茶鮮葉中有機磷農藥殘留分析

劉騰飛，董明輝，*，張 麗，楊代鳳，顧俊榮

（1.江蘇太湖地區農業科學研究所農產品質量認證中心，江蘇蘇州 215155；2.蘇州市職業大學教育與人文學院，江蘇蘇州 215104）

茶鮮葉中有機磷農藥殘留分析

劉騰飛1，董明輝1，*，張 麗2，楊代鳳1，顧俊榮1

（1.江蘇太湖地區農業科學研究所農產品質量認證中心，江蘇蘇州 215155；2.蘇州市職業大學教育與人文學院，江蘇蘇州 215104）

為監測茶鮮葉中有機磷農藥殘留污染狀況，應用超聲波提取、分散固相萃取凈化、氣相色譜檢測，建立了一種簡單、快速測定茶鮮葉中7種有機磷農藥（敵敵畏、樂果、毒死蜱、甲基對硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷和三唑磷）殘留的分析方法。樣品采用φ（乙酸）=1%的乙腈溶液超聲提取，乙二胺-N-丙基硅烷、十八烷基硅烷鍵合硅膠和石墨化炭黑混合吸附劑分散萃取凈化，DB-1701毛細管柱程序升溫分離，火焰光度檢測器測定，基質外標法定量。結果表明，在0.01～4.00 mg·L-1范圍內，7種有機磷農藥的峰面積與其濃度呈良好的線性關系，相關系數均大于0.998，方法的檢出限為0.003 4～0.013 6 mg·kg-1，定量限為0.012～0.046 mg·kg-1，加標回收率為77.7%～98.2%，相對標準偏差（n=5）為2.4%～8.7%。該方法操作簡單、結果可靠、溶劑用量少，對檢測條件要求低，適用于茶鮮葉中7種有機磷農藥殘留的檢測。

茶鮮葉；有機磷農藥；分散固相萃??；氣相色譜

LIU Tengfei，DONG Minghui，ZHANG Li，et al.Determination of organophosphorus pesticide residues in fresh tea leaves［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（4）:66-72.

茶鮮葉是從茶樹新梢上采摘下來的鮮活的芽或葉，作為加工各類成品茶的原料，其質量優劣、安全與否直接影響到茶葉產品的質量安全，特別是近年來的農藥殘留問題，已成為影響茶葉質量安全的重要因素之一。目前，有關茶葉農藥殘留的分析研究已有不少報道，但主要集中在成茶上，對茶鮮葉中的殘留研究的較少。由于茶鮮葉提取物中含有比成茶更多的干擾物質，例如簡單兒茶素等多酚類及葉綠醇等色素類，因此文獻報道的茶葉中農藥殘留的檢測方法［1-3］不能直接用于茶鮮葉基質的測定。國內雖有一些關于茶鮮葉農藥殘留的研究報道，但僅涉及六六六、滴滴涕等有機氯農藥以及少數幾種菊酯類農藥的檢測［4-5］，對茶鮮葉中有機磷農藥的檢測尚未見報道，而且在茶鮮葉農藥殘留提取過程中，上述報道主要運用傳統的振蕩提取、均質提取、液液萃取等方法，凈化方式則主要使用濃硫酸磺化法和柱層析凈化法，操作煩瑣，耗費時間，溶劑用量大，已無法滿足現代茶葉農藥殘留快速分析的要求。

分散固相萃?。╠ispersive solid phase extraction，DSPE）是2003年美國農業部的Anastassiades等提出的一種簡便、快速、高效、經濟的樣品前處理技術，它利用直接在試樣的提取液中加入的吸附劑填料對基質中干擾雜質（色素、甾醇、糖類、有機酸等）的吸附作用，達到除雜凈化的目的。該技術適用性強、應用范圍廣，根據樣品的性質及目標物的特點，可以選擇適合的提取溶劑和吸附劑填料，以滿足不同基質的分析需要。與傳統的固相萃取、柱層析等凈化方法相比［6-9］，DSPE可省去裝柱、過柱及大量溶劑洗脫等操作，樣品制備速度快、分析成本低、回收率高、結果準確，目前已在食品［10-12］農藥殘留檢測中得到了廣泛應用。

本文將DSPE方法用于茶鮮葉樣品前處理，結合氣相色譜-火焰光度法（GC-FPD）檢測，建立了茶鮮葉中敵敵畏、樂果、毒死蜱、甲基對硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷和三唑磷7種有機磷農藥殘留的分析方法。該方法的建立對茶葉有機磷農藥的過程監測，從源頭控制茶葉有機磷農藥殘留，提高飲茶安全性提供了一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

