直接競爭酶聯免疫吸附法測定飼料中沙丁胺醇

孫孔飛，曾俊源，劉曙照

(揚州大學環境科學與工程學院，江蘇揚州 225127)

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)化學名稱為1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，它是人工合成的水楊醇類選擇性β2腎上腺素受體激動劑[1]，臨床上用于擴張氣管，治療哮喘。沙丁胺醇在劑量高時可促進動物體內脂肪轉化、提高瘦肉率，但易積聚于動物體的內臟、血液和肌肉等組織中。食用含過量沙丁胺醇的動物源食品，會引發人體多種不良反應，危及人的健康安全[2]，因此中國已明令禁止該類化合物用于食品動物生產。

目前，沙丁胺醇的殘留檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3 - 5]、氣-質聯用法(GC/MS)[6 - 8]、液-質聯用法(LC/MS)[9 - 11]、電化學分析法[12]和免疫分析法。免疫分析法包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)[13,14]、放射免疫分析[15]、金標免疫層析[16]、熒光偏振免疫分析[17]和化學發光免疫分析[18]等。HPLC、GC/MS和LC/MS法對操作技術和儀器設備的要求較高，樣品前處理步驟繁瑣費時，難以實現大批量樣品的現場快速檢測[19]。ELISA法簡便高效、易普及，可用于大量樣品的快速篩查。ELISA法包括間接競爭ELISA法[13]和直接競爭ELISA法[14]。直接競爭ELISA法比間接競爭ELISA法操作時間減少約一半，在實際運用中具有明顯優勢。目前沙丁胺醇半抗原的合成多采用酸酐與沙丁胺醇的醇羥基或酚羥基反應形成酯鍵衍生出含羧基末端的連接臂[13,14]，因此連接臂難以定位，半抗原可能存在不同異構體；半抗原中的酯鍵不夠穩定[20]，特別是在免疫動物制備抗體的過程中，易被動物體內的酯酶降解，難以得到單一高效的抗沙丁胺醇抗體。

本實驗室采用在沙丁胺醇的酚羥基上通過醚鍵衍生間隔臂，得到的半抗原(圖1)結構單一，穩定性好；采用活性酯法將牛血清白蛋白(BSA)和辣根過氧化物酶(HRP)分別與沙丁胺醇半抗原共價偶聯合成免疫原和酶標半抗原[21]。本研究利用所述免疫原免疫新西蘭大白兔獲得的對沙丁胺醇有高親和力的多克隆抗體和酶標半抗原，建立包被抗體直接競爭ELISA法，用于測定飼料中的沙丁胺醇，同時采用高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)對沙丁胺醇進行同步分析驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Model 680酶標儀(美國,BIO-RAD公司)；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；移液器：5～50、20～200和100～1 000 μL單道手動可調，50～300 μL 8道可調移液器(Dragon Lab)；8孔酶標條(江蘇海門愛苯德實驗器材有限公司)；XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海華線醫用核子儀器有限公司)；Biofuge primo R臺式高速冷凍離心機(德國,Heraeus公司)；高效液相色譜儀(美國,Waters公司)。

沙丁胺醇標樣(鹽城制藥廠)；抗沙丁胺醇抗體(本實驗室制備，當抗原濃度為0.15 μg/mL時，抗體的ELISA中點效價為0.3 μg/mL)、HRP標記沙丁胺醇半抗原(本實驗制備)；包被液：0.02 mol/L、pH=7.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)；反應液：0.02 mol/L、pH=6.8、含0.05 mol/L NaCl的PBS；洗滌液：滅菌蒸餾水；封閉液(本實驗室自制)；顯色液：0.2 mmol過氧化脲溶于1 L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(8.4 g Na2HPO4、5.2 g檸檬酸溶解于無菌蒸餾水中并且定容至1 L作A液，0.1 g TMB溶于10 mL DMF作B液，用前按VA∶VB=100∶1混勻；終止液：2 mol/L H2SO4；乙腈、甲醇為色譜純；乙酸溶液：10 mL冰乙酸用無菌蒸餾水稀釋至500 mL；淋洗液：移取9 mL濃HCl于1 000 mL滅菌蒸餾水中搖勻；洗脫液：10 mL 25%氨水用甲醇定容至100 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1直接競爭ELISA法條件優化用0.02 mol/L pH=6.8的PBS將抗沙丁胺醇多克隆抗體分別稀釋至3.0、4.0、5.0和6.0 mg/L包被酶標板不同列，酶標半抗原分別稀釋2 500、5 000、7 500、10 000倍后加入酶標板不同行，直接ELISA法測定。篩選的標準為抗體和酶標半抗原用量少、酶促顯色反應后OD450≈1.0的組合作為進一步建立直接競爭ELISA法的包被抗體-酶標半抗原工作濃度。

