基于質譜技術的神經肽研究進展

姬倩悅，馬敏，彭鑫，賈辰熙，李靈軍,3

?

基于質譜技術的神經肽研究進展

姬倩悅1,2，馬敏1,2，彭鑫1，賈辰熙2，李靈軍1,3

1 天津大學生命科學學院，天津 300072 2 國家蛋白質科學中心北京蛋白質組研究中心蛋白質組學國家重點實驗室放射與輻射醫學研究所，北京 102206 3 美國威斯康星大學麥迪遜分校藥學院和化學系，美國威斯康星麥迪遜 53705

姬倩悅, 馬敏, 彭鑫, 等. 基于質譜技術的神經肽研究進展. 生物工程學報, 2017, 33(7): 1061–1068.Ji QY, Ma M, Peng X, et al. Advances in mass spectrometry-based approaches for neuropeptide analysis. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1061–1068.

神經肽是一類重要的內源活性物質，在神經系統中發揮重要的作用，并連接大腦和其他神經器官?；谫|譜技術的神經肽組學研究旨在對神經肽進行大規模研究，在分子水平上得到重要信息，進一步加深對神經系統調控機制以及神經疾病致病機理的理解。文中綜述了利用質譜技術進行神經肽研究的基本策略，包括樣品處理、定性定量方法以及質譜成像等研究進展。

神經肽，質譜，定性，定量，質譜成像

“神經肽”最初是由De Wied[1]在1971年提出，是在神經細胞中合成的內源性肽段，通過調節神經來影響多種生理進程，具有典型的多肽短鏈結構，長度一般為3–100個氨基酸。神經肽的生理學功能主要是在神經元以及其他細胞或靶器官之間傳遞信號。在臨床上，神經肽扮演著重要角色。神經肽的調節異常往往會引起一系列的神經系統疾病。經實驗證明，精氨酸加壓素、腦啡肽、β-內啡肽等神經肽與癲癇的發生發展有著密切的關系，而膽囊收縮素和血管緊縮素可以抑制腦內癲癇發作[2]。也有研究發現神經肽與皮膚免疫反應、組織維護及修復有關[3]。因此，神經肽以及神經肽受體已經成為治療神經系統疾病的藥物靶點[4]。

神經肽是在神經元中合成，首先合成神經肽前體，然后經過一系列酶切、翻譯后修飾等過程產生具有活性的神經肽。一個神經肽前體可以產生多個具有活性的神經肽。即使是同一家族的神經肽仍可能具有不同的功能，甚至會引起相反的調節作用。因此，神經肽的這些分子水平特性導致對其研究極其困難并具有很大的挑戰性。

傳統的研究神經肽的方法主要是放射免疫法、免疫組織化學法、RNA印跡試驗等。這些方法不僅需要耗費大量時間，而且神經肽必須有已知信息，因此不適用于發現新的神經肽。此外，基于抗體的免疫化學法易發生交叉反應，難以區分同一神經肽的不同亞型[5]。

近年來質譜技術發展迅速，應用領域越來越廣。由于質譜分析具有高靈敏度、高準確度、分離和鑒定同時進行等特點，為神經肽的研究提供了新途徑。在微量樣品中，質譜儀可檢測出大量神經肽，并可精確測量肽段的質荷比 (mass/charge，/)，根據肽段的二級圖譜進行從頭測序、同源序列比對等方法，從而發現新型未知的神經肽。通過非標記方法或者同位素標記的方法，質譜可以檢測神經肽的動態變化。此外，運用質譜成像技術可對神經肽的分布提供具體信息。圖1概括了目前利用質譜研究神經肽的主要技術路線。

圖1 神經肽研究的技術路線流程圖

1 樣品制備

質譜是一種具有高靈敏度的分析儀器，若想對神經肽進行精確分析，則應提高樣品的純度。在神經肽檢測過程中，很多因素會對其分析造成一定的影響，例如高鹽、脂質以及能引起神經肽降解的酶等，均可抑制神經肽的檢測信號，對分析結果造成影響。因此，需要采用特殊有效的樣品制備方法和策略。

