水氮添加對古爾班通古特沙漠土壤細菌多樣性的影響

蘇延桂

(中國科學院干旱區生物地理與生物資源重點實驗室，中國科學院新疆生態與地理研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

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水氮添加對古爾班通古特沙漠土壤細菌多樣性的影響

蘇延桂

(中國科學院干旱區生物地理與生物資源重點實驗室，中國科學院新疆生態與地理研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

本研究以我國古爾班通古特沙漠東南緣原生梭梭生長區為研究區，通過模擬30%的年降雨量增加和5 gN m-2·yr-1的氮沉降，研究土壤微生物生物量和土壤細菌群落多樣性和結構對模擬降水增加和氮沉降的響應.研究結果表明，模擬降雨增加顯著提高了春季短生植物和春夏一年生植物生長旺季土壤微生物生物量碳和氮，模擬氮沉降對微生物生物量的影響非常微弱，與單獨模擬降水增加相比較，降水和氮沉降同時增加對微生物生物量并沒有顯著影響.模擬降水增加和氮沉降對細菌多樣性的影響因采樣時段而異.模擬降水增加在春季短生植物和春夏一年生植物生長旺季對細菌多樣性的影響強度高于冬季和早春融雪期，模擬氮沉降對細菌多樣性的影響在冬季更為顯著.微生物群落結構在不同采樣時段表現出明顯的不同，雖然模擬降水增加和氮沉降也影響微生物群落結構，但影響強度不如季節變化明顯.

PCR-DGGE; 氮沉降; 降雨增加; 微生物群落結構; 溫帶荒漠

土壤細菌是土壤微生物的重要組成部分，它們在土壤發生和發育過程中的重要作用不僅表現在對土壤微生物多樣性的維持和貢獻方面，更重要的是，細菌群落多樣性的變化對土壤主要生態過程的影響非常深刻[1-2].如異養細菌對土壤有機質的分解過程和特征的改變影響著土壤有機碳的儲量和穩定性特征[3]；一些具有異形胞細菌對土壤氮儲量和累積的貢獻[4-5].基于土壤細菌群落的重要生態功能，近年來對土壤細菌多樣性和物種組成的研究已在各類生態系統開展了大量的研究工作，尤其是利用分子生物學的手段從微觀尺度上揭示了不同生態系統群落結構特征[6-7].

現有的模型研究和實證調查均表明，我國北方生態系統正經歷著降水增加[8]和氮沉降加劇[9]的雙重環境影響，大量的野外模擬控制實驗多集中于地上部分對氣候變化的響應方式和強度[10-12].然而，土壤微生物作為對氣候變化響應較為敏感的一個類群，卻長期沒有得到應有的重視，與地上植物群落的研究相比，對地下微生物的響應研究相對匱乏[13-15].

古爾班通古特沙漠是我國最大的固定、半固定沙漠，對該區域年降雨量的模擬研究發現，到2030年，該沙漠年降雨增加量將是本世紀初年降雨量的30%[8]；對氮沉降的多年觀測研究也發現，由于近些年沙漠周邊綠洲的開發，大氣氮沉降量已達到3.6 gNm-2·yr-1[9].前期對古爾班通古特沙漠東南緣水氮添加引起的生態系統過程相關參數的調查研究表明，水分添加顯著提高了春季短命植物和春夏一年生草本生物量，而氮素添加對草本的影響相當有限，并且，在降雨增加的情況下，氮素添加的正效應才能得到顯現[16].同時對碳通量的觀測表明，水分增加對生態系統凈通量的影響依賴于年降雨量，在降雨量較高的年份，降雨的增加有利于生態系統碳儲量的增加，而在干旱年份，水分的增加卻刺激了生態系統的碳釋放[17].由于植物生物量的改變必然會引起土壤地下碳輸入量的改變，這可能會對細菌群落結構產生影響[18]；同時，考慮到細菌對水分變化的敏感性[3]，我們假設水分的增加可能會改變細菌群落結構.氮沉降使得土壤酸化已在很多生態系統中得到了證明[19]，而pH的改變被認為是影響土壤微生物群落結構最為關鍵的環境因素.我們假設，氮沉降對土壤微生物群落的影響可能會通過改變土壤pH而實現.

