基于絲網印刷電極的阻抗型免疫傳感器用于檢測烯效唑

韋林洪劉 琳呂紅映滕鎮遠康慧敏王赪胤*胡效亞（揚州大學化學化工學院，江蘇省環境材料與環境工程重點實驗室，揚州 500）（揚州職業大學生物與化工工程學院，揚州 5009）

基于絲網印刷電極的阻抗型免疫傳感器用于檢測烯效唑

韋林洪1，2劉 琳1呂紅映1滕鎮遠1康慧敏1王赪胤*1胡效亞11
（揚州大學化學化工學院，江蘇省環境材料與環境工程重點實驗室，揚州 225002）2（揚州職業大學生物與化工工程學院，揚州 225009）

采用循環伏安法在絲網印刷碳電極表面電聚合聚苯胺/殼聚糖復合膜，利用靜電吸附作用固定烯效唑抗體，制備了檢測烯效唑的阻抗型免疫傳感器。采用循環伏安法和電化學阻抗譜對電極修飾過程進行了表征，并考察了緩沖溶液pH值、溫育溫度及時間對免疫反應的影響。在優化的條件下研究了免疫傳感器的性能。此免疫傳感器具有靈敏度高、特異性強、重現性和穩定性好的特點，對烯效唑的線性檢測范圍為0.01～100 mg/L，相關系數為0.999，檢出限為8 μg/L（3σ）。白菜樣品中添加0.05，0.10和1.0 mg/kg烯效唑，平均回收率為98.5%～104.6%，相對標準偏差為3.3%～4.3%，檢測結果與氣相色譜法的檢測結果相符。

免疫傳感器；電化學阻抗譜；烯效唑；絲網印刷電極

1 引言

烯效唑（Uniconazole）是20世紀80年代推出的一種高活性植物生長延緩劑和殺菌劑，廣泛用于果樹、蔬菜和大田作物等，以提高其品質和質量［1］，但由此導致的藥物殘留問題引起了人們的關注。日本肯定列表中規定烯效唑的最大殘留限量（MRL）為0.01 mg/kg［2］，我國《食品安全國家標準-食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763-2012）［3］規定糙米和小麥、花生仁、油菜籽中烯效唑的MRL分別為0.1和0.05 mg/kg。目前烯效唑殘留檢測研究較少，還沒有國家標準方法。因此，建立烯唑殘留檢測方法對于保護環境和農產品質量安全具有重要意義。

常用的烯效唑殘留檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［4］、液相色譜-質譜法（HPLC-MS）［2，5］、氣相色譜法（GC）［6］等。烯效唑及中間體相對分子質量較大、極性較強，采用GC分析時氣化溫度高，保留時間長，準確度差，但靈敏度高［7］。HPLC準確度、穩定性好，但靈敏度比GC稍低。HPLC-MS具有高特異性和高靈敏度，是目前廣泛應用的方法［8］。但上述方法需要昂貴的儀器和專業的操作人員，對樣品前處理要求高，分析時間長。張良等［9］建立了直接競爭酶聯免疫分析法（dc-ELISA）測定蘋果中的烯效唑，該法特異性強、靈敏度高、樣品前處理簡單，但需要對半抗原進行標記，且樣品基質、操作等因素會影響測定結果，易產生假陽性。因此，有必要建立簡便、快速、靈敏、特異性強的烯效唑檢測方法。

電化學免疫傳感器具有響應速度快、靈敏度高、特異性強、測定時不受樣品溶液顏色和濁度等因素的影響、攜帶方便等特點，是目前殘留分析技術的研究熱點。但常見的金電極、鉑電極和玻碳電極等價格較高，使用前需預處理，一旦損壞很難再生［10］。近年來，基于絲網印刷電極構建的免疫傳感器較好地解決了這些問題。絲網印刷電極（Screen-printed electrode，SPE）是集工作電極、參比電極、輔助電極為一體的可一次性使用的電極，具有制作簡便、可批量生產、成本低、便于攜帶、操作方便、樣品用量少等優點，避免了共用同一電極檢測多個樣本時的交叉干擾問題［11］，廣泛用于環境監測［12］、醫療診斷［13］和食品安全檢測［14］。

