細胞色素P4503A5和細胞色素P4502C19基因多態性對伏立康唑藥代動力學的影響

黃金梅，陳桂香，李志平，袁嬌

（1.廣東省東莞市第五人民醫院，廣東東莞523900；2.廣東省東莞市中醫院，廣東東莞523125）

細胞色素P4503A5和細胞色素P4502C19基因多態性對伏立康唑藥代動力學的影響

黃金梅1，陳桂香2，李志平1，袁嬌1

（1.廣東省東莞市第五人民醫院，廣東東莞523900；2.廣東省東莞市中醫院，廣東東莞523125）

目的分析細胞色素P450（CYP）3A5和CYP2C19基因多態性對伏立康唑藥代動力學的影響。方法用RFLP-PCR法對20名健康男性志愿者進行CYP3A5和CYP2C19全血基因分型。所有志愿者單次口服伏立康唑片200 mg，采用液-質串聯色譜法（LC-MS）測定志愿者不同時間點的血漿藥物濃度，用DAS 2.0軟件計算其藥代動力學參數。用主效應模型單獨分析CYP3A5和CYP2C19的半衰期（t1/2）、表觀清除率（CL/F）、血藥峰濃度（Cmax）、0～36 h藥時曲線下面積（AUC0-36），以及藥時曲線下總面積（AUC0-∞）。結果CYP3A5不同基因型伏立康唑的藥代動力學參數均無明顯差異（P＞0.05）；CYP2C19不同基因型的t1/2和Cmax均無顯著差異（P＞0.05），而CL/F，AUC0-36及AUC0-∞差異顯著（P＜0.05）；CYP2C19的CL/F，AUC0-36，AUC0-∞Scheffe法多重比較結果顯示，CYP2C19突變純合子的AUC0-36及AUC0-∞值顯著高于野生組及突變雜合組（P＜0.05），而CYP2C19突變純合子的CL/F值則明顯低于野生組（P＜0.05）。結論CYP 2C19的基因多態性對伏立康唑的藥代動力學有明顯影響，而CYP 3A5的基因多態性對伏立康唑的藥代動力學無明顯影響。

細胞色素P4503A5；細胞色素P4502C19；基因多態性；伏立康唑；藥代動力學

伏立康唑是目前臨床應用廣泛的第2代三唑類抗真菌藥物［1］，化學結構與氟康唑類似，但活性更強，抗菌譜更廣，且安全性高，尤其適用于治療免疫缺陷患者進行性、威脅生命的感染［2］。伏立康唑口服吸收率極高，生物利用度可達90%［3］，但藥代動力學在不同種族、不同個體間的差異極大。已有研究表明，同一種族中弱代謝者伏立康唑的血藥濃度比強代謝者平均高4倍［4］。由于伏立康唑是通過抑制細胞色素450（CYP450）依賴性的14α-羊毛甾醇去甲基酶的活性而發揮作用［5］，與代謝相關的CYP450酶系主要為CYP3A5、CYP2C19，以及少量的CYP2C9［6-7］。本研究中主要探究存在多種基因型的CYP3A5和CYP2C19對伏立康唑藥代動力學的影響，以期為臨床用藥提供一定的參考依據，現報道如下。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥

儀器：LCMS-8030型三重四極桿串聯質譜儀（日本島津公司）；Analyst 1.4.2數據處理軟件（美國Applied Biosystem公司）；Agilent 1200型高效液相色譜系統（美國Agilent公司）；Thremo超速冷凍離心機（美國熱電廣東一級代理銘科公司）；Bio-Rad PCR儀（美國Bio-Rad伯樂公司）；凝膠成像系統（上海培清公司）；DYY-7C電泳儀（北京六一儀器廠）；微量元素型實驗室專用超純水機（濟南海德水處理設備有限公司）。

試藥：伏立康唑片（北京博康健基因科技有限公司，批號為20140921，規格為每片50 mg）；伏立康唑原料藥（武漢英和制藥有限公司，純度大于99.0%，批號為20140627）；卡馬西平原料藥（內標，中國食品藥品檢定研究院，純度大于99.0%，批號為0142-953）；全血DNA抽取試劑盒購自Omega公司；SuperMix含DNTps和EasyTaqDNA聚合酶，以及反應緩沖液；DNA Marker（Invitrogen公司）；瓊脂糖粉（西班牙Biowest公司）；甲酸、乙腈、乙酸乙酯、甲酸等均為色譜純，購自韓國SK chemicals公司。

1.2試驗方法

1.2.1受試者選擇

20名男性受試者均為醫院的健康志愿者，平均年齡（22.28±1.66）歲，平均身高（171.23±3.64）cm，平均體重（61.55±5.31）kg，平均體重指數（22.13± 1.76）kg/m2，全面體格檢查（心電圖、血常規、肝腎功能）均正常。均簽署知情同意書，研究內容經醫院醫學倫理委員會批準，采血過程在試驗病房內完成。