1　研究區概況

研究區位于古爾班通古特沙漠東南緣 (44°17′ N，87°56′ E，475 m a.s.l).該區氣候屬于大陸性干旱氣候，冬季嚴寒，夏季干熱，春秋溫涼，年平均降水量約為160 mm，其中60%的降雨分布在4～9月，冬季降雨可到30 cm，是該區域春季短命植物和春夏一年生植物種子萌發的主要水分來源.年平均氣溫約為6.6 ℃，年平均蒸發潛力約為1 000 mm.沙丘表面植被覆蓋度可達15%～50%, 主要灌木為白梭梭(Haloxylonpersicum)和梭梭(Haloxylonammodendron)，草本包括條葉庭薺(Alyssumlinifolium), 齒稃草(Schismusarabicus) , 飄帶萵苣(Lactucaundulate), 尖喙牻牛兒苗(Erodiumoxyrrhynchum), 卷果澀薺(Malcolmiaafricana), 絲葉芥(Leptaleumfilifolium), 漿果豬毛菜(Salsolafoliosa)，粗枝豬毛菜(Salsolasubcrassa) , 角果藜(Ceratocarpusarenarius) 和珍珠豬毛菜(Salsolapasserina)等.沙漠中土壤以固定、半固定的風沙土占絕對優勢, 固定風沙土主要分布于壟間低地及沙壟中下部, 半固定風沙土多分布于沙壟中部和中上部.

2　材料與方法

2.1實驗處理和土樣采集

長期樣地建立于2010年，實驗處理開始于2011年初.樣地建設包括增加降水和增加N素兩個處理，每個處理因素包括對照在內共三個水平，N素添加以硝酸銨為原料，三個水平為無添加，中水平N素添加(2.5 gNm-2·yr-1)和高水平N素添加(5 gNm-2·yr-1).于每年的4月中旬和7月中旬添加，以分別滿足春季短生植物和春夏一年生草本植物的需要.降水添加通過設置降水轉移裝置，將樣地外圍的自然降水匯集，通過滴灌的方式均勻添加至樣方內.降水添加的三個水平為：無添加、增加正常降水15%、增加正常降水30%.各因素水平按正交處理，形成9個處理水平.另外，在每一區組外，增加正常自然對照.總計包括10個處理水平.每個處理水平設置6個重復，共計60個試驗小區.區長10 m，寬10 m，小區面積為100 m2.小區間距10 m，區組間距10 m，四周留歩道各1 m.每組試驗區(不含保護行)長 120 m，寬30 m，占地0.36 hm2.小區布設按區組設置，選擇地勢平坦、一致的三個壟底，作為三個樣地，每個樣地中，按照地形因素，設置兩個區組，每個區組中隨機排列10個處理樣方.在本研究中，我們選擇對照，5 gNm-2·yr-1氮添加，30%降雨增加和5 gNm-2·yr-1氮添加與30%降雨同時添加四個處理.

根據研究區內明顯的季節特征，我們分別采集了代表冬季土壤凍結時段(11中旬)，早春融雪期間(3月22日)，春季短命植物生長旺季(5月20日)和春夏一年生植物生長旺季(8月15日)的土壤.土壤采集利用土鉆和環刀在梭梭灌木間采集0～5 cm土壤樣品，每個樣地采集3個重復，將三個樣品均勻混合，置于滅菌袋中帶回實驗室.在采集過程中，對于不同的樣地，土壤采集前先將酒精噴灑于采樣器表面，點火高溫處理后采集土壤.

在每次土壤采集中測定土壤含水量.在土壤凍結和早春融雪期，利用環刀采集0～5 cm土壤，帶回實驗室將土樣置于105 ℃烘箱中72 h，測定土壤質量含水量，結合土壤容重，計算土壤體積含水量；在春季短生植物生長旺季和春夏一年生植物生長旺季，利用時域反射儀測定土壤體積含水量(HH2-Delta T Device moisture meter, UK).土壤速效氮用0.2 mol·L-1KCl提取，采用流動分析儀測定(AA3, BRAN-LUEBBE Ltd.,Hamburg,Germany).土壤可溶性有機碳采用0.5 mol·L-1K2SO4提取后用碳、氮分析儀測定(multi N/C 3100,Jena,Germany).