本研究利用聚苯胺的導電性和殼聚糖的生物相容性，在絲網印刷碳電極（SPCE）表面修飾聚苯胺/殼聚糖（PANI/CS）復合膜，通過靜電吸附作用固定抗體，制備了檢測烯效唑的阻抗型免疫傳感器，并成功用于白菜樣品的檢測。目前，尚未見電化學免疫傳感器用于烯效唑檢測的文獻報道。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Autolab PGSTAT30電化學工作站（荷蘭Ecochemie公司）；CHI832B電化學工作站（上海辰華儀器公司）；絲網印刷碳電極（SPCE，工作電極直徑4 mm，工作電極和輔助電極為碳電極，參比電極為Ag/AgCl電極，西班牙 DropSens公司）；KQ-50DA超聲波清洗機（昆山超聲波清洗機有限公司）；AR2140電子天平（德國梅特勒-托利多公司）；GC2010氣相色譜儀（日本島津公司），配ECD檢測器；Mixplus渦旋混合器（合肥艾本森公司）；HGC-12D氮吹儀（天津市恒奧科技發展有限公司）。

烯效唑單克隆抗體（Ab）由揚州大學環境科學工程學院提供；烯效唑（純度92%，江蘇七洲綠色化工股份有限公司）；殼聚糖（CS，分子量為20萬，脫乙酰度95%（國藥集團化學試劑有限公司）；卵清蛋白（OVA，生物純，西安生物有限公司）；其它試劑均為分析純；0.02 mol/L不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；實驗用水均為超純水（18.2 MΩ cm，Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司）。白菜購于當地市場。

2.2 免疫傳感器的制備

2.2.1 聚苯胺/殼聚糖膜的制備［15］將10 mL 0.2 mol/L苯胺溶液（1.9 mL苯胺，加100 mL 1 mol/L HCl溶解）與10 mL，0.1% 殼聚糖溶液（0.1 g殼聚糖溶于2 mL 0.05 mol/L pH 5的醋酸緩沖液，用超純水稀釋至100 mL）混合，超聲分散2 h，得到分散均勻的懸濁液。取15 μL分散均勻的苯胺/殼聚糖溶液滴在SPCE表面，以50 mV/s的速率在-0.2～0.9V循環掃描15圈，用超純水清洗電極，室溫下晾干，得到PANI/CS/SPCE電極。

2.2.2 烯效唑免疫傳感器的制備在PANI/CS/SPCE表面滴加0.5 mg/mL烯效唑抗體溶液10 μL，4℃放置12 h后用超純水洗滌，得到Ab/PANI/CS/SPCE電極，在其表面滴加5 mg/mL OVA溶液10 μL，37.5℃溫育30 min，用超純水清洗，制得免疫傳感器（OVA/Ab/PANI/CS/SPCE），4℃保存備用。

2.3 交流阻抗的測量在免疫傳感器工作電極表面加入10 μL不同濃度烯效唑標準溶液或樣品溶液，37.5℃下溫育90 min，取出依次用0.02 mol/L PBS（pH 7.0）和超純水洗滌。在含有0.2 mol/L KCl的5 mmol/L K3［Fe（CN）］6/K4［Fe（CN）6］溶液中測定電化學阻抗譜，頻率范圍0.1～105Hz，使用開路電位，正弦波電位的振幅為10 mV。

免疫反應前后阻抗的相對變化值（ΔRct）按下列公式計算：

其中，Rct（Ag-Ab）是烯效唑與烯效唑單克隆抗體結合后的阻抗值；Rct（Ab）是烯效唑抗體固定在電極表面后的阻抗值。

2.4 實際樣品的制備

準確稱取10 g粉碎的白菜樣品于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈，于渦旋振蕩器上高速（2500 r/min）振蕩2 min，過濾，收集濾液至裝有5 g NaCl的50 mL具塞量筒中，劇烈振蕩1 min，室溫下靜置15 min，使乙腈相和水相分層。移取10 mL乙腈相于20 mL刻度試管中，用氮氣吹至近干，用丙酮定容至1.0 mL，備用。

