干細胞移植治療噪聲性和藥物性聾的比較實驗研究△

朱漢卿　張軍峰　徐偵

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·實驗研究·

干細胞移植治療噪聲性和藥物性聾的比較實驗研究△

朱漢卿1張軍峰2徐偵3

目的比較耳蝸干細胞移植治療噪聲性聾豚鼠和藥物性聾豚鼠模型的效果。方法選用清潔級健康成年純白紅目豚鼠120只，建立噪聲性聾模型耳蝸干細胞移植組、噪聲性聾模型空白對照組、藥物性聾模型耳蝸干細胞移植組、藥物性聾模型空白對照組，每組30只；向噪聲性聾模型耳蝸干細胞移植組和藥物性聾模型耳蝸干細胞移植組耳蝸分別注入耳蝸干細胞懸液10 μl，向噪聲性聾模型空白對照組和藥物性聾模型空白對照組耳蝸分別注入10 μl生理鹽水。于術后7、28、56 d進行ABR檢測并進行免疫熒光觀測Nestin陽性細胞數和MyosinⅦA陽性細胞數。結果在噪聲性聾和藥物性聾耳蝸干細胞移植組的耳蝸鼓階處觀測到Nestin陽性細胞和MyosinⅦA陽性細胞，但噪聲性聾干細胞移植組的Nestin陽性細胞和MyosinⅦA陽性細胞數量多于藥物性聾干細胞移植組；耳蝸干細胞移植后噪聲性聾和藥物性聾組ABR反應閾均下降，但術后28天和56天噪聲性聾干細胞移植組ABR閾值分別為52.61±5.14和40.39±4.59 dB SPL，低于藥物性聾干細胞移植組(分別為66.39±4.77和60.41±4.17 dB SPL)。結論耳蝸干細胞移植對于噪聲性聾豚鼠模型的治療效果優于藥物性聾豚鼠模型。

耳蝸干細胞；移植；噪聲性聾；藥物性聾

Medicine,Nanjing， 210029, China)

感音性聾主要由多種因素引起的耳蝸毛細胞倒伏、萎縮和死亡導致[1]。由于人類耳蝸毛細胞的再生能力很弱，所以毛細胞的損傷不可逆，從而導致感音性聾的治療一直是一個難題[2]。近年來，隨著干細胞移植分化研究的深入，感音性聾的治療研究取得了重大進展，即利用耳蝸干細胞移植分化為有功能性的毛細胞來治療此類疾病[3～5]。導致感音性聾最常見的病因主要有噪聲性和中毒性兩類，選用何種原因導致感音性聾的動物模型觀察耳蝸干細胞移植治療感音性聾效果最佳，值得探討；本研究嘗試以耳蝸干細胞移植治療噪聲性聾和藥物性聾豚鼠模型，比較二者的療效，為后續藥物干預研究提供方向[6，7]，報告如下。

1　資料與方法

1.1實驗動物及分組選用耳廓反射靈敏、雙耳ABR反應閾正常(4 kHz雙耳ABR反應閾20～35 dB SPL)的健康成年純白紅目豚鼠(清潔級，由南京中醫藥大學動物室提供)120只，雌雄不分，體重220±30 g，均排除了中耳炎；將其分為噪聲性聾模型耳蝸干細胞移植組(第一組)，噪聲性聾模型空白對照組(第二組)和藥物性聾模型耳蝸干細胞移植組(第三組)，藥物性聾模型空白對照組(第四組)，每組30只。

1.2噪聲性聾模型的建立60只豚鼠(第一、二組)于清醒正常狀態下放入籠內固定于消聲室自由聲場中，脈沖噪聲聲源(壓力峰值為180.0 dB SPL，脈寬0.25 ms，間隔時間20秒)距離豚鼠雙耳15 cm，連續暴露300 次。噪聲暴露后1 周進行ABR 測試，選擇4、8、16、20 kHz各頻率雙耳ABR 閾值均≥60 dB SPL的豚鼠為備選動物。