有機磷農藥標準溶液包括:敵敵畏、樂果、毒死蜱、甲基對硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、三唑磷，質量濃度1 000 mg·L-1，農業部環境保護科研監測所。乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB），中國Agela Technologies公司。十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilane bonded silica，C18），美國Sepax Technologies公司。乙腈、丙酮、乙酸、無水乙酸鈉、無水MgSO4（620℃灼燒4 h）均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

茶鮮葉樣品取自蘇州東洞庭山碧螺春茶園。

1.2儀器與設備

7890A型氣相色譜儀（配FPD檢測器），美國Agilent公司；KQ-500DE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器公司；TG16-WS型高速離心機，湖南湘儀實驗儀器公司；HSC-24B型氮吹儀，天津恒奧科技公司；VM-10型渦旋振蕩器，韓國Daihan Scientific公司。

1.3實驗方法

1.3.1標準溶液配制

分別移取1 000 mg·L-1的7種有機磷農藥標準品1.0 mL于20 mL容量瓶中，用丙酮定容，配成濃度為50 mg·L-1的單標溶液。根據各農藥在FPD檢測器上的響應，取敵敵畏單標溶液0.5 mL，樂果、三唑磷單標溶液各2.0 mL，其余有機磷單標溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容，得混合標準儲備液，放置4℃冰箱待用。

1.3.2樣品前處理

取茶鮮葉樣品攪碎并混合均勻，稱取5.0 g（精確至0.1 g），于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL φ（乙酸）=1%的乙腈溶液和2 g無水乙酸鈉混勻，超聲提取15 min，加入1 g無水硫酸鎂，渦旋2 min，9 000 r/min條件下離心4 min。取4 mL上層提取液于裝有0.15 g C18，0.15 g PSA，0.12 g GCB和0.3 g無水硫酸鎂的離心管中，渦旋2 min，于9 000 r·min-1條件下離心5 min。取2.0 mL上清液于刻度試管中，50℃水浴條件下氮吹至近干，用丙酮定容至1.0 mL，在混合器上混勻，過0.22 μm有機系濾膜上機檢測。

1.3.3色譜條件

色譜柱DB-1701（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；進樣口溫度220℃；升溫程序為90℃保持1 min，以20℃·min-1升至200℃保持9 min，以30℃·min-1升至245℃保持8 min；FPD溫度245℃；載氣為高純氮氣，流速3.0 mL·min-1（恒流速）；氫氣流速75 mL·min-1；空氣流速100 mL·min-1；進樣量1.0 μL，不分流進樣。

2　結果與分析

2.1提取條件的選擇

乙腈對不同極性有機磷農藥溶解度好，提取效率高，且對樣品基質中的蠟類、脂肪等非極性成分提取能力弱，能夠有效減少提取液中雜質［13］，故以乙腈為提取溶劑，考慮到7種供試有機磷農藥具有弱酸性，本試驗在茶鮮葉樣品中添加100 μL 7種供試農藥的混合標準儲備液，比較了乙腈、乙酸-乙腈（φ（乙酸）=1%）溶液對測定結果的影響，見表1。

表1　不同提取溶劑的回收率結果Tab.1 Recoveries of different extraction solvents%

根據表1結果，2種提取溶劑對7種供試農藥的提取效率相當，分別為72.3%～92.2%，75.8%～93.8%，均滿足分析方法的要求，但乙酸-乙腈（φ（乙酸）=1%）樣品溶液的雜質較少、色譜圖背景干擾小，且試驗間平行性較好，故本實驗采用乙酸-乙腈溶液（φ（乙酸）=1%）作為提取溶劑。實驗將提取溶劑用量確定為10 mL，即體積相當于2倍量的樣品質量，既保證了目標農藥的充分提取，又節省試劑，減少環境污染。

2.2提取方式的選擇

實驗比較了振蕩、勻漿和超聲三種常見提取方式，振蕩提取操作簡便，但要達到較好的回收率所需時間較長，一般需要1～2 h，效率較低。勻漿提取速度快、效果好，單個樣品只需幾分鐘，但大量樣品時須逐個提取，時間長，效率低，而且連續提取時高速勻漿機的刀頭清理不干凈，容易造成樣品間的交叉污染，影響檢測結果的準確性。而超聲提取操作簡單，速度快，所需時間小于30 min，且提取過程無需人員看守，可同時處理大批量樣品，因此本實驗采用超聲提取方式。

由于超聲波在運行過程中會產生熱量，長時間的超聲會造成有機磷農藥的分解，降低分析的靈敏度和準確度，考察了5～20 min的超聲時間對茶鮮葉添加100 μL 7種供試有機磷農藥混合標準儲備液后的提取效果，實驗平行3次，見圖1。