在上述選定的工作濃度下，分別用0.02 mol/L pH值為5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0的PBS作為抗體的包被介質，用pH=6.8的PBS作為反應介質稀釋酶標半抗原，直接ELISA法測定，根據最終酶促顯色反應后OD450值最大確定抗體包被介質的最適pH。

在抗體包被介質最適pH和上述選定的工作濃度下，分別用0.02 mol/L pH為5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0的PBS作為反應介質稀釋酶標半抗原，直接ELISA法測定，根據酶促顯色反應后OD450最大值確定反應介質最適pH。

在包被介質最適pH和反應介質最適pH及選定工作濃度下，分別用含NaCl濃度為0、0.05、0.15、0.25、0.50、1.0 mol/L 的PBS稀釋酶標半抗原，直接ELISA法測定，選擇酶促反應后OD450達最大值時的PBS作為直接競爭ELISA最適反應介質。在此基礎上進一步篩選包被抗體濃度和酶標半抗原稀釋度，作為抗體-酶標半抗原最適工作濃度組合。

1.2.2直接競爭ELISA法的建立將沙丁胺醇標樣5.0 mg溶于5 mL甲醇作為儲備液，用最適反應介質將標樣梯度稀釋成濃度為1.0、0.1、0.01、0.001和0.0001 mg/L的系列標準溶液。在最適宜ELISA條件下，測定不同質量濃度沙丁胺醇對抗體-酶標半抗原結合反應的抑制率I[19,21,22]，其計算公式為:I%=[(OD對照-OD沙丁胺醇)/(OD對照-OD空白] ×100%，繪制抑制率I對沙丁胺醇濃度對數(lgc)的標準曲線并建立回歸方程，確定沙丁胺醇對抗體-酶標半抗原結合反應的抑制中濃度(Ic50)和Ic10，以Ic10為最低定量檢測濃度。

1.2.3樣品的提取與凈化提?。簩⒇i飼料樣品粉碎，準確稱取2.0±0.001 g樣品于50 mL具塞離心管中，加入16 mL水和2 mL 1 mol/L HCl，振蕩混勻。超聲5 min，1 mol/L NaOH溶液調節pH至6.8，加水定容至20 mL，混勻，6 000 r/min室溫離心5 min，取上清液直接用于ELISA法測定。凈化：將混合型陽離子交換小柱固定，依次用5 mL甲醇和5 mL無菌水活化、平衡。移取5 mL上清液于20 mL尖底蒸餾瓶中，55 ℃水浴條件下減壓蒸餾濃縮至近干，加入5 mL 2%冰乙酸溶液，渦旋振蕩至全部溶解后，加入小柱，控制流速不超過1 mL/min，先用5 mL淋洗液淋洗，再用5 mL甲醇淋洗，最后用5 mL洗脫液洗脫，洗脫液于55 ℃水浴條件下減壓濃縮至近干，色譜流動相溶解定容至250 μL，經0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測定。

1.2.4HPLC條件色譜柱為C18色譜柱；流動相為甲酸銨溶液∶乙腈=8∶2(V/V)；流速0.8 mL/min；檢測波長275 nm；進樣體積20 μL。

1.2.5標準加入回收試驗直接競爭ELISA工作曲線的建立：用未經凈化處理的空白樣品提取液將沙丁胺醇標樣稀釋成質量濃度分別為1、0.2、0.04、0.008、0.0016和0.00032 mg/L的系列標準工作溶液，然后按1.2.2步驟建立ELISA工作曲線。在豬飼料中分別按10、50和250 μg/kg 添加沙丁胺醇，混勻后按1.2.3方法提取，提取離心后的上清液不經凈化，直接采用ELISA法檢測各樣品提取液對抗體-酶標半抗原結合反應的抑制率，根據工作曲線計算添加回收率。將添加250 μg/kg的樣品提取液經混合型陽離子交換柱凈化，用于HPLC法測定，計算回收率。