1.3藥物性聾模型的建立60只豚鼠(第三、四組)每日肌肉注射慶大霉素100 mg/kg,連續10 d，10 d后進行ABR測試，選擇4、8、16、20 kHz各頻率雙耳ABR閾值均≥60 dB SPL的豚鼠為備選動物。

1.4耳蝸干細胞培養取新生(P0)豚鼠10只，用10%水合氯醛2 ml腹腔注射麻醉后，取出耳蝸，去除表面結締組織及血管，分離出Corti器，用HBSS液多次沖洗后將其盡量剪碎，以0.125%胰蛋白酶37 ℃消化25分鐘后200目銅網過濾，將濾液1 000 rpm離心4分鐘，吸管輕柔吹打成單細胞懸液，按1×105個/毫升的密度裝入培養瓶，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中，每3天半量置換培養基，根據細胞濃度，7天左右傳代，以Nestin進行免疫熒光染色鑒定和Brdu標記細胞核[8]。

1.5耳蝸干細胞移植各組豚鼠麻醉后，在左耳后分層切開，暴露聽泡并在鏡下打開，在耳蝸底周鼓階外側壁下方，電鉆一0.2 mm的小孔。第一、三組于造孔處用10 μl微量注射器在10 min時長內注入10 μl耳蝸干細胞懸液；第二、四組注入10 μl生理鹽水。注射完畢留針2 min，然后以結締組織和生物膠封堵鉆孔處，逐層縫合切口。為預防中耳感染，術后肌肉注射頭孢唑啉500 mg·kg-1·d-1，連續7 d[9]。

1.6聽性腦干反應(ABR)測試各組分別于內耳注射后7、28和56 d進行ABR測試。10%水合氯醛腹腔注射麻醉豚鼠后固定，記錄電極置于顱頂，參考電極置于左耳乳突，接地電極置于右耳乳突，以0.10 ms短音刺激，測試頻率為20 kHz，刺激頻率10次/秒，帶通慮波80～3 000 Hz，掃描時程10 ms，疊加1 024次。聲刺激從90 dB SPL起始，5 dB步距遞減，記錄ABR閾值[10]。

1.7耳蝸取材及熒光染色四組豚鼠于內耳注射后7、28和56 d分別隨機抽取5只，以過度麻醉處死，在顯微鏡下取出聽泡，于4 ℃下4%多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣3 d后置于30%的蔗糖內浸泡12 h，用OCT膠包埋后快速冰凍切片，片厚10 μm，PBS漂洗，避光操作。于各時間點用MyosinⅦA免疫熒光染色檢測分化的毛細胞，用熒光顯微鏡觀測并用分格計數法(分100格，每格實際長度0.01 mm)進行鏡下視野毛細胞均值計數。

1.8統計學方法所有數據均采用SPSS13.0統計軟件進行方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1噪聲及藥物性感音性聾豚鼠造模完成噪聲暴露及慶大霉素注射后，第一～四組豚鼠都不同程度地出現煩躁、體重下降、聽力下降，一周后ABR反應閾均大于80 dB SPL，鏡下觀察發現內耳毛細胞出現倒伏、萎縮，部分死亡(圖1)，建模成功[11，12]。

2.2耳蝸干細胞的培養和鑒定P0豚鼠耳蝸干細胞在培養皿中生長良好，單細胞呈圓球形,3～4天后逐漸匯集成團(圖2)，Nestin熒光染色檢測呈陽性(圖3)，用Brdu標記細胞核(圖4)證明培養的是干細胞，此干細胞具有良好的增殖特性。

2.3ABR反應閾四組豚鼠于移植前1 d、移植后7、28和56 d左耳ABR反應見表1。

圖1　感音性聾豚鼠模型內耳毛細胞(熒光顯微鏡×100)

可見，術后28和56 d第一、三組ABR閾值較各自空白對照組顯著降低，說明耳蝸注入耳蝸干細胞后豚鼠聽功能明顯好轉(P<0.05)；第一組術后28和56 d聽功能恢復要明顯優于第三組(P<0.05)。

