二維Otsu和改進區域生長法的熒光免疫層析試條濃度的定量檢測*

高躍明，伊騰增，韋孟宇，杜民，潘少恒

（1.福州大學物理與信息工程學院，福州350116；2.福州大學福建省醫療器械和醫藥技術重點實驗室，福州350002；3.澳門大學科技學院電機及電腦工程系，澳門特別行政區999078；4.澳門大學模擬與混合信號超大規模集成電路國家重點實驗室，澳門特別行政區999078）

二維Otsu和改進區域生長法的熒光免疫層析試條濃度的定量檢測*

高躍明1，2*，伊騰增1，2，韋孟宇2，3，4，杜民1，2，潘少恒4

（1.福州大學物理與信息工程學院，福州350116；2.福州大學福建省醫療器械和醫藥技術重點實驗室，福州350002；3.澳門大學科技學院電機及電腦工程系，澳門特別行政區999078；4.澳門大學模擬與混合信號超大規模集成電路國家重點實驗室，澳門特別行政區999078）

目前熒光免疫層析試條的定量檢測方法絕大多數采用光電反射法，該方法需要對試條進行高精度的定位并且需要復雜的傳動裝置。利用CMOS圖像傳感器獲取熒光免疫層析試條的圖像信息，采用圖像分割方法用于熒光免疫層析試條檢測線和質控線進行自動識別，首先對采集到的原始圖像進行增強預處理，并進行初步分割。然后選定處理后圖像的種子點并通過改進的二維Otsu法選取生長閾值對圖像進行區域生長，以實現對圖像檢測線和質控線的分割。結果表明該方法能夠在目標和背景對比度很低的情況下，將圖像檢測線和質控線的輪廓清晰的分割出來，且區域一致性測度和對比度都比較理想。該方法檢測不同濃度的試條，得到的特征值重復性小于5%，線性度大于0.99，準確度大于0.98。實驗證明用該方法對熒光免疫層析試條進行定量檢測是可行的，且較對比儀器具有更寬的檢測范圍。

熒光免疫層析試條；圖像采集；區域生長；二維Otsu；定量檢測

EEACC：7230doi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.09.010

免疫層析法將待測抗原/抗體通過層析的手段與帶有標記物的抗體/抗原進行特異性的免疫反應，進而采用光學或電磁學方法檢測標記物光強或電信號大小，實現對待測物濃度的間接檢測。該方法具有特異性強、結果準確、操作簡便、檢測快速、可單人份檢測等特點，被廣泛應用于醫學檢驗、食品安全、毒品抽檢等現場快速測試領域［1-2］。

熒光免疫層析試條將熒光顆粒作為顯色標記物，通過定量檢測熒光信號來實現對待測抗原/抗體的檢測。熒光標記物的引入使免疫層析法升級成一種定量檢測手段。ESE公司研制的Quant定量側向層析檢測系統（簡稱Quant），被認為是POCT領域熒光層析檢測的標桿［3］。國內推出了一些熒光免疫層析分析系統。如［4］中所提出的基于免疫層析技術的時間分辨熒光免疫分析儀，以及［3］中所提到的熒光免疫層析定量檢測儀。但這些儀器大多采用光電掃描的方式來實現。光電掃描法在檢測過程中需要對光學傳感器和試條進行準確定位。一旦裝配過程中存在定位不準，將導致檢測結果的偏差。光電掃描法還需要傳動裝置，傳動裝置會帶來機械振動噪聲對檢測結果產生影響。本文擬采用圖像傳感器獲取熒光試條的圖像，并進行定量檢測使得檢測噪聲減少，并使檢測的結果精確度提高。根據熒光免疫層析試條的特點，本文采用一種改進的區域生長法提取試條測試窗口中的檢測線和質控線并實現定量檢測。首先通過圖像增強提高圖像目標和背景的對比度，再通過閾值法對圖像進行預分割去除部分干擾信息，根據灰度直方圖的分布特性及目標區域的連通性作為生長判決條件，用一種改進的二維Otsu法選擇生長閾值，并進行區域生長，然后從分割出來的熒光信號圖像中獲取特征值，最后采用C-反應蛋白CRP（C-Reactive Protein）試條作為檢測對象，分析算法的分割精度以及對試條的定量檢測精度。