2.2PCR-DGGE

土壤細菌總DNA提取采用改良CTAB法.以樣品基因組DNA為模板，采用細菌通用引物GC-338F(CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)擴增樣品16S rDNA高變區序列.其中，50 μL PCR擴增體系為：10×PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mM)3.2 μL；rTaq(5 U/μL)0.4 μL；GC-338F(20 mM)1 μL；518R(20 mM)1 μL；模板DNA 50 ng；補ddH2O至50 μL.PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，最終72℃延伸10 min.

DGGE電泳：PCR產物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收.PCR儀為Biometra公司生產的T-gradient，凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統.取10 μL PCR的產物進行變形梯度凝膠電泳(DGGE)分析.采用變性梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學變性劑為100%尿素7 mol·L-1和40% (v/v)的丙烯酰胺)在1×TAE緩沖液中150 V 60 ℃下電泳5小時.變形梯度凝膠電泳(DGGE)完畢后、采用銀染法染色.用滅菌的手術刀切下待回收DGGE條帶，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶.以2 μL回收產物為模板，338F/518R為引物進行PCR擴增.其中PCR擴增體系(50 μL)為：10× PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mM)3.2 μL；rTaq(5 U/μL)0.4 μL；338F(20 mM)1 μL；518R(20 mM)1 μL；模板DNA 1 μL；補ddH2O至50 μL.PCR擴增程序為在94℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，最后，72 ℃延伸10 min.將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到Pmd18-T載體上，并轉化至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，進行序列測定.

2.3數據處理

DGGE圖譜分析:采用QuantityOne-1-D軟件(Version 4.5)對DGGE條帶進行數字化分析.DGGE條帶中DNA含量與其灰度(范圍0-255，0為最小值，255為最大值)呈線性關系，因此，條帶灰度來代替每個DGGE條帶的擴增量(Ni)用于計算.每個條帶的相對含量fi為該條帶的灰度值與該列所有條帶灰度平均值的比值.根據fi值計算細菌群落結構多樣性指數(H′)和均勻度指數(J).利用R(http://www.r-project.org)中vegan包進行排序分析.模擬降水增加和氮沉降對土壤可溶性有機碳，速效氮和體積含水量的影響利用重復測定的方差分析(Repeated measures ANOVA).

3　結果與分析

3.1環境條件的季節變化特征

土壤體積含水量，土壤速效氮和土壤可溶性有機碳在四個采樣時間點差異顯著(表1-4，P<0.05).土壤體積含水量在早春融雪階段和冬季較高，而在植物生長旺季相對較低；土壤速效氮和土壤可溶性有機碳也表現出相似的變化規律.在春季短生植物生長旺季和春夏一年生植物生長旺季，模擬降雨增加顯著提高了土壤含水量和土壤可溶性有機碳；而在冬季和早春融雪期，模擬降雨增加對土壤體積含水量的影響非常有限.模擬氮沉降顯著提高了土壤速效氮，而對土壤體積含水量和可溶性有機碳含量的影響非常有限.

表1　模擬降水增加和氮沉降在冬季對土壤體積含水量、土壤速效氮和土壤可溶性碳

表2　模擬降水增加和氮沉降在早春融雪期對土壤體積含水量、土壤速效氮和土壤

表3　模擬降水增加和氮沉降在春季短生植物生長旺季對土壤體積含水量、土壤速效氮和

表4　模擬降水增加和氮沉降在春夏一年生植物生長旺季對土壤體積含水量、土壤速效氮和

3.2模擬降水增加和氮沉降對土壤微生物生物量碳、氮的影響

模擬降水增加顯著提高了春季短生植物生長旺季和一年生植物生長旺季土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮(圖1,P<0.05).氮添加對土壤微生物生物量碳和氮的影響非常小，在兩個觀測季節，氮添加微弱地提高了微生物生物量氮含量(圖1,P>0.05).與對照相比，模擬降雨增加和氮沉降對微生物生物量碳和微生物生物量氮均有顯著刺激作用(圖1,P<0.05)，然而與單獨模擬降雨增加的處理相比，并沒有顯著提高土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮(圖1,P>0.05).