1.2.2給藥方法與血樣采集

所有受試者禁食過夜12 h后，次日清晨空腹單次口服伏立康唑片200 mg，用200 mL溫水送服。給藥4 h后，統一標準飲食。給藥前0.5 h，所有受試者在前臂靜脈安置留置針，便于抽血。用藥后0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，6.00，12.00，24.00，36.00 h分別采集3.0 mL靜脈血，并迅速注入含有肝素的抗凝管中，超速冷凍離心機以3 000 r/min的速率離心10 min后，取上層血漿，做好標記后置-20℃冰箱保存備用。

1.2.3血漿樣品處理

取血漿樣品10 μL，加入甲醇-水（50∶50）10 μL，內標溶液（1 0 μg/L的氟康唑溶液）10 μL，再加入萃取劑乙醚-二氯甲烷（2∶1）1 mL，渦流混合5 min，以3 500 r/min的速率離心5 min，取上清液于37℃空氣流下吹干，殘渣加入流動相200 μL，溶解，取5 μL分析。

1.2.4液-質患聯色譜法（LC-MS）檢測

色譜條件：色譜柱為Shimadzu Pack VP-ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液=50∶50（V/V）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為5 μL。

質譜條件：質譜的離子化方式為電噴霧離子化（ESI）；正離子檢測方式（MRM）；噴元電壓4 200 V；加熱塊溫度300℃；碰撞氣壓力30 kPa，霧化氣壓力45 kPa；用于定量分析離子反應為伏立康唑（m/z）350.1→281.1，內標氟康唑（m/z）307.2→220.0。

1.2.5基因分型及PC條件RT

引物設計均由上海生工生物工程技術服務公司提供，基因分型有以下幾種。①CYP3A5：上游引物5＇-CATCAGTTAGTAGACAGATGA-3＇，下游引物（5＇-GGTCCAAACAGGGAAGAAATA-3＇）；②CYP2C19＊2：上游引物5＇-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3＇；下游引物5＇-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3＇；③CYP2C19＊3：上游引物5＇-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3＇，下游引物5＇-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3＇；④CYP2C19＊2：上游引物5＇-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3＇，下游引物5＇-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3＇。

PCR體系及酶切體系配制均按說明書準確操作。PCR體系：25 μL。；PCR反應條件：預變性95℃5 min，94℃變性30 s，退火溫度55℃（CYP3A5，CYP2C19），72℃延伸30 s，72℃再延伸5 min；2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

6986A/G位點（CYP3A5基因）PCR擴增產物的片段長度為293 bp，經限制內切酶SsPI-HF酶切后有3種基因型。①野生純合型（CYP3A5＊1/＊1，WT）：可經酶切后分為20，125，148 bp 3個片段；②突變純合型（CYP3A5＊3/＊3，HO）：可經酶切后分為125，168 bp 2個片段；③突變雜合型（CYP3A5＊1/＊3，HE）：可經酶切后分為125，148，168 bp 3個片段。

CYP2C19＊2突變則Smal內切酶的酶切位點消失，野生型CYP2C19則還存有酶切位點。故CYP2C19弱代謝型則只存在1條169 bp的條帶，CYP2C19強代謝型（EMs）則有49 bp和120 bp 2條帶。CYP2C19＊2野生型和突變雜合子（CYP2C19＊1/＊2）則有49，120，169 bp 3條帶。

1.3統計學處理

將測得的所有受試者用藥后的血藥濃度繪制成血藥濃度-時間曲線；用DAS 2.1軟件對測得的所有受試者的血藥濃度進行數據處理，并計算出主要藥代動力學參數；用SPSS 19.0統計軟件對CYP3A5及CYP 4502C19和伏立康唑的藥代動力學參數進行兩兩方差分析，觀察其交互作用，同時比較其差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1LC-MS檢測方法學考察結果

專屬性試驗：取6份來源不同的空白人血漿10μL，加入10.00μg/L的伏立康唑標準溶液10 μL；取受試者口服給藥后血漿樣品按1.2.3項下方法進行處理。在擬訂分析條件下，伏立康唑和內標氟康唑的保留時間分別為2.45 min和2.08 min。結果表明，空白血漿中對伏立康唑和內標氟康唑的測定無干擾（見圖1）。伏立康唑及內標藥物的保留時間在3～4 min，峰形良好，分離較完全。且人血漿中內源性雜質不會干擾樣品峰的檢測，基線噪音較小，可以進行后續試驗。

圖1　高效液相色譜圖

線性關系考察：取空白血漿10 μL，分別配制成10，50，200，500，1 000，3 000 μg/mL系列質量濃度的伏立康唑標準溶液，按照1.2.3項下方法進行血漿樣品處理后分別進樣。以待測物質量濃度（ρ）為橫坐標，以待測物與內標物峰面積比值（A）為縱坐標，用加權（W=1/X2）最小二乘法進行回歸運算，繪制標準曲線，得回歸方程A=1.217×10-3ρ+1.780×10-3，r=0.9998（n=6）。結果表明，伏立康唑標準溶液質量濃度在12.359～2761.92μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度與回收率試驗：取伏立康唑質量濃度為30，250，2 500 μg/L的質控樣品，重復進樣5次，連續測定3 d，根據當日的標準曲線計算日內、日間精密度及低、中、高各質量濃度回收率。結果見表1。