1　定量檢測原理

熒光免疫層析檢測試條結構如圖1所示。待測液通過層析作用向前移動，溶解結合墊上固化的熒光標記物后與之結合。當待測液移動至抗原的檢測帶時，待測物和試劑的復合物與之發生特異性結合后被截留，結合物在檢測線上富集，附著的結合物含量與樣品中待測物含量成線性關系。熒光物質在特定波長光的激發下，能產生一定波長的發射光。產生的發射光的強度與試條上富集的反應結合物數量具有相關性［5-6］。

由于熒光試條背景含熒光物質較少，所以被激發出的熒光較微弱。COMS光電圖像傳感器的光電轉換特性是線性的，當單色光入射到COMS光敏單元上時光敏單元的輸出信號I與入射光的強度成正比。由于COMS圖像傳感器采用等間隔均勻量化，所以圖像的灰度級正比于COMS對應的光敏單元的輸出信號［7］。熒光定量檢測主要依據：熒光強度F的值為

其中，φf為熒光α效率，I0為入射光強度，ic為流過平面光發光二極管（LED）的電流強度。α為I0與ic的比例系數，ε為物質溶液的摩爾吸光系數，c為待測溶液濃度，b為液層厚度。這就是熒光定量分析的理論公式。上式表明，在滿足待測物為均勻的稀溶液、氣體等，溶質分子間相互影響可以忽略不計時，且入射光為單色平行平面光。LED用恒流源供電，其電流強度ic為定值，熒光強度與被測物質的濃度成正比。因此可將檢測到的檢測線的像素灰度值之和除以質控線像素灰度值之和作為檢測結果。

圖1　免疫層析檢測試條結構圖

2　試條信號采集及預處理

本文采用面陣CMOS作為圖像采集裝置，如圖2所示。圖像采集裝置由波長375 nm的LED光源、CMOS圖像傳感器和透射波長（615±15）nm的濾光片組成。圖像傳感器用于采集經過濾光片的圖像信號，經過濾光片采集到的圖像信號如圖3所示。采集到的圖片由USB 2.0接口傳送到上位機，上位機對圖像進行處理得到表示試條濃度的特征值。

由于熒光圖像采集時會引入噪聲。這些噪聲會對熒光信號的提取以及對特征值的提取產生影響［8］，并且圖像目標和背景的對比度非常低，為了能成功的將圖像分割出來必須對原始圖像進行圖像增強，本文采用二維高斯低通濾波的方法對圖像進行增強。二維高斯低通濾波函數為如式（5）所示。D0為截止頻率，D（u，v）是距傅里葉變換平面原點的距離。令式中D0=80。對圖像進行增強。圖4為增強后的圖像。

圖2　熒光免疫層析試條圖像采集裝置

圖3　熒光免疫層析試條圖像信號

圖4　經過增強后的試條圖像

由于熒光試條檢測線和質控線的亮度比背景要高且檢測線和質控線占整幅圖像的面積不超過10%，假設在一幅熒光檢測圖像中圖像背景的灰度值不超過T，整幅圖像的像素數為n，灰度值不超過T的像素數為m，當m/n＜10%，且（m+1）/n＞10%時的T值作為分割閾值，進行預分割。

3　基于改進的區域生長算法

一般來說圖像分割就是將圖像按照顏色、強度、紋理等劃分為若干個特定的互不重疊的區域，并且從這些區域中提取感興趣的目標區域的技術和過程［9］。區域生長方法需要先選取生長種子點，在滿足一定的同質標準前提下，逐漸聚集種子點周圍的像點，形成一個漸漸增大的同質區域，直到所有滿足同質標準的點都被加到該區域中結束。該方法可以看作是一個連續的聚集過程，運行結果取決于圖像像素點的處理順序，優點是所得到的同質區域在空間上不僅相互關聯而且緊湊，缺點是可能造成過分割［10］。

本文選取檢測線和質控線的中間線作為邊界線，將試條圖像分為檢測線區域和質控線區域分別進行處理。首先必須選擇合適的種子點，由于試條的熒光信號波長是615 nm，鏡頭前的濾光片透射波長（615± 15）nm，所以在熒光物質富集的檢測帶和質控帶上，熒光信號亮度要普遍大于背景區域的亮度。針對該特征，我們采用3×3的矩陣去遍歷整個圖片，將矩陣內像素點的平均灰度值最大的區域的中間灰度作為區域生長的生長起點。然后，選用相鄰點閾值差法作為生長準則。設圖像中某一符合生長要求的點，記灰度值為f（x，y），當該點8連通區域的相鄰點f（x1，y1）的像素值與生長點之差小于某個閾值（threshold）時，則認為該點符合生長準則，判斷該點為新的生長起點。