在兩個觀測季節，土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮在春夏一年生植物生長季顯著高于春季短生植物生長季(圖1).土壤微生物生物量碳在對照區分別為0.23 gC·kg-1和0.46 gC·kg-1，微生物生物量氮分別為0.02 gN·kg-1和0.04 gN·kg-1.

圖1　模擬降雨增加和氮沉降對微生物生物量碳和氮的影響(不同小寫字母表示處理之間差異顯著)

3.3模擬降水增加和氮沉降對土壤細菌多樣性的影響

模擬降水增加普遍增加了土壤細菌香農-威爾多樣性指數和豐富度，相應的，降低了土壤細菌均勻度指數(圖2).模擬降水增加對細菌多樣性和豐富度的最強影響作用出現在春季短生植物生長季，分別提高了15.2%和56.5%，最低出現在冬季和早春融雪階段(圖2).與模擬降水不同，模擬氮沉降對土壤細菌多樣性和豐富度的影響程度在四個采樣時間點表現不同.模擬氮沉降對冬季細菌多樣性和豐富度的分別提高了7.3%和26.7%，而在春季短生植物生長旺季的影響作用最低，分別提高了2.4%和8.6% (圖2).模擬降水和氮沉降同時增加對土壤細菌多樣性和豐富度的最大影響出現在春季短生植物和春夏一年生植物生長旺季，對細菌多樣性和豐富度的提高分別為7.8%～9.8%和23.3%～34.8%(圖2).

在四個觀測時段，細菌多樣性和豐富度指數表現出明顯的季節變化(圖2).細菌香農-威爾多樣性指數在冬季最高(3.33)，而在春季短生植物生長季最低(2.98).相似的，細菌豐富度指數在冬季和春夏一年生植物生長旺季最高(30)，在春季短生植物生長旺季和早春融雪期最低(23).

PCA排序表明(圖3)，細菌群落組成在不同觀測時段差異明顯，其中，冬季細菌群落組成明顯不同與其它三個觀測時段.除春季短生植物生長旺季外，模擬降雨增加和氮沉降對細菌群落結構的改變非常有限.在早春短生植物生長旺季，模擬降水增加和氮沉降以及二者同時增加均明顯改變了土壤細菌群落結構.在檢測到的53種細菌中，其中22種屬于變形菌門，9種屬于放線菌門，7種屬于藍藻門，7種屬于酸桿菌門，4種屬于擬桿菌門.

4　結論與討論

干旱荒漠區土壤微生物生態功能的執行在很大程度上取決于水分和呼吸底物的有效性[20-21].本研究發現，模擬降水增加和氮沉降對土壤微生物生物量的影響不同.模擬降雨增加顯著提高了微生物生物量碳和氮，而模擬氮沉降對微生物生物量碳和微生物生物量氮的影響很有限，這說明，在干旱荒漠區，微生物的生長首先受限于水分.同時，研究結果表明，與單獨模擬降水增加相比較，模擬降水和氮沉降并沒有產生疊加效應，這說明，在降水增加的背景下，氮素可能不會對微生物生長產生抑制作用.

圖2　模擬降水增加和氮沉降在不同采樣時間點對土壤細菌香農-威爾多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數的影響

干旱、半干旱區水分增加對土壤微生物生物量的正效應在以往的很多研究中得到了證實[22-23]，其中，較多的研究通過模擬土壤干、濕交替，觀測微生物生物量的變化以闡述土壤水分的效應[24-26]，也有部分研究通過在室內控制土壤含水量，測定土壤微生物生物量的變化以闡明水分的效應[27].然而，很少有研究通過長期的野外控制實驗，闡明水分對土壤微生物生物量變化的作用[22].事實上，土壤水分的變化會引起其它土壤環境條件的改變，其中土壤可溶性氮和土壤溫度與水分的協同變化可能也對土壤微生物生物量的變化產生影響[28-29]，而這一點在室內模擬實驗中并不能得到很好的檢驗.同時，雖然野外的干、濕交替能在一定程度上反映水分改變所引起的土壤其他環境條件的變化，但是考慮到微生物相對較短的生活史和快速的適應特征，持續幾天到幾個月的野外模擬實驗可能并不能完全的反映微生物的這些變化.因此，長期的觀測實驗更能夠真實的反映干旱荒漠區微生物對降水增加的響應特征.