表1　血漿樣品中伏立康唑的精密度與回收率試驗結果（n=6）

穩定性試驗：將血漿樣品室溫放置24 h，3次反復冷凍-解凍循環、長期（30 d）置于-20℃環境，樣品試驗測定值與標示量的相對偏差均小于15%，表明血漿樣品穩定性良好。

2.2基因分型結果

CYP3A5基因分型：20名受試者經過RFLP-PCR后，其結果為3名CYP3A5＊1/＊1志愿者，占總數的15.00%；5名CYP3A5＊1/＊3志愿者，占總數的25.00%；12名CYP3A5＊3/＊3志愿者，占總數的60.00%。

CYP2C19基因分型：20名受試者經過RFLP-PCR后，其結果為7名CYP2C19＊1/＊1志愿者，占總數的35.00%；8名CYP2C19＊1/＊3或CYP2C19＊1/＊2志愿者，占總數的40.00%；5名CYP2C19＊2/＊3、CYP2C19＊2/＊2或CYP2C19＊3/＊3志愿者，占總數的25.00%。

2.3伏立康唑的藥代動力學及分析

用主效應模型單獨分析CYP3A5和CYP2C19的半衰期（t1/2）、表觀清除率（CL/F）、血藥峰濃度（Cmax）、0～36h藥時曲線下面積（AUC0-36）及藥時曲線下總面積（AUC0-∞）。CYP4503A不同基因型伏立康唑的藥代動力學參數均無顯著性差異（P＞0.05）；CYP2C19不同基因型的t1/2，Cmax無顯著性差異（P＞0.05），而CL/F，AUC0-36，AUC0-∞差異顯著（P＜0.05）。詳見表2和表3。

表2　CYP3A5的主因素單方差分析結果（±s）

表2　CYP3A5的主因素單方差分析結果（±s）

注：WT為野生純合型，HE為突變雜合型，HO為突變純合型。表3同。

參數t1/2（h）C L / F（L / h）Cmax（n g / m L）A U C0-36（n g · h / m L）A U C0-∞（n g · h / m L）W T 4 . 3 ± 2 . 4 5 5 . 1 ± 2 7 . 5 1 0 3 9 . 8 ± 4 7 . 9 9 4 0 9 3 . 0 ± 1 6 5 9 . 8 4 2 0 5 . 9 ± 1 6 9 8 . 5 H E 7 . 5 ± 1 . 9 3 5 . 4 ± 7 . 6 1 3 2 2 . 1 ± 1 2 8 5 . 5 5 4 7 6 . 7 ± 1 2 8 6 . 1 5 8 5 4 . 1 ± 1 2 7 7 . 6 H O 5 . 9 ± 2 . 9 4 8 . 4 ± 2 3 . 8 1 5 7 0 . 8 ± 5 6 0 . 0 4 9 1 0 . 1 ± 2 6 5 5 . 4 5 1 6 2 . 3 ± 2 7 7 1 . 6

表3　CYP2C19的主因素單方差分析結果（±s）

表3　CYP2C19的主因素單方差分析結果（±s）

注：與WT比較， P＜0.05；與HE比較， P＜0.05。

參數t1/2（h）C L / F（L / h）Cmax（n g / m L）A U C0-36（n g · h / m L）A U C0-∞（n g · h / m L）W T 6 . 3 ± 3 . 4 6 0 . 1 ± 2 3 . 5 1 2 3 9 . 8 ± 5 4 7 . 1 3 2 2 3 . 0 ± 9 6 9 . 8 3 6 7 0 . 4 ± 1 0 1 7 . 5 H E 6 . 2 ± 2 . 9 4 5 . 4 ± 1 9 . 6 1 3 5 2 . 1 ± 4 8 5 . 5 4 6 5 7 . 7 ± 1 6 2 8 . 1 4 8 5 5 . 1 ± 1 7 2 7 . 6 H O 5 . 9 ± 2 . 4 2 8 . 4 ± 6 . 8 1 8 0 7 . 5 ± 6 0 5 . 0 7 4 9 1 . 1 ± 2 2 4 5 . 5 7 7 6 2 . 3 ± 2 4 7 1 . 3 P值0 . 6 5 2 0 . 0 4 0 0 . 3 7 1 0 . 0 2 0 0 . 0 1 8

對CYP2C19的CL/F，AUC0-36，AUC0-∞用Scheffe法進行多重比較，結果顯示，CYP2C19突變純合子的AUC0-36及AUC0-∞值顯著高于野生組及突變雜合組（P＜0.05）；而