2.4免疫熒光檢測結果熒光顯微鏡觀察到第一組和第三組豚鼠鼓階內Nestin陽性細胞隨時間延續逐漸減少(圖5)，其中，第一組干細胞存活數量較第三組多(P<0.05)(表2)；術后28和56 d兩組豚鼠鼓階內均可見MyosinⅦA陽性的分化毛細胞(圖6)，其中，第一組毛細胞分化數量較第三組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表1　四組豚鼠干細胞移植前后左耳ABR反應閾值(dB ±s)

注：*與第二組比較，P<0.05；#與第四組比較，P<0.05；△與第三組比較，P<0.05

表2　第一、三組術后不同時間移植干細胞存活數和毛細胞分化數(個，±s)

注：*與第三組比較，P<0.05

圖4　Brdu標記陽性細胞 (熒光顯微鏡×200)

3　討論

本課題組在前期研究中發現干細胞移植可以有效改善感音性耳聾患者的聽力，但是又出現了移植干細胞存活率和移植后的干細胞分化為毛細胞比例不穩定的問題[13]，因此，有必要在干細胞移植治療感音性聾時進行實驗模型的細分選擇，找出適合干細胞移植治療的最佳模型，以便進一步研究[14]。

本實驗通過耳蝸干細胞移植術后7、28、56 d的ABR閾值檢測發現，相對于空白對照組，無論是噪聲性聾干細胞移植組，還是藥物性聾干細胞移植組，其ABR閾值都有明顯的恢復，同時在術后28 d和56 d的免疫熒光檢測中觀測到其鼓階內存在大量的分化毛細胞，再次證明了耳蝸干細胞移植治療噪聲性聾和藥物性聾都是有效的。術后7 d噪聲性聾和藥物性聾干細胞移植組ABR反應閾相對于空白對照組雖有下降，但差異無統計學意義，可能與術后7 d干細胞移植完成不久，分化為毛細胞的數量較少有關，這也從術后7 d熒光顯微鏡下觀測到大量的Nestin陽性細胞而幾乎不見MyosinⅦA陽性細胞得以證實，由此可以推斷移植干細胞分化為毛細胞需要一段時間，該過程至少在7 d以上，即干細胞移植治療感音性聾的見效時間不少于7 d。

文中結果顯示耳蝸干細胞移植術后28 d和56 d噪聲性聾和藥物性聾干細胞移植組的ABR閾值持續下降，熒光顯微鏡下可見分化的毛細胞數量也在持續增加，但移植后7～28 d ABR閾值下降速度優于28～56 d，同時，免疫熒光觀測中也發現術后7天幾乎未見鼓階內有分化的毛細胞，而到第28 d分化的毛細胞增加數要遠多于術后28～56 d，說明兩種耳聾模型的聽力恢復都是一個長期的過程，但干細胞移植后近期的毛細胞分化數量對于感音性聾的恢復具有重大影響，至于術后28 d是否是毛細胞分化速率的峰值點，則需要更加充分的實驗證明，這將在今后的實驗中進一步研究。

從文中結果看耳蝸干細胞移植術后28 d和56 d噪聲性聾干細胞移植組的ABR閾值均明顯低于藥物性聾干細胞移植組，同時，免疫熒光檢測也可以看到噪聲性聾干細胞移植組鼓階移植的干細胞存活數量要多于藥物性聾干細胞移植組，而噪聲性聾干細胞移植組在7～28 d和28～56 d的移植干細胞死亡速率(即干細胞減少速率)都要慢于藥物性聾干細胞移植組，同樣，分化的毛細胞數量也大大多于藥物性聾干細胞移植組。由此可見，相對于藥物性聾，干細胞移植治療噪聲性聾的干細胞成活率和毛細胞分化率都更穩定，聽力恢復效果更良好；因此，建議干細胞移植治療感音性聾研究中，應該首選噪聲性聾動物模型；本研究為進一步研究干細胞移植治療感音性聾，提高移植干細胞存活率和移植后的干細胞分化為毛細胞的比例打下了一定的基礎，也為本課題組后續的藥物干預實驗研究提供了方向。

1Tao L, Segil N. Early transcriptional response to aminoglycoside antibiotic suggests alternate pathways leading to apoptosis in sensory hair cells in the mouse inner ear[J]. Front Cell Neurosci,2015,21:190.