式中，seed為種子點，t為選取的生長閾值。

由于增強后圖像的灰度直方圖的波峰和波谷不那么明顯。本文引入二維灰度直方圖的Otsu法。該方法不僅充分利用了圖像像素點的信息，而且考慮到了像素點與其鄰域的空間有相關信息，具有較好的抗噪性。本文采用論文［11］提出的改進二維Otsu法求取閾值t和s，其中t為原圖像的閾值，s為平滑后圖像的閾值。

對原圖像進行3×3領域平均平滑得到一平滑圖像，這一平滑圖像與原圖像構造出一個二維直方圖。二維直方圖上任意一點的值是pij，下標i和j表示二維直方圖的橫縱坐標，橫坐標為原圖像灰度統計值縱坐標為平滑后圖像的灰度統計值，該值表示圖像在原圖像灰度為i平滑圖像上灰度為j的概率。假設圖像被閾值對（s，t）分成C0和C1，其中C0為目標圖像C1為背景圖像，它們的概率分別是w0和wb，L為灰度值上限，計算公式如式（7）所示。

類內均值矢量m0和mb。分別為

二維Otsu法的類間方差的跡為

最佳閾值為

將求出的閾值分別作為平滑圖像和原始圖像的區域生長的閾值對圖像進行分割。分割結果如圖5所示。

圖5　圖像分割結果

4　實驗結果與分析

本文選用WP-UF500M相機采集圖像。光譜響應范圍350 nm～1 100 nm，曝光時間在0.038 ms～3 000 ms范圍可調，信噪比為38.1 dB，動態范圍70.1 dB。實驗采用TH-UV365T3WA-3535-B發光二極管作為激發光源。該發光二極管經過凸透鏡的聚焦后，在一定的圓形范圍內產生均勻的平面光。檢測設備實物圖如圖6所示。

圖6　檢測裝置實物圖

本文選取區域一致性測度UM和區域對比度CR［12］作為評價準則，其定義見式（13）～式（15）。

式中A為歸一化因子，這里指整幅圖像的像素數。

式中，f（x，y）為像素（x，y）的灰度值，mi為對應分割區Ri內的像素數，為方差，下標i等于1表示目標圖像方差為2表示背景圖像方差。

式中f0、fb分別為目標區域和背景區域的平均灰度級。CR取值范圍在0～1之間，CR越大目標與背景的對比度越大分割效果越好。不同濃度的熒光試條分割后的評價結果如表1所示。

表1　分割性能評價

表1顯示本文的分割算法比較理想，此外可以看出隨著試條熒光物質含量的升高，其檢測線和背景的灰度對比度會變得比較高，所以CR值也會變得比較高。

要實現定量檢測必須先求取特征值，本文將分割后檢測線的灰度值全部相加得到檢測線特征值t，將分割后質控線的灰度值全部相加得到質控線特征值c，將檢測線的特征值和控制線的特征值的比值t/c作為特征值。特征值與免疫層析標準試條的濃度成正比，反應了試條的濃度。由特征值t/c所表示的檢測結果見表2。

表2　6種濃度試條的特征值及重復性

實驗中檢測6種濃度的CRP試條，并選擇變異系數來判斷檢測結果效果的重復性。變異系數CV（variable coefficient）的定義如式（16）

其中，SD為所測樣本特征值的標準差，MN為所測樣本特征值的平均值。

從表2可以看出本文方法得到的CV值不超過5%，檢測結果的重復性較好。

選用ESE公司的Quant檢測儀作為參照來驗證本文的檢測精度。Quant對不同濃度的試條檢測得到的特征值如表3所示。

表3　Quant檢測不同濃度的試條得出的特征值

Quant檢測儀雖然檢測精確度高，但是量程有限，對表2中810 ng/mL和2 430 ng/mL兩種濃度試條檢測結果為超量程。本文選用濃度為10 ng/mL、30 ng/mL、90 ng/mL、270 ng/mL的4種試條驗證儀器的檢驗精度。圖7表示本文檢測結果與Quant檢測結果的相關性，R2＞0.98，具有很高的相關性。