模擬降水增加對細菌群落多樣性和結構的影響在四個觀測時段表現不同.水分增加對細菌多樣性的影響在春季短生植物和春夏一年生植物生長旺季更加明顯，而在冬季和早春融雪階段的作用很微弱.土壤含水量在春季短生植物生長旺季和春夏一年生植物生長旺季相對其余兩個時段較低，同時，增加的降水顯著提高了草本層植物生物量，使得土壤可溶性碳的含量顯著增加.土壤水分和可溶性碳對干旱荒漠區土壤微生物多樣性和生長的影響在很多研究中得到證實[20-21]，我們的研究進一步說明，模擬降水的增加一方面通過水分有效性的提高，另一方面通過提高微生物呼吸底物的含量而對土壤細菌多樣性產生影響.而在冬季和早春融雪階段，模擬降雨增加對土壤微生物群落結構的改變非常有限，一個可能的原因是由于土壤含水量本身相對較高，可達到8.9%，對于適應于干旱環境的荒漠土壤微生物，模擬降雨增加的土壤含水量(1.5%)對土壤細菌多樣性的改變可能非常有限；另一個方面，由于冬季和早春融雪期較低的土壤溫度限制了土壤微生物的生長，使得水分增加對土壤細菌多樣性的影響程度很有限.

圖3　模擬降水增加和氮沉降對土壤細菌群落組成的PCA排序分析

與模擬降水增加的效應不同，模擬氮沉降對土壤細菌多樣性的影響在冬季和早春融雪階段更加明顯，而在春季短生植物和春夏一年生植物生長旺季的效應相對較弱.土壤速效氮增加對土壤微生物多樣性的影響多集中于討論氮添加對土壤pH的改變方面，在本研究區，模擬氮沉降對土壤pH的改變非常微小，并且現有的結論也表明，土壤微生物群落與pH并沒有直接的相關性[16].此外，以往對土壤氮循環的相關研究表明，土壤微生物在冬季固持氮以維持其基本的生理活性[30-32]，在本研究中，氮素添加顯著提高了冬季土壤速效氮含量，速效氮含量的提高可能有利于冬季土壤微生物多樣性的提高，同時，對土壤細菌生物量氮的研究將有利于我們認識氮沉降對微生物動態的效應.

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責任編輯：鄭敬剛

Effects of Water and Nitrogen Addition on Soil Bacteria Diversity in the Gurbantünggut Desert

SU Yan-gui

(KeyLaboratoryofBiogeographyandBioresourceinAridLand,XinjiangInstituteofEcologyandGeography,ChineseAcademyofSciences,Urumqi830011,China)

Selecting protogenesis sacsaoul growing region of the southeastern fringe of the Gurbantünggüt Desert as research area. Simulating a 30% increase in precipitationand 5 gN·m-2·yr-1nitrogen deposition ,the paper studies soil microbial biomass , bacterial community diversity and structure responses to the increase in annual precipitation and nitrogen deposition alone.The result shows simulating precipitation increased soil microbial biomass carbon and nitrogen at the growth peaks of spring ephemerals and spring-summer annuals, while nitrogen deposition at a rate of 5 gN·m-2·yr-1has a weak effect on soil microbial biomass; precipitation addition and nitrogen deposition in combination has similar effects on soil microbial biomass with precipitation addition alone. Precipitation addition and nitrogen deposition effects on bacterial diversity differing with regard to the different sampling time. Precipitation addition had significantly stronger influence at growth peaks of spring ephemerals and spring-summer annuals than that in winter and snowmelting, while nitrogen deposition had stronger effects on bacterial diversity in winter. Soil bacterial community shows large variations with sampling times, although precipitation addition and nitrogen addition also altered bacterial community composition, its effects are much weaker than the sampling duration in this study.

PCR-DGGE; nitrogen deposition; increasing precipitation; soil microbial community structure; temperate desert.

2016-03-25

國家自然科學基金(41371004)

蘇延桂(1980—)， 女，甘肅蘭州人，副研究員，博士，研究方向：干旱區土壤碳循環.

1671-9824(2016)05-0102-08

S154.1

A