昆蟲Allatostatin神經肽的生物信息學分析

常菊花　何月平

摘要：根據已報道的昆蟲咽側體抑制激素（Allatostatin，AS）神經肽序列，基于轉錄組和基因組學數據庫，通過同源性比較分別查找到53、33、57和35種昆蟲的AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC前體氨基酸序列，并對這些AS前體序列進行系統發育樹的構建及分析。結果表明，昆蟲AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC分別在各自的進化分支上，且AS-C和AS-CC之間的親緣關系較近，AS-A是最早分化出來的。在4種AS的進化樹中，不同種類昆蟲間的親緣關系不盡相同。其中在AS-C進化樹中，除了膜翅目，完全變態類昆蟲都在一個進化分支，而膜翅目和不完全變態類昆蟲在一個進化分支。在AS-CC進化樹中，發現鱗翅目和雙翅目分別在一個進化分支上，而膜翅目、鞘翅目和不完全變態類昆蟲在一個進化分支上。目前尚未找到鞘翅目昆蟲的AS-A序列和膜翅目昆蟲的AS-B序列。

關鍵詞：昆蟲；神經肽；生物信息學；系統進化樹；Allatostatin

中圖分類號：Q966 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1566-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.052

昆蟲神經肽通過激素或遞質的形式調控著昆蟲的生長發育、脫皮變態、滯育、代謝、生殖等多種發育過程[1]。由腦神經內分泌細胞分泌的神經肽類激素咽側體活化激素（Allatotropin，AT）或咽側體抑制激素（Allatostatin，AS）刺激或抑制咽側體的保幼激素（Juvenile hormone，JH）的生物合成[2]。咽側體合成的保幼激素在大多數昆蟲中控制幼蟲的生長、變態和成蟲發育等重要生理過程[3]。AS神經肽廣泛存在于各種昆蟲中，最早是從太平洋折翅蠊（Diploptera punctata）的后腦復合體中分離出來[4]，隨后在多種昆蟲中都分離出AS。目前，在昆蟲中分離鑒定出4種AS神經肽類型（AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC）[5]：①A型AS的酰胺化C末端有非常保守的五肽序列Y/FXFGL/I-amide。從太平洋折翅蠊中分離出來的AS神經肽序列就是A型，因此也叫蟑螂型AS，或FGLamide。②B型AS的特征是在多肽序列酰胺化C末端的2位和9位上有共同的色氨酸（Trp，W），最初從咖啡兩點蟋（Gryllus bimaculatus）中分離出來[6]，因此也稱蟋蟀型AS，或W（X）6W-amide。該類神經肽因其具有抑制前胸腺活性，先前被稱為myoinhibitory peptide（MIP）。③C型AS是一個含有15個氨基酸的單一多肽，其C末端為未酰胺化的五肽序列PISCF，首先從煙草天蛾（Manduca sexta）中分離出來[7]，故也稱蛾型AS，或PISCF型AS。④Allatostatin double C（AS-CC）是AS-C的旁系同源神經肽。先前與AS-C通稱為類AS-C肽（AS-C like peptides），近年才被命名為AS double C（AS-CC）。AS-C和AS-CC的前體氨基酸序列C末端的2位和9位上有相同的半胱氨酸（Cys，C）組成一個二硫鍵。

AS神經肽的功能除抑制咽側體內保幼激素的生物合成外，還影響昆蟲的生長發育、生殖和行為等生理過程。由于神經肽在昆蟲體內含量很低，因此昆蟲神經肽分離工作進展遲緩，隨著結構鑒定技術和肽分離技術的發展，鑒定的神經肽數目大大增加，特別是隨著基因組學的發展，越來越多的昆蟲神經肽序列可以被預測出來。因此，本研究根據現報道的昆蟲AS神經肽序列，通過同源性比較來查找其他昆蟲AS神經肽序列，并對昆蟲AS神經肽家族進行進化分析，為昆蟲AS神經肽的結構和功能分析提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 昆蟲Allatostatin神經肽家族氨基酸序列的查找

根據報道的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[8]，岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）[9]，意大利蜜蜂（Apis mellifera）[10]，家蠶（Bombyx mori）[11]，赤擬谷盜（Tribolium castaneum）[12]，長紅錐蝽（Rhodnius prolixus）[13]，東亞飛蝗（Locusta migratoria）[14]，濕木白蟻（Zootermopsis nevadensis）[14]和褐飛虱（Nilaparvata lugens）[15]的Allatostatin前體氨基酸序列作為參照，在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、昆蟲基因組和轉錄組資源庫（http：//www.insect-genome.com/）和水稻害蟲轉錄組數據庫（http：//rptdb.hzau.edu.cn/）中采用TBLASTN查找其他昆蟲可能的Allatostatin前體基因序列。采用ExPASy網站的翻譯工具（http：//web.expasy.org/translate/）對前體基因序列進行翻譯，并逐一核對活性肽序列的同源性。