當動物的腦部組織被解剖出后，蛋白酶就開始快速降解蛋白質以及神經肽。相對豐度較高的蛋白質的降解產物通常很復雜，抑制了組織中相對豐度較低的神經肽的信號，對神經肽的檢測造成困難。為了滅活組織中蛋白酶，常用的一種處理方法是對組織進行微波加熱。Che 等[6]利用微波技術對小鼠的下丘腦和垂體進行加熱，使其中蛋白酶迅速變性，并采用質譜和穩定同位素標記的方法對神經肽進行定量。經實驗發現，經過微波加熱后，在下丘腦中檢測到的神經肽含量比未經此技術處理的樣品高出2–3倍。Sturm等[7]也利用微波加熱的方法處理下丘腦和紋狀體組織并且分析其中神經肽。另一種常用處理方法是利用生物樣品穩定儀——Denator[8]對樣品進行處理。Sturm等[9]比較了利用生物樣品穩定儀滅活蛋白酶的樣品和未滅活樣品的神經肽數據，發現在利用電噴霧電離源分析時，動物死后的蛋白質降解片段會掩蓋神經肽信號，增加圖譜復雜性。此外，通過給實驗動物灌注蛋白酶抑制劑的方法也可以有效抑制蛋白酶的降解作用[10]。使用這種方法處理樣品后，不僅可獲得更多的完整神經肽數量，而且蛋白酶的降解產物也相應地減少。

對于體液中的神經肽，可以采用微透析技術與質譜分析相結合，從而提高神經肽的鑒定數量。微透析技術 (Microdialysis，MD) 是一種利用膜透析原理對活體細胞外液中生化物質進行采集的技術。因對動物造成的干擾小，且樣品不被非變量因素干擾，被廣泛應用于神經生物學分析[11]。但是，使用微透析技術時，其神經肽回收率低是阻礙其應用的瓶頸，因為與其他小分子相比，神經肽的尺寸較大，會堵塞透析膜，因此影響神經肽的回收率。為了增加神經肽的回收率，通常將親和劑加在液體灌注探頭中，分析物與親和劑結合，導致透析液中分析物濃度降低，增大濃度梯度，驅動分析物透過透析膜，這種方法被稱為親和力增強微透析 (Affinity-enhanced microdialysis，AE-MD)[12]。實驗結果發現利用抗體、環糊精等親和劑，成功提高了細胞因子和神經肽的回收率[13]。Schmerberg等[14]比較了C18硅膠顆粒、抗體包被的微粒等不同親和劑對神經肽進行富集，發現抗體包覆磁性納米顆粒 (AbMnP) 的效果最好，使神經肽回收率增加超過40倍。利用此方法分析北黃道蟹神經器官中的神經肽，與常規方法相比檢測到更多的神經肽，且蛋白質降解碎片的數量也大大降低[15]。

2 質譜分析

液相色譜與二級質譜聯用是神經肽分析強有力的工具，通常采用數據依賴采集方法對其進行高通量分析。但是神經肽的質量大小多變，質譜對大于4 kDa的肽段解離和裂解效果不佳，降低對中等或者質量大的肽段從頭測序能力。根據神經肽的質量大小，分別采取不同的分析策略，可以精確鑒定到不同大小的神經肽。如利用數據依賴采集串聯質譜方法檢測質量小的神經肽，自上而下(Top-down) 的測序方法檢測中等大小的神經肽，自下而上(Bottom-up) 的方法分析質量大的神經肽，為神經肽的全面研究提供新的思路[16]。