2.5 氣相色譜條件［7］

色譜柱：HP-5毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）。程序升溫：初始溫度120℃，保持2 min；以6℃/min升至300℃，保持5 min。進樣口溫度：260℃；檢測器溫度：320℃ ；流速：1.0 mL/min，尾吹：30 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

3 結果與討論

3.1 免疫傳感器制備與檢測原理

免疫傳感器的制備及檢測原理如圖1所示。首先在SPCE表面通過循環伏安法將苯胺電聚合生成聚苯胺（PANI）薄膜，同時CS被包裹其中形成PANI/CS復合膜。該復合膜富含氨基、成膜性好，在電極表面具有良好的粘附性。利用抗體與復合膜之間的靜電吸附作用將抗體固定到電極表面［16］，然后用OVA封閉PANI/CS復合膜上未吸附抗體的活性位點。檢測時，烯效唑與電極表面的抗體反應形成免疫復合物，阻礙了探針分子和SPCE表面的電子轉移，阻抗值變大，免疫反應前后阻抗的相對變化值（ΔRct）與樣品含量呈正相關。

圖1 基于絲網印刷碳電極的烯效唑免疫傳感器的制備與檢測示意圖Fig.1 Schematic illustration of fabrication process of screen-printed carbon electrode-based immunosensor and the analysis of uniconazole

3.2 免疫傳感器的電化學特性

3.2.1 循環伏安法（CV）表征免疫傳感器的電化學特性利用CV表征絲網印刷電極每一步修飾后的電化學特性，如圖2A所示。裸電極（曲線a）顯示了一對可逆性良好的氧化還原峰；當PANI/CS復合膜修飾到SPCE表面后，氧化還原峰電流有所降低（曲線b），這是由于PANI/CS復合膜抑制了電子轉移；當電極表面固定抗體、封閉OVA、烯效唑抗原與抗體的結合后，電極表面絕緣層逐漸增厚，如圖2A中曲線c，d，e所示，電極的氧化還原峰電流逐漸下降。以上結果表明，固定在電極表面的抗體和形成的免疫反應復合物有效地封閉電極表面，抑制氧化還原探針和電極間的電子傳遞。

3.2.2 電化學阻抗譜（EIS）表征EIS是研究電極修飾過程中電極表面變化的有力工具。電化學阻抗譜復平面圖中處于高頻部分的半圓部分對應于電子轉移的過程，半圓的直徑即電子轉移阻抗（Rct），可用來描述電極表面的界面性質；處于低頻部分的直線部分對應于電子擴散過程。圖2B顯示了SPCE每一步修飾過程的電化學阻抗圖譜，可以看出，裸SPCE的阻抗譜（曲線a）近似呈一條直線，說明SPCE表面的電子傳遞主要受擴散控制。當PANI/CS復合膜修飾到SPCE表面后（曲線b），Rct增大，這是因為PANI/CS復合膜阻礙了探針分子和電極表面間的電子轉移，導致阻抗值增大；當烯效唑單克隆抗體固定在PANI/CS/SPCE上（曲線c），Rct明顯增加，這是由于烯效唑單克隆抗體的大分子結構阻礙了電子的傳遞，另一方面，此結果也證明了烯效唑單克隆抗體被成功地固定到PANI/CS/SPCE；電極表面加入OVA后（曲線d），Rct值略有增加；但當加入烯效唑溶液后，Rct（曲線e）明顯增大，這是由于烯效唑與烯效唑抗體反應生成的免疫復合物覆蓋在電極表面，極大地阻礙了探針在電極表面的電子轉移。

3.3 免疫傳感器檢測條件的優化

取同一批次制備的免疫傳感器，按照2.3節的方法，對1 μg/mL烯效唑溶液（0.02 mol/L PBS）進行阻抗測定，考察溶液pH值、溫育溫度和時間對傳感器阻抗的相對變化值（ΔRct）的影響。

3.3.1 溶液pH值的影響取同一批次制備的免疫傳感器，分別檢測不同pH值的0.02 mol/L PBS配制、濃度為1 μg/mL的烯效唑溶液的阻抗值，結果如圖3A所示。在pH 5.5～7.0范圍內，ΔRct隨pH值增大而逐漸增大；在pH 7.0～8.5范圍內，阻抗值的相對變化值隨pH值增大而減小。故選擇免疫反應的最佳pH值為7.0。