1.2 多序列聯配和系統進化樹構建

利用EMBL-EBI在線程序ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalw2/）對蛋白序列進行多序列比對分析，利用BioEdit軟件輸出。使用MEGA5軟件中的鄰接法（Neighbor-joining）對蛋白序列構建系統進化樹。其中，程序的重復次數（Number of bootstrap replications）設為1 000，替換方法（Substitution method）選擇p-distance，空缺數據的處理方法（Gap data treatment）選擇95%partial deletion，其他參數采用默認設置。

2 結果與分析

根據已報道的幾種昆蟲Allatostatin神經肽序列，通過BLAST查找其他昆蟲Allatostatin神經肽序列，分別找到了53、33、57和35種昆蟲Allatostatin A、Allatostatin B、Allatostatin C和Allatostatin CC氨基酸序列。通過預測神經肽的活性肽并進行序列比對，驗證所查找的神經肽氨基酸序列。

從圖1中可以看出，昆蟲4種類型AS的神經肽前體序列分別在各自的進化分支上，且AS-C和AS-CC之間的親緣關系較近，AS-A是最早分化出來的。

2.1 昆蟲AS-A神經肽前體序列的進化樹分析

51種昆蟲的AS-A前體氨基酸序列分成兩個進化分支，雙翅目、膜翅目AS-A在一個進化分支上，鱗翅目、半翅目、等翅目、直翅目和蜚蠊目在另一個進化分支上（圖2）。對這51種昆蟲AS-A神經肽預測活性肽序列，發現C末端有3種情況，即F/YXFGL、F/YXFGI和F/YXFGV。其中所有昆蟲都有F/YXFGL，而F/YXFGI只在15種昆蟲（分屬膜翅目、半翅目、直翅目和等翅目）中發現，F/YXFGV只在4種昆蟲[東亞飛蝗（L. migratoria）、沙漠蝗（S. gregaria）、雙斑蟋（G. bimaculatus）和達爾文澳白蟻（M. darwiniensis）]中發現。AS-A前體序列的進化樹構建結果基本符合昆蟲形態學分類，除了體虱AS-A與完全變態類雙翅目和膜翅目在一個進化分支上。目前尚未在鞘翅目中發現AS-A序列。

2.2 昆蟲AS-B神經肽前體序列的進化樹分析

由圖3可以看出，雙翅目在單獨一個進化分支，鞘翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、等翅目和虱目在一個進化分支。對這33種昆蟲AS-B神經肽預測活性肽序列，發現有3種類型，即W（X）6W-amide、W（X）7W-amide和W（X）8W-amide。所有昆蟲都含有W（X）6W-amide，然而只含有W（X）6W-amide的昆蟲種類為雙翅目所有昆蟲、黑脈金斑蝶（D. Plexippus）、柑橘卷葉蛾（A. transitella）、赤擬谷盜（T.castaneum）、中歐山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）、內華達古白蟻（Z. nevadensis）和東亞飛蝗（L. migratoria），同時有W（X）6W-amide和W（X）7W-amide有12種昆蟲，而只在鱗翅目5種昆蟲[詩神袖蝶（Heliconius melpomene）、小菜蛾（P. xylostella）、棉鈴蟲（H. armigera）、柑橘鳳蝶（P. xuthus）、玉帶鳳蝶（P. machaon）]中發現有W（X）8W-amide。目前尚未在膜翅目中發現AS-B序列。

2.3 昆蟲AS-C神經肽前體序列的進化樹分析

對57種昆蟲的AS-C神經肽前體序列進行進化樹分析，發現存在兩個進化分支，鱗翅目、鞘翅目和雙翅目在一個進化分支，而膜翅目、半翅目、等翅目、直翅目和虱目在另一個進化分支（圖4）。膜翅目昆蟲和不完全變態昆蟲在一分支上，這可以支持一些昆蟲分類學家最近提出的膜翅目昆蟲位于完全變態昆蟲進化的最底層的這個學說[16]。按照Allatostatin-C的進化樹可以推論完全變態昆蟲進化的順序可能為膜翅目、鞘翅目、雙翅目、鱗翅目。因此Allatostatin-C神經肽可能與昆蟲變態密切相關。AS-C的活性肽序列非常保守，且含有二硫鍵。15種鱗翅目昆蟲AS-C神經肽序列均為QVRFRQCYFNPISCF，6種蚊類昆蟲AS-C序列均為QIRYRQCYFNPISCF，11種蠅類昆蟲AS-C序列均為QVRYRQCYFNPISCF，7種不完全變態昆蟲及部分膜翅目昆蟲AS-C序列均為SYWKQCAFNAVSCF，而鞘翅目和部分膜翅目昆蟲AS-C序列多樣化（圖5）。