質譜數據庫非依賴采集方法是通過從頭測序的方法，不依賴于數據庫，從質譜數據中按照質譜二級數據中碎片離子信息直接推測序列，這對于發現新型未知神經肽具有很大意義。Ye等[17]利用從頭測序的方法研究了加利福尼亞龍蝦中的神經肽，通過從頭測序方法發現34種神經肽，包括18種新型神經肽，并揭示了加利福尼亞龍蝦中向肌肽 (Orcokinin) 新型序列基序。

利用兩種質譜技術基質輔助激光解吸電離-傅里葉變換質譜 (MALDI-FTMS)和納流液相色譜-電噴霧電離-四極桿-飛行時間串聯質譜 (Nano LC-ESI-Q-TOF MS/MS)，Ma等[18]將生物質譜分析和功能基因組分析結合，共同驗證神經肽的功能。MALDI-FTMS用來檢測已知神經肽的精確質量，而nano LC-ESI-Q-TOF MS/MS用來對未知的神經肽進行從頭測序。此外，利用同源轉錄組信息搜索質譜檢測到的神經肽，驗證了鞣化激素β亞型、蝗抗利尿肽等。而Hayakawa等[19]將碰撞誘導解離 (Collision-induced dissociation，CID) 和電子轉移解離(Electron transfer dissociation，ETD) 這兩種不同的離子碎裂方式結合，檢測小鼠垂體腫瘤細胞中的神經肽。經過結合不同的解離方法，使同一肽段產生不同的碎片離子，為神經肽的鑒定提供更豐富的序列信息，從而提高鑒定可信度。

3 數據處理

質譜是一種高通量的分析儀器，一次實驗可獲得海量數據，所以需要嚴謹的數據處理手段從龐大的質譜原始文件中鑒定、定量神經肽。肽組學分析數據與蛋白質組學的差別是不需要選擇酶切，采用非特異性數據庫進行搜索。分析質譜數據時，需要相應種屬數據庫提供神經肽名稱、序列等信息。蛋白質前體數據庫可以從網站上下載，例如Uniprot、NCBI等。

為了減小假發現率，在研究神經肽時，經常應用只含有潛在神經肽序列或其前體蛋白序列的數據庫，而不是選用該生物的全蛋白質數據庫。神經肽是由神經肽前體經酶切產生，所以許多研究者利用神經肽的剪切規律預測神經肽的序列，例如NeuroPred[20]是預測神經肽前體裂解位點，提供肽段潛在序列。而SwePep數據庫中包含已經被注釋的神經肽，可以手工或者利用軟件直接與原始數據對比，鑒定神經肽[21]。應用選定的數據庫，利用搜庫軟件，例如Mascot、SEQUEST、PEAKS和ProSightPC等，通過肽段質量對數據進行分析，將圖譜與含有理論肽段的數據庫對比，得到圖譜對應的肽段信息。

除了與數據庫對比，還可以通過從頭測序的方法分析肽段，特別是在缺少相應種屬的基因組序列時。在分析質譜圖譜時，按照氨基酸的質量推測出肽段序列，然后進行序列同源比對，得到有相似序列的物種，根據其所屬的家族推測出該肽段可能具有的功能。從頭測序可以通過軟件輔助分析，例如PEAKS[22]。通過加入化學修飾可以幫助指認多肽的碎片離子，使b離子和y離子在二級質譜中分開，例如還原甲基化標記法等。這種方法標記神經肽的N末端和賴氨酸的ε氨基，標記后每一個位點增加28 Da，且a1離子信號增強，有利于從頭測序分析[23]。同時，標記后的肽段帶電狀態變化不大，不會降低肽段分析的精確度。