2Kuo BR, Baldwin EM, Layman WS, et al. In Vivo Cochlear Hair Cell Generation and Survival by Coactivation of β-Catenin and Atoh1[J]. J Neurosci,2015,35:10786.

3Zhang W, Zhang F, Han Y, et al. Auditory stimulation modulates CXCL12/CXCR4 expression in postnatal development of the newborn rat cochlea[J]. Neuroreport,2015,26:681.

4Costa A, Sanchez-Guardado L, Juniat S, et al. Generation of sensory hair cells by genetic programming with a combination of transcription factors[J]. Development,2015,142:1948.

5Ohnishi H, Skerleva D, Kitajiri S, et al. Limited hair cell induction from human induced pluripotent stem cells using a simple stepwise method[J]. Neurosci Lett,2015,599:49.

6劉翔. 感音神經性聾21例臨床分析[J]. 中國衛生標準管理,2015,6:101.

7池青. 神經性耳聾耳鳴治療方法探索[J]. 臨床合理用藥雜志,2013,6:117.

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9鄭鴻燕，邰浩清，曾水林.當歸補血湯對感音神經性聾大鼠耳蝸干細胞移植后細胞凋亡的影響[J]. 聽力學及言語疾病雜志,2010,18:271.

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13鄭鴻燕，邰浩清，曾水林.當歸補血湯對耳蝸干細胞鼓階內移植治療藥物性感音神經性耳顧大鼠增效作用研究[J]. 東南大學學報(醫學版)，2010,29：176.

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(2016-01-01收稿)

(本文編輯雷培香)

A Comparative and Experimental Study on the Treatment of Noise Induced Hearing Loss and Toxic Hearing Loss with the Stem Cells Transplantation

Zhu Hanqing*, Zhang Junfeng, Xu Zhen

(*Department of Anatomy and Histology,Nanjing University of Chinese

ObjectiveTo compare the effect of the cochlear stem cells transplantation in treating the noise induced hearing loss model and toxic hearing loss model.MethodsThe Experimental guinea pigs were divided into three groups: the group of the noise induced hearing loss model treated with the cochlear stem cells, the blank control group of toxic hearing loss model treated with the cochlear stem cells and noise induced hearing loss model and the blank control group of toxic hearing loss model. The cochlear stem cells suspension and physiological saline were transplanted into the cochlear inner ears of the three groups, respectively. ABR detection and immunofluorescence observation were implemented three times in 7 days, 28days and 56 days after the operation, respectively.ResultsNestin positive cells and Myosin ⅦA positive cells were detected in both of the two models treated with cochlear stem cells, but the number of Nestin positive cells and Myosin ⅦA positive cells detected in noise induced hearing loss model was higher than that in the toxic hearing loss model. The ABR responses decreased on the noise induced hearing loss model and toxic hearing loss model treated with cochlear stem cells transplantation, but the hearing recovery of guinea pigs in the noise induced hearing loss model was superior to the toxic hearing loss model at 28 days and 56 days after operation.ConclusionThe cochlear stem cells transplantation is more effective in treating noise induced hearing loss than toxic hearing loss model.

Cochlear stem cells;Transplantation;Noise induced hearing loss;Toxic hearing loss

△江蘇省高校自然科學基金項目( 12KJD360002)、江蘇省高校優勢學科建設工程(PAPD)聯合資助

1南京中醫藥大學解剖與組胚教研室(南京210029)；2南京中醫藥大學微生物與免疫學教研室；3南京醫科大學第二附屬醫院

朱漢卿，男，江蘇人，講師，主要研究方向為神經干細胞。

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.05.014

R764.43+3

A

1006-7299(2016)05-0478-04

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160830.1108.004.html

網絡出版地址：2016-8-3011:08