由圖1可知，當超聲時間為10～20 min時茶鮮葉中7種有機磷農藥的回收率均在70%以上，且平行性較好，為節省前處理時間并保證提取效果，選擇超聲時間為15 min。

圖1　超聲時間對茶鮮葉中7種有機磷農藥的回收率影響Fig.1 Effects of ultrasonic time on recovery rates of 7 organophosphorus pesticides in fresh tea leaves

2.3凈化條件的選擇

實驗采用DSPE方式作為去除雜質的凈化手段，由于茶鮮葉中含有甾醇、脂肪酸、油類、蠟類等雜質，且色素含量高，故選用PSA、C18和GCB混合吸附劑分散凈化，PSA用于去除提取液中的糖類、脂肪酸和極性色素，C18用于除去甾醇和其他非極性干擾物，GCB能夠強烈吸附色素類物質，對基質的顏色凈化效果較好［14-15］。

各種凈化劑在去除雜質的同時也可能對目標農藥產生吸附，取4.0 mL空白茶鮮葉樣品提取液，加入100 μL 7種有機磷農藥混合標準儲備液，混勻后經不同質量C18、PSA和GCB渦旋凈化，處理后的回收率數據見表2。

表2　7種有機磷農藥經C18，PSA和GCB凈化劑處理后的回收率Tab.2 Recoveries of 7 organophosphorus pesticides after purified by C18，PSA，and GCB%

由表2可以看出，C18、PSA和GCB 3種凈化劑對農藥的吸附保留能力隨用量的增加而逐漸增強，其中C18對目標農藥的吸附保留隨用量的增加變化較小，但是當C18用量大于150 mg時，殺螟硫磷的回收率低于80%；PSA對目標農藥的吸附相對較強，當用量大于150 mg時，敵敵畏、樂果、毒死蜱、馬拉硫磷和殺螟硫磷的回收率均已小于80%；3種凈化劑中，GCB對目標農藥的吸附較大，當用量大于120 mg時，目標農藥的回收率已小于65%，當用量為120 mg時，凈化后的樣品溶液顏色較淺，整體回收率較好。

綜合考慮凈化劑去雜質特性和對目標農藥的吸附情況，本研究選擇加入150 mg C18、150 mg PSA和120 mg GCB進行分散固相萃取凈化，對茶鮮葉空白樣品和加標樣品進行分析，結果見圖2和圖3。

圖2　茶鮮葉空白樣品色譜Fig.2 Gas chromatogram of fresh tea leaves

圖3　茶鮮葉加標樣品色譜Fig.3 Gas chromatogram of fresh tea leaves with fortified organophosphorus pesticides

由圖2和圖3可以看出，在該凈化條件下，7種有機磷農藥出峰處無明顯的干擾雜峰，表明本方法的凈化條件選擇合適。

2.4基質效應

由于采用GC法分析樣品中的農藥殘留時極易受到基質效應的影響［16］，故對相同濃度的丙酮混合標準溶液和基質匹配標準溶液進行了對比檢測，結果見圖4。

圖4　7種有機磷農藥在茶鮮葉中的基質效應Fig.4 Matrix effect of 7 organophosphorus pesticides in fresh tea leaves

由圖4可知，這7種有機磷農藥基質匹配標準溶液的峰面積均明顯高于丙酮混合標準溶液的峰面積，表明在檢測茶鮮葉中這7種有機磷農藥時存在基質增強效應。故在使用外標法定量時，采用空白樣品的凈化液稀釋標樣，以消除基質干擾，減少誤差。

2.5線性范圍和檢出限

取7種有機磷農藥混合標準儲備液，以空白茶鮮葉樣品的凈化液為溶劑，分別配制敵敵畏質量濃度為0.010，0.025，0.050，0.250，0.500，1.000 mg·L-1，樂果、三唑磷質量濃度為0.04，0.10，0.20，1.00，2.00，4.00 mg·L-1及毒死蜱、甲基對硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷質量濃度為0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 mg·L-1的基質匹配系列標準溶液，在選定色譜條件下測定，以各農藥組分的峰面積（y）對質量濃度（x，mg·L-1）繪制標準曲線，線性范圍、回歸方程和相關系數見表3。表3結果表明7種有機磷農藥在各自濃度范圍內線性良好，相關系數（r）均大于0.998。以最低添加水平色譜圖中3倍噪聲為檢出限（limit of detection，LOD），10倍噪聲為定量限（limit of quantification，LOQ），7種有機磷農藥在茶鮮葉中的LOD和LOQ結果也見表3。

表3　7種有機磷農藥的標準曲線、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限Tab.3 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients，LOD，and LOQ for 7 organophosphorus pesticides