4 神經肽的定量

利用質譜技術可以測量不同情況下神經肽的含量，質譜數據的高度重復性決定了定量的準確性。對神經肽的定量分為絕對定量和相對定量，絕對定量是指獲得某種肽段的精確表達量，而相對定量則是通過質譜技術比較在不同條件下的樣品中肽段表達量的差異。定量的手段分為非標記定量和穩定同位素標記定量。非標記定量通常是利用質譜圖中峰面積、峰強度或者圖譜數量進行定量，這不能準確定量低豐度的神經肽。Frese等[24]借助高分辨率的串聯質譜，利用肽段的提取離子色譜圖 (Extracted ion chromatogram，XIC) 的峰面積，研究下丘腦和紋狀體中調控進食的神經肽。利用胰蛋白酶酶解的BSA肽段作為內標，在質譜水平上對檢測技術的變化進行歸一化。實驗結果發現，當大鼠進食高糖高脂肪的食物時，促進食欲神經肽含量相對上調。Lee等[25]利用串聯質譜對視交叉上核中神經肽進行研究，通過比較峰強度，發現在不同時間點的神經肽含量具有顯著差異，進一步實驗得到神經肽調控大鼠的晝夜節律的證據，這為探索視交叉上核的晝夜節律功能提供了重要的分子水平信息。

利用化學或者代謝方法引入的穩定同位素標記策略可實現同時對多個樣品進行定量。利用標記試劑，在肽段中引入同位素標簽，不同樣品中同一肽段具有質量差，在同一圖譜中分析峰強度，可以得到相關肽的比例。

研究者已發明可以進行多標定量的化學試劑，在不增加樣品復雜度的前提下增加標記數量，例如TMT[26]、iTRAQ[27]、DiLeu[28]等方法。上文提到還原甲基化標記法可以輔助從頭測序，除此之外，還可以被運用于神經肽的定量。為了研究與進食相關的神經肽，Chen等[11]利用甲醛和氘代甲醛分別標記未進食和進食的動物的神經肽組，以1∶1的比例混合進行質譜分析，觀察質譜圖譜可得到神經肽的相對變化比例。結果表明，在進食之后，CabTRP含量提高，而Pyrokinin含量降低。結合質譜成像技術發現，嗅葉和中央前大腦是關于進食的主要兩個區域。同樣，研究者用此方法研究了溫度對冷血生物神經肽的影響，發現高溫時心包器官中的RFamide和RYamide含量顯著降低，而竇腺中的orcokinin含量降低[29]。

Hui等[30]研究藍蟹的神經肽，結合從頭測序的方法，利用N,N-二甲基亮氨酸 (DiLeu) 對樣品進行標記，提高測序的準確度。被標記神經肽的二級圖譜表現出高強度的指示離子 (/114)，可作為神經肽檢測的標簽。同時，DiLeu標記可增強神經肽在質譜中的碎裂，有利于從頭測序。此研究鑒定了藍蟹11個家族的130種神經肽，其中有44種是新發現的肽段。

代謝標記是在肽段合成過程中引入同位素，即在細胞培養時引入同位素標記的氨基酸或者在飼養動物時喂食含有同位素的食物。細胞培養中使用氨基酸進行穩定的同位素標記 (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC) 方法是將含有重標或者輕標的必需氨基酸加入培養基中，并引入目標細胞中，其所包含的蛋白質經胰蛋白酶酶解后，會產生具有相應質量差的肽段。在蛋白質組學研究時，因其較高的標記率，而被廣泛使用[31]。但是，這種方法缺點是試劑較為昂貴，耗費時間較長，而且并不是每一種樣品都適用于此方法。此外，通過化學反應也可以將同位素引入肽段中，常用的標記方法有四甲基溴化銨 (TMAB)、二甲基標記[32]等。

以上方法是對神經肽進行相對定量，獲得不同樣品之間肽段表達差異。對于已知的神經肽，可以采用質譜多反應監測 (Multiple reaction monitoring，MRM) 對肽段進行絕對定量。MRM是根據待檢測離子的質量信息，有選擇地收集二級質譜信號，降低其他信號干擾。Kosanam等[33]采用MRM方法對大鼠腦部的α以及γ內啡肽進行定量，以測定其相對于組織的含量，其含量分別為 (13.8±0.57) ng/g和(2.5±0.43) ng/g。