圖2 不同修飾電極的循環伏安曲線（A）以及電化學交流阻抗譜（B）。掃描速度100 mV/s，阻抗測定的振幅為10 mV，探針溶液為含有0.2 mol/L KCl的5 mmol/L K3［Fe（CN）］6/K4［Fe（CN）6］溶液。（a）裸絲網印刷碳電極（SPCE），（b）聚苯胺/殼聚糖/絲網印刷碳電極（PANI/CS/SPCE），（c）烯效唑抗體/PANI/CS/SPCE（Ab/PANI/CS/SPCE），（d）卵清蛋白/Ab/PANI/CS/SPCE（OVA/Ab/PANI/CS/SPCE），（e）烯效唑/OVA/Ab/PANI/CS/SPC（Uniconazole/OVA/Ab/PANI/CS/SPCE）Fig.2 Cyclic voltammograms（A）and Nyquist plot（Zimvs Zre）for Faradaic impedance measurements（B）of modified SPCEs in 5 mmol/L K3［Fe（CN）］6/K4［Fe（CN）6］solution containing 0.2 mol/L KCl.（a），bare SPCE； （b）， PANI/CS/SPCE； （c）， Ab/PANI/CS/SPCE； （d）， OVA/Ab/PANI/CS/SPCE；（e），Uniconazole/OVA/Ab/PANI/CS/SPCE.Scan rate was 100 mV/s.Amplitude of applied potential in EIS was 10 mV

3.3.2 溫育溫度對免疫反應的影響傳感器阻抗的相對變化值與溫育溫度的關系如圖3B所示，在20℃～45℃范圍內，阻抗的相對變化值隨溫度升高先逐漸增大，在37.5℃時達到最大值，然后逐漸減小。因此，選擇37.5℃作為免疫反應的最佳溫育溫度。

3.3.3 溫育時間對免疫反應的影響傳感器阻抗的相對變化值與溫育時間的關系如圖3C所示。隨著溫育時間的延長，阻抗的相對值逐漸變大，當溫育時間達到90 min時，阻抗的相對變化值達到最大，說明免疫反應已進行完全。因此，選擇90 min作為免疫反應的最佳溫育時間。

圖3 緩沖溶液pH值（A）、溫育溫度（B）、溫育時間（C）對免疫反應的影響。緩沖溶液為0.02 mol/L磷酸緩沖液，烯效唑濃度為1 μg/mLFig.3 Effect of buffer pH value（A），incubation temperature（B）and incubation time（C）on immunoreaction between uniconazole and uniconazole antibody.The sample is 1 μg/mL uniconazole in 0.02 mol/L PBS buffer

3.4 免疫傳感器的性能

3.4.1 標準曲線用0.02 mol/L PBS（pH 7.0）配制不同濃度的烯效唑溶液，按2.3節方法測定阻抗值，其法拉第阻抗圖譜見圖4A。Rct即半圓的直徑，隨烯效唑濃度的增加而逐漸增大。以阻抗的相對變化值（ΔRct）為縱坐標，烯效唑濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線（圖4B），烯效唑濃度在0.01～100 mg/L范圍內與ΔRct（%）呈良好的線性關系，線性回歸方程為ΔRct（%）=112.78+35.4lgc，相關系數R=0.999，檢出限為8 μg/L（3σ）［17］。與文獻報道的其它方法（表1）相比，本方法線性范圍較寬，樣品前處理簡單，樣品用量少，操作簡便，樣品基質不干擾測定，無需標記，即可滿足烯效唑殘留限量分析的要求。

圖4 （A）不同濃度烯效唑與免疫傳感器反應的法拉第阻抗圖譜，a～e：0.01，0.1，1.0，10，100 mg/L；（B）烯效唑的標準曲線Fig.4 （A）Faradaic impedance spectra of immunosensor incubated with different concentrations of uniconazole measured in 5mmol/L K3［Fe（CN）］6/K4［Fe（CN）6］containing 0.2 mol/L KCl，curves a-e represent 0.01，0.1，1.0，10，100 mg/L uniconazole，respectively，（B）Calibration curve for uniconazole