2.6方法的準確度和精密度

稱取5.0 g茶鮮葉空白樣品3份，分別加入50，100，500 μL 1.3.1中7種有機磷農藥混合標準儲備液（各農藥添加水平見表4），充分混勻，靜置1 h，按照1.3.2樣品前處理和1.3.3色譜條件測定，對每個添加水平作5個平行，考察方法的準確度和精密度，結果見表4。7種有機磷農藥在茶鮮葉中的平均回收率為77.7%～98.2%，相對標準偏差為2.4%～8.7%（n=5），均符合農藥殘留分析的要求［17］。

表4　方法的精密度和加標回收率結果Tab.4 Precision and recovery of method

2.7實際樣品分析

利用本研究建的分析方法，檢測了從蘇州東洞庭山碧螺春茶園隨機采集的16份茶鮮葉中敵敵畏、樂果、毒死蜱、甲基對硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷和三唑磷的殘留量。結果表明，在16份茶鮮葉樣品中均未檢出這7種農藥殘留。

3　結 論

采用φ（乙酸）=1%的乙腈溶液超聲提取，PSA、C18和GCB 3種混合吸附劑分散萃取凈化，GCFPD檢測，建立了同時測定茶鮮葉中7種有機磷農藥殘留的分析方法，方法的準確度、精密度和靈敏度均滿足殘留分析的要求。在0.025～1.0 mg/kg的添加水平下，7種有機磷農藥的平均回收率為77.7%～98.2%，相對標準偏差（n=5）為2.4%～8.7%，檢出限為0.003 4～0.013 6 mg·kg-1，定量限為0.012～0.046 mg·kg-1。該方法操作簡便，分析快速，準確可靠，采用GC-FPD作為DSPE方法后續的分析儀器，價格便宜，操作維護簡單，易于掌握普及，非常適合在廣大基層檢測機構推廣，為茶葉有機磷農藥的過程監測和源頭監督檢驗提供了技術支撐。不過，該方法是以碧螺春綠茶鮮葉為研究對象，對其他品種茶鮮葉是否具有較好的實用性還有待進一步研究。

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Determination of Organophosphorus Pesticide Residues in Fresh Tea Leaves

LIU Tengfei1，DONG Minghui1，*，ZHANG Li2，YANG Daifeng1，GU Junrong1
（1.Quality Certification Center of Agricultural products，Jiangsu Taihu Area Institute of Agricultural Sciences，Suzhou 215155，China；2.College of Education and Humanity，Suzhou Vocational University，Suzhou 215104，China）

To investigate the pollution of organophosphorus pesticides in fresh tea leaves，a simple and rapid analytical method was established for simultaneous determination of seven organophosphorus pesticides（dichlorvos，dimethoate，chlorpyrifos，methyl parathion，malathion，fenitrothion，and triazophos）in fresh tea leaves by ultrasound assisted extraction and dispersive solid phase extraction（DSPE）coupled with gas chromatography.The samples were ultrasonically extracted with acetonitrile（containing 1%acetic acid）.Subsequently，the extract was cleaned-up by using primary secondary amine，octadecylsilane bonded silica and graphitized carbon black as adsorbents according to the method of DSPE.Then，the residues were determined by a heated DB-1701 capillary column with flame photometric detector，and quantified using the matrix-matched external standard method.Good linearities between concentrations and peak areas were achieved in the concentration range of 0.01-4.00 mg·L-1for target pesticides，with correlation coefficients higher than 0.998.The average recoveries of target pesticides in fresh tea leaves were 77.7%-98.2%with relative standard deviations（n=5）ranging from 2.4%to 8.7%. The limits of detection for target organophosphorus pesticides were 0.003 4-0.013 6 mg·kg-1and the limits of quantification were 0.012-0.046 mg·kg-1.The method was simple，accurate，solvent saving and without special instrument making it suitable for simultaneous determination of seven organophosphorus pesticides in fresh tea leaves.

fresh tea leaves；organophosphorus pesticides；dispersive solid phase extraction；gas chromatography

TS272.7

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.04.012

2095-6002（2016）04-0066-07引用格式：劉騰飛，董明輝，張麗，等.茶鮮葉中有機磷農藥殘留分析［J］.食品科學技術學報，2016，34（4）:66-72.

（責任編輯:李 寧）

20150819

江蘇省農業科技自主創新基金項目（CX（14）2102）；蘇州市科技支撐項目（SNG201442）；蘇州市應用基礎研究項目（SNY201518）。

劉騰飛，男，助理研究員，碩士，主要從事農產品質量安全分析研究；

*董明輝，男，研究員，博士，主要從事農產品質量與控制技術研究。通信作者。