5 質譜成像技術

目前，利用質譜成像技術對神經肽的研究主要集中于鑒定和定量，且神經肽空間分布也為研究其功能提供重要信息。免疫組織化學染色可以研究神經肽分布，但是提供的化學信息較少，并且抗體容易產生交叉反應而使結果不準確。由Gessel等[34]發明的質譜成像方法 (Mass spectrometric imaging，MSI) 可以克服以上問題，在組織、細胞水平對待測分子的空間分布信息進行成像，具有高敏感度和化學特異性。待測樣品被固定于含有-軸的樣品板上，通過質譜電離技術獲得每個位點的質荷比信息，根據信號強度得到相應的熱點圖，從而顯示出組織樣品中生物分子的空間分布信息。

DeKeyser等[35]利用MALDI質譜分子成像技術研究了北黃道蟹圍心器和腦部的神經肽組成，鑒定了超過10個家族神經肽的分布，發現同一家族的神經肽也會呈現不同的分布信息。OuYang等[36]將質譜成像與數據依賴采集方法相結合，利用MALDI-LTQ-Orbitrap XL質譜儀研究甲殼類動物的神經肽。將全質譜掃描與數據依賴采集掃描結合在一次質譜分析中，使質譜成像分析更加快速，且可同時進行神經肽的鑒定和分布研究。最終實驗原位鑒定到藍蟹的39種已知神經肽及一種新型神經肽。

但是，利用質譜成像的方法研究神經肽仍然存在諸多問題。例如，在研究小分子時，基質在激光照射時產生的基質離子可能會掩蓋分析物離子的信號，特別是對于質量小于500 Da的分子。Shariatgorji等[37]分析了D4-CHCA與CHCA，發現與CHCA相比，D4-CHCA的電離離子發生質量偏移，低質量分析物的質譜峰不被基質覆蓋?；蛘呤褂眠x擇反應監測 (Selective reaction monitor，SRM)，只有特定的片段離子被檢測，因此基質離子不會對分析物的檢測造成干擾[38]。利用質譜成像進行定量、樣品制備的重復性等問題也是質譜成像技術面臨的難題。

6 總結與展望

神經肽是一種重要的信號分子，在眾多生理學過程中具有重要作用，也是藥物研發的重要靶點。應用基于質譜的神經肽組學技術，對神經肽鑒定和定量，可為在不同的生理學進程中神經元之間信號傳遞與調控提供更加深刻的認識。

隨著技術的發展，更加先進的質譜儀和技術被利用于多種樣品的研究。但是，眾多研究只是集中于鑒定到的神經肽數目，而沒有對其生物功能進行深入研究。例如，不能有效區分內源性多肽和其前體的降解產物。一般方法是將檢測到的數據與神經肽前體序列對比，確定是否存在神經肽。但事實是檢測到的肽段通常是活性神經肽的一部分，這些縮短形式的神經肽并不能被確認為獨立的神經肽還是冗余。

即使近些年分析技術迅速發展，但新神經肽功能的研究仍然進程緩慢。這就需要開發可靠的方法，對具有重要生物學功能的神經肽進行深入研究。當前的定性和定量的方法，仍需簡化流程、增加重現性，才能得到廣泛推廣和利用。為了從質譜數據中挖掘出更多的信息，生物信息學分析工具也需要進一步改進以適應質譜技術的飛速發展。

REFERENCES

[1] de Wied D. Long term effect of vasopressin on the maintenance of a conditioned avoidance response in rats. Nature, 1971, 232(5305): 58–60.

[2] Clynen E, Swijsen A, Raijmakers M, et al. Neuropeptides as targets for the development of anticonvulsant drugs. Mol Neurobiol, 2014, 50(2): 626–646.

[3] Peters EMJ, Ericson ME, Hosoi J, et al. Neuropeptide control mechanisms in cutaneous biology: physiological and clinical significance. J Invest Dermatol, 2006, 126(9): 1937–1947.