表1 不同方法檢測烯效唑的比較Table 1 Comparison of different methods for detection of uniconazole

3.4.2 免疫傳感器的重現性和穩定性在白菜樣品中添加1.0 mg/kg烯效唑，取同一批次制備的6支免疫傳感器檢測，測定結果的相對標準偏差（RSD）為4.3%（n=6），說明傳感器重現性好。

將同一批次制備的免疫傳感器于4℃保存，每隔5天取出1支對濃度為1.0 mg/L烯效唑溶液進行檢測，結果表明，兩個星期內免疫傳感器的阻抗相對變化值沒有明顯改變；一個月后，阻抗的相對變化值變為原來的85.6%。因此，此免疫傳感器具有良好的穩定性。

3.4.3 免疫傳感器的特異性在1.0 mg/L烯效唑溶液（pH=7.0）中分別加入克百威、2，4-D丁酸、氰戊菊酯至終濃度為1.0，100和1000 mg/L，測定其阻抗值。結果表明，加入干擾物質后阻抗值變化較小，相對誤差小于6%，表明傳感器具有良好的特異性。

3.5 實際樣品分析

從本地不同超市、農貿市場隨機抽取8份白菜樣品，按2.4節方法制備樣品溶液，部分樣品溶液用0.02 mol/L PBS（pH 7.0）稀釋10倍后，采用EIS法測定，其余樣品溶液直接用GC法測定，結果表明：僅有1個樣品含有烯效唑，EIS和GC測得其殘留量分別為0.0155和0.0148 mg/kg，RSD分別為3.2% 和5.2%（n=3）。

選擇未檢出烯效唑的白菜樣品進行添加回收率實驗，EIS和GC的檢測結果見表2。由表2可知：兩種方法的檢測結果基本吻合，EIS的平均回收率為98.5% ～104.6%，GC的平均率為94.6% ～105.3%，表明本方法能夠滿足烯效唑殘留檢測的要求。

表2 白菜中烯效唑的回收率實驗結果Table 2 Average recovery of uniconazole in cabbage

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21375116 ）

An Impedance Immunosensor for Detection of Uniconazole Based on Screen Printed Electrode

WEI Lin-Hong1，2，LIU Lin1，Lü Hong-Ying1，TENG Zhen-Yuan1，KANG Hui-Min1，WANG Cheng-Yin*1，HU Xiao-Ya11（College of Chemistry and Chemical Engineering，Jiangsu Key Laboratory of Environmental Engineering and Materials，Yangzhou University，Yangzhou 225002，China）
2（College of Biological and Chemical Engineering，YangzhouVocational University，Yangzhou 225009，China）

Polyaniline/chitosan composite membrane was modified on the surface of a screen printed carbon electrode by cyclic voltammetry（CV），and then anti-uniconazole antibodies were immobilized on the electrode based on electrostatic attraction.The impedance immunosensor for the determination of uniconazole was thus constructed.CV and electrochemical impedance spectroscopy（EIS）were used to characterize the electrochemical properties of immunosensor.Several factors affecting the immunoreaction were investigated，including the pH of phosphate buffer saline（PBS），incubation temperature and time.The performance of the proposed immunosensor was investigated under the optimized conditions.The immunosensor exhibited advantages of high accuracy，high sensitivity and specificity，good reproducibility and stability.The immunosensor could detect uniconazole in a linear range of 0.01-100 mg/L（R=0.998），and the detection limit was 8 μg/L（3σ）.The average recoveries were 98.5%-104.6%and the relative standard deviations were 3.3-4.3%at the spiked level of 0.05，0.10 and 1.0 mg/kg in cabbage，and the detection results were consistent with the results obtained by gas chromatography.

Immunosensor；Electrochemical impedance spectroscopy；Uniconazole；Screen printed electrode

12 May 2015；accepted 18 November 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150391

2015-05-12收稿，2015-11-18接受

本文系國家自然科學基金（No.21375116）江蘇省高等職業院校國內高級訪問學者計劃資助項目（No.2014FX092）江蘇省環境材料與環境工程重點實驗室2014年度開放基金項目（No.K14019）資助項目

*E-mail：wangcy@yzu.edu.cn