圖7　本實驗特征值和Quant特征值的線性關系

進一步，挑選6種濃度試條的測量值均值進行刻度曲線擬合，擬合結果如圖8所示。

圖8　熒光信號特征值與濃度間的擬合曲線

線性關系為

式中，y為特征值t/c，x為待測液濃度，線性度R2＞0.99。實驗結果表明本文算法得到的特征值有較好的線性度。

5　結論

本文闡述了熒光免疫層析試條的定量檢測原理，設計了基于圖像采集法的熒光免疫層析試條定量檢測裝置，針對圖像檢測結果，提出了基于二維Otsu和區域增長算法的圖像分割和定量檢測方法。實驗結果顯示，本文研制系統檢測結果的變異系數CV不大于5%；刻度曲線的線性度為0.997 8；與Quant檢測儀的檢測結果相關性大于0.98，說明檢測精度良好。

同時，本文檢測裝置的測量范圍較Quant檢測儀更寬，具有更好的適用性。此外，由于本文采用的圖像檢測方法無需的試條傳動裝置，以及精確的試條定位裝置，簡化了儀器的加工流程和裝配工藝，且易于擴展到多通道試條檢測。

（注：由于通過圖像分割方法檢測熒光試條的研究較少，僅論文［8］采用圖像分割方法進行定量檢測。但該論文未對變異系數CV值做分析。本文所提出方法的變異系數、刻度曲線線性度，以及所測得的特征值與Quant檢測儀所測得的特征值的相關性均可與Quant檢測儀相比，且檢測范圍優于Quant。這些指標的獲得都是建立在前期良好的分割精度基礎之上。）

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高躍明（1982-），2010年于福州大學獲得博士學位，現為福州大學副研究員，主要研究方向為生物電子學等，fzugym@ 163.com；

伊騰增（1986-），男，福建福州人，現為福州大學碩士研究生，主要從事數字圖像處理方面的研究，1537582009@qq.com。

Fluorescent Immune-Chromatographic Strip Quantitative Detection Based on Two-Dimensional Otsu Method and Region Growth Algorithm*

GAO Yueming1，2*，YI Tengzeng1，2，WAI Mangi2，3，4，DU Min1，2，PUN Siohang4
（1.College of Physics and Information Engineering，Fuzhou University，Fuzhou 350116，China；2.Key Lab of Medical Instrumentation&Pharmaceutical Technology of Fujian Province，Fuzhou University，Fuzhou 350002，China；3.State Key Laboratory of Analog and Mixed Signal VLSI，University of Macau，Macau SAR，999078，China；4.Department of Electrical and Computer Engineering，Faculty of S&T，University of Macau，Macau SAR，999078，China）

Existing immunofluorescence chromatographic quantitative detection technology methods are mostly based on photoelectric reflex method.High precision for the strip position，and complex strip transmission unit are required in this method.In this paper，image of fluorescent immune-chromatographic strip was captured by the CMOS image sensor.A method for automatic recognition of test line and control line was proposed，In this method，seed points was chosen after the image was enhanced and initial segmented.Then the growth threshold was set via the improved two-dimensional Otsu method.Finally，the region growth algorithm was implemented to segment test line and control line.Experimental results showed that the algorithm could precisely segment the test line and con?trol line，and finally realized the quantitative detection of fluorescent immune-chromatographic strip.The experi?ments proved that the segmented test line and control line is clear，complete and had excellent performance，even in conditions of a low contrast or a changeable background.The proposed method indexes on quantitative evaluation of the segmentation result，such as Uniformity Measure（UM），Regional Contrast（CR），were both well.In the quantita?tively detect step，the coefficient variation of the measured characteristic values was less than 5%and the linearity was mare than 0.99.The experimental results shown that the method was feasible for the quantitative detection of fluorescent immune-chromatographic strip，and had wider detection limit than the comparing instrument.

fluorescent immune-chromatographic strip；image capture；region growth；two-dimensional Otsu；quan?titative detection

TP212.3

A

1004-1699（2016）09-1356-05

項目來源：科技部臺港澳合作項目（2012DFM30040）；福建省產學合作重大項目（2011Y4007）；福建省重大專項項目（2014YZ0001）

2015-12-23修改日期：2016-04-29