[4] H?kfelt T, Bartfai T, Bloom F. Neuropeptides: opportunities for drug discovery. Lancet Neurol, 2003, 2(8): 463–472.

[5] Nelson MD, Trojanowski NF, George-Raizen JB, et al. The neuropeptide NLP-22 regulates a sleep-like state in. Nat Commun, 2013, 4: 2846.

[6] Che FY, Lim J, Pan H, et al. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Mol Cell Proteom, 2005, 4(9): 1391–1405.

[7] Sturm RM, Dowell JA, Li L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods Mol Biol, 2010, 615: 217–226.

[8] Zhang XZ, Petruzziello F, Zani F, et al. High identification rates of endogenous neuropeptides from mouse brain. J Proteome Res, 2012, 11(5): 2819–2827.

[9] Sturm RM, Greer T, Woodards N, et al. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. J Proteome Res, 2013, 12(2): 743–752.

[10] Secher A, Kelstrup CD, Conde-Frieboes KW, et al. Analytic framework for peptidomics applied to large-scale neuropeptide identification. Nat Commun, 2016, 7: 11436.

[11] Chen RB, Hui LM, Cape SS, et al. Comparative neuropeptidomic analysis of food intake via a multifaceted mass spectrometric approach. Acs Chem Neurosci, 2010, 1(3): 204–214.

[12] van Wanseele Y, de Prins A, de Bundel D, et al. Challenges for thequantification of brain neuropeptides using microdialysis sampling and LC-MS. Bioanalysis, 2016, 18(8): 1965–1985.

[13] Fletcher HJ, Stenken JA. Ancomparison of microdialysis relative recovery of Met-and Leu-enkephalin using cyclodextrins and antibodies as affinity agents. Anal Chim Acta, 2008, 620(1/2): 170–175.

[14] Schmerberg CM, Li LJ. Mass spectrometric detection of neuropeptides using affinity-enhanced microdialysis with antibody-coated magnetic nanoparticles. Anal Chem, 2013, 85(2): 915–922.

[15] Behrens HL, Chen RB, Li LJ. Combining microdialysis, nanoLC-MS, and MALDI-TOF/TOF to detect neuropeptides secreted in the crab,. Anal Chem, 2008, 80(18): 6949–6958.

[16] Jia CX, Lietz CB, Ye H, et al. A multi-scale strategy for discovery of novel endogenous neuropeptides in the crustacean nervous system. J Proteomics, 2013, 91: 1–12.

[17] Ye H, Wang JX, Zhang ZC, et al. Defining the neuropeptidome of the spinyinterruptus brain using a multidimensional mass spectrometry-based platform. J Proteome Res, 2015, 14(11): 4776–4791.

[18] Ma MM, Bors EK, Dickinson ES, et al. Characterization of theneuropeptidome by mass spectrometry and functional genomics. Gen Comp Endocr, 2009, 161(3): 320–334.

[19] Hayakawa E, Menschaert G, de Bock PJ, et al. Improving the identification rate of endogenous peptides using electron transfer dissociation and collision-induced dissociation. J Proteome Res, 2013, 12(12): 5410–5421.

[20] Southey BR, Amare A, Zimmerman TA, et al. NeuroPred: a tool to predict cleavage sites in neuropeptide precursors and provide the masses of the resulting peptides. Nucleic Acids Res, 2006, 34: W267–W272.

[21] F?lth M, Sk?ld K, Norrman M, et al. SwePep, a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol Cell Proteom, 2006, 5(6): 998–1005.

[22] Ma B, Zhang KZ, Hendrie C, et al. PEAKS: powerful software for peptidesequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 17(20): 2337–2342.

[23] Fu Q, Li LJ.sequencing of neuropeptides using reductive isotopic methylation and investigation of ESI QTOF MS/MS fragmentation pattern of neuropeptides with N-terminal dimethylation. Anal Chem, 2005, 77(23): 7783–7795.