2 結果與討論

2.1 直接競爭ELISA法條件的優化

2.1.1包被抗體-酶標半抗原最適濃度通過兩次方陣實驗法篩選，結果見圖2。當包被抗體濃度為4.0 mg/L、酶標半抗原稀釋5 000倍時，二者用量少并且最終酶促顯色反應的OD450≈1.0，確定為直接競爭ELISA法的包被抗體和酶標半抗原最適工作濃度。

2.1.2包被介質pH的選擇用0.02 mol/L不同pH的PBS將抗體稀釋至工作濃度包被酶標板，酶標半抗原亦稀釋至工作濃度，直接ELISA法測定的OD450見圖3。當包被介質的pH為7.6時，OD450最大，說明此條件下最適合抗體包被，因此選擇0.02 mol/L pH=7.6的PBS為抗體的包被介質。

2.1.3反應介質pH的選擇用0.02 mol/L pH=7.6的PBS將抗體稀釋至工作濃度包被酶標板，用不同pH的0.02 mol/L PBS將酶標半抗原稀釋至工作濃度，直接ELISA法檢測，最終酶促顯色反應OD450見圖4。當pH為6.8時，OD450最大，表明抗體-酶標半抗原反應活性最強，故選擇pH=6.8。

2.1.4反應介質鹽濃度的選擇用0.02 mol/L pH=7.6的PBS將抗體稀釋至工作濃度包被酶標板，用鹽濃度為0、0.05、0.15、0.25、0.5和1 mol/L的0.02 mol/L pH=6.8的PBS將酶標半抗原稀釋至工作濃度，直接競爭ELISA法檢測，最終酶促顯色反應OD450見圖5。當鹽濃度為0.05 mol/L時，抗體與酶標半抗原反應活性最高，故選擇pH=6.8、鹽濃度為0.05 mol/L的PBS作為直接競爭ELISA法的最適反應介質。

2.2 沙丁胺醇直接競爭ELISA法標準曲線與回歸分析

以沙丁胺醇濃度對數(lgc)為橫坐標，沙丁胺醇對抗體-酶標半抗原結合反應的抑制率(I)為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖6。沙丁胺醇在0.1～1.0×103μg/L濃度范圍內與抑制率呈線性相關，其回歸方程為:I=23.86lgc+94.20(r=0.9865)，沙丁胺醇對抗體-酶標半抗原反應的抑制中濃度Ic50=14 μg/L，相對標準偏差(RSD，n=5)為8.6%，Ic10=0.29 μg/L。

2.3 豬飼料中沙丁胺醇的測定

2.3.1沙丁胺醇測定的直接競爭ELISA工作曲線及回歸分析用空白樣品提取液作溶劑配制沙丁胺醇系列工作溶液，在 0.32～1.0×103μg/L濃度范圍內，沙丁胺醇濃度對數(lgc)與沙丁胺醇對抗體-酶標半抗原結合反應的抑制率(I)線性相關。經回歸分析得回歸方程:I=25.629lgc+96.446(r=0.9901)，Ic50=15.4 μg/kg，5次重復測定的RSD為8.8%，Ic10=0.423 μg/kg。

2.3.2ELISA法測定沙丁胺醇殘留的回收率在10、50和250 μg/kg添加水平下，直接競爭ELISA法測定的回收率分別為85%～108%、81%～92%、81%～102%，RSD(n=5)分別為9.1%、5.6%、8.9%。結果見表1。

表1 豬飼料中沙丁胺醇標準添加回收率

2.4 豬飼料中沙丁胺醇殘留的HPLC測定結果

按1.2.3進行樣品的提取與凈化，按1.2.4 HPLC條件檢測，結果表明。在250 μg/kg的添加水平下，HPLC-UV法測定的平均回收率為89%(n=3)，與直接競爭ELISA法測定結果接近。

3 結論

本實驗利用對沙丁胺醇具有高識別能力的多克隆抗體，建立了一種用于快速檢測沙丁胺醇的直接競爭ELISA法。ELISA法的樣品前處理簡單、耗時短，檢測費用低，可用于大批量樣品的現場快速篩查。與現有間接競爭ELISA法相比，直接競爭ELISA法省去了與二抗反應的步驟，方法更加簡便快捷。而與ELISA法相比，HPLC法對樣品前處理的要求高，需采用層析凈化步驟，花費時間較多。