2.4 昆蟲AS-CC神經肽前體序列的進化樹分析

對32種昆蟲的AS-CC神經肽前體序列進行進化樹分析，發現鱗翅目和雙翅目分別在一個進化分支上，而膜翅目、鞘翅目、半翅目、等翅目和直翅目在一個進化分支上。AS-CC的C末端氨基酸序列非常保守，且含有二硫鍵（圖4）。C末端10位氨基酸序列為R/K-C-Y/F-F-N-A-V-T/S-C-F，N末端序列差異較大（圖6）。AS-C和AS-CC的二硫鍵之間都是含有6個氨基酸。雖然3種白蟻AS-C有類似AS-CC的CXXNAVXCF的C末端序列，AS-C和AS-CC的前體序列在兩個獨立的進化分支上，說明昆蟲AS-C和AS-CC神經肽來自不同的起源，這也驗證了將AS-CC作為一類新AS神經肽的可靠性。

3 小結與討論

通過對昆蟲AS神經肽前體序列的系統發育樹的構建及分析，發現昆蟲AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC分別在各自的進化分支上，且AS-C和AS-CC之間的親緣關系較近，AS-A是最新分化出來的。不同種類昆蟲在4種類型AS的進化樹中，不同種類昆蟲間的親緣關系不盡相同。在AS-A進化樹中，完全變態類的雙翅目和膜翅目昆蟲在一個進化分支，而鱗翅目與不完全變態類昆蟲在另一個進化分支上，但是尚未發現鞘翅目昆蟲的AS-A序列。AS-B進化樹中，雙翅目在單獨一個進化分支，而鞘翅目、鱗翅目和不完全變態類昆蟲在一個進化分支，但尚未發現膜翅目昆蟲的AS-B序列。在AS-C進化樹中，除了膜翅目，完全變態類昆蟲都在一個進化分支，而膜翅目和不完全變態類昆蟲在一個進化分支，推測AS-C與昆蟲變態密切相關。在AS-CC進化樹中，發現鱗翅目和雙翅目分別在一個進化分支上，而膜翅目、鞘翅目和不完全變態類昆蟲在一個進化分支上。

在昆蟲進化過程中，昆蟲分化出多種多樣的神經肽或神經激素，可以調控不同的昆蟲生長發育，這也導致昆蟲世界的多樣化。在昆蟲中發現了多種AS神經肽，這些神經肽的功能也不盡相同。已分離的大多數昆蟲AS都能抑制源昆蟲的CA對JH的合成，且AS還具有多效性。首次分離出來的蜚蠊型AS-A能夠在CA中抑制JH合成[6，17]，另外也在其他神經組織（如額神經節、食道下神經節等）或分泌細胞（如中腸內分泌細胞）中發現，還證明其具有抑制內臟（如腸道和心臟）肌肉的自主收縮[14]。AS-A還在德國小蠊脂肪體中發現且具有抑制卵原蛋白合成[18]。在德國小蠊中還發現AS-A具有通過影響消化酶的分泌和腸道蠕動性來抑制食物攝取和消化的功能[19]。在蛾類中，注射AS-A可以提高血淋巴中的JH滴度，從而導致幼蟲死亡升高和精細胞縮小[20，21]。AS-B首先在東亞飛蝗腦-心側體-咽側體-食道下神經節的提取物中發現，體外測定發現有抑制后腸和輸卵管的收縮活性[22]。隨后在雙斑蟋（G. bimaculatus）腦提取物中也發現了AS-B，并證明其在咽側體中具有抑制JH活性。在東亞飛蝗的腦、食道下神經節、背神經索的多個神經節、心臟、輸卵管和后腸中被發現[22]。在家蠶和煙草天蛾的Epiproctodeal glands中發現，推測可能參與羽化行為[23]。在反吐麗蠅（Calliphora vomitoria）和果蠅（D. melanogaster）的視覺系統中發現AS-B，推測可能作用于昆蟲生物鐘[24，25]。另外在果蠅中發現AS-B可以靶定和激活性肽受體，推測可能參與繁殖行為[26]。AS-C首先在煙草天蛾的腦中分離出來，證明在咽側體中對JH具有非常強的抑制活性[7]。AS-CC和AS-C的神經肽序列結構類似，功能也相似。AS-C具有多效性，例如還有調節前腸收縮活性[27]，在蚊子中發現羽化后AS-C水平上升，推測可能參與變態[28]，在?；页嵋苟辏⊿. littoralis）和番茄夜蛾（Lacanobia oleracea）中注射AS-C導致妨礙幼蟲發育和死亡率升高[29]。在馬鈴薯甲蟲中，通過RNAi將AS-C沉默后，體內保幼激素酸甲基轉移酶 （JHAMT）的mRNA水平上調，導致JH水平上升，從而妨礙幼蟲生長和發育[30]。AS不是孤立地發揮作用，而是與其共存的其他肽能物質協同作用，這種協同作用可能表現為在行使某一功能的相互促進或抑制。

通過對神經肽的信號系統的干擾，使得昆蟲內分泌系統失去平衡，影響昆蟲正常的生理活動，從而達到控制害蟲的目的[1]。本研究根據現報道的數種昆蟲AS神經肽序列，基于轉錄組和基因組學數據庫，通過同源性比較分別查找到昆蟲的AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC前體氨基酸序列分別是53、33、57和35種，并對這些AS前體序列進行了親緣關系分析，這對之后的昆蟲神經肽的結構和功能研究提供了理論基礎。

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