[24] Frese CK, Boender AJ, Mohammed S, et al. Profiling of diet-induced neuropeptide changes in rat brain by quantitative mass spectrometry. Anal Chem, 2013, 85(9): 4594–4604.

[25] Lee JE, Zamdborg L, Southey BR, et al. Quantitative peptidomics for discovery of circadian-related peptides from the rat suprachiasmatic nucleus. J Proteome Res, 2013, 12(2): 585–593.

[26] Dayon L, Hainard A, Licker V, et al. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal Chem, 2008, 80(8): 2921–2931.

[27] Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation inusing amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteom, 2004, 3(12): 1154–1169.

[28] Frost DC, Greer T, Li LJ. High-resolution enabled 12-plex DiLeu isobaric tags for quantitative proteomics. Anal Chem, 2015, 87(3): 1646–1654.

[29] Chen RB, Xiao MM, Buchberger A, et al. Quantitative neuropeptidomics study of the effects of temperature change in the Crab Cancer borealis. J Proteome Res, 2014, 13(12): 5767–5776.

[30] Hui LM, Xiang F, Zhang YZ, et al. Mass spectrometric elucidation of the neuropeptidome of a crustacean neuroendocrine organ. Peptides, 2012, 36(2): 230–239.

[31] Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteom, 2002, 1(5): 376–386.

[32] Boersema PJ, Aye TT, Van Veen TAB, et al. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics, 2008, 8(22): 4624–4632.

[33] Kosanam H, Ramagiri S, Dass C. Quantification of endogenous α-and γ-endorphins in rat brain by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Biochem, 2009, 392(1): 83–89.

[34] Gessel MM, Norris JL, Caprioli RM. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. J Proteomics, 2014, 107: 71–82.

[35] DeKeyser SS, Kutz-Naber KK, Schmidt JJ, et al. Imaging mass spectrometry of neuropeptides in decapod crustacean neuronal tissues. J Proteome Res, 2007, 6(5): 1782–1791.

[36] OuYang CZ, Chen BM, Li LJ. High throughput in situ DDA analysis of neuropeptides by coupling novel multiplex mass spectrometric imaging (MSI) with gas-phase fractionation. J Am Soc Mass Spectr, 2015, 26(12): 1992–2001.

[37] Shariatgorji M, Nilsson A, Goodwin RJA, et al. Deuterated matrix-assisted laser desorption ionization matrix uncovers masked mass spectrometry imaging signals of small molecules. Aanl Chem, 2012, 84(16): 7152–7157.

[38] Porta T, Grivet C, Kraemer T, et al. Single hair cocaine consumption monitoring by mass spectrometric imaging. Anal Chem, 2011, 83(11): 4266–4272.

(本文責編 陳宏宇)

Advances in mass spectrometry-based approaches for neuropeptide analysis

Qianyue Ji1,2, Min Ma1,2, Xin Peng1, Chenxi Jia2, and Lingjun Li1,3

1,,300072,2,,,,102206,3,53705,

Neuropeptides are an important class of endogenous bioactive substances involved in the function of the nervous system, and connect the brain and other neural and peripheral organs. Mass spectrometry-based neuropeptidomics are designed to study neuropeptides in a large-scale manner and obtain important molecular information to further understand the mechanism of nervous system regulation and the pathogenesis of neurological diseases. This review summarizes the basic strategies for the study of neuropeptides using mass spectrometry, including sample preparation and processing, qualitative and quantitative methods, and mass spectrometry imagining.

neuropeptides, mass spectrometry, identification, quantitation, mass spectrometry imaging

December 25, 2016;Accepted: February 6, 2017

Lingjun Li. E-mail: lingjun.li@wisc.edu Chenxi Jia. E-mail: cjia@mail.ncpsb.org

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21675006), National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. SQ2016YFJC040033, 2016YFA0501302).

國家自然科學基金 (No. 21675006)，國家重點基礎研究發展計劃(973計劃) (Nos. SQ2016YFJC040033, 2016YFA0501302) 資助。