旋結構的碳納米纖維(CNCs)，發現該碳納米纖維具有高效的類似辣根過氧化物酶(HRP)的催化活性，同時在較大的酸堿范圍以及溫度范圍內都保持較高的催化活性，有著HRP不可比擬的優勢。同時，根據三聚氰胺可以與H2O2反應生成一種穩定的加成化合物，建立了一種新的檢測三聚氰胺的方法，其檢出限達到了1.8 μmol/L。該方法簡單、快速、靈敏度高，有希望應用于三聚氰胺的實際檢測，在食品安全檢測方面有著巨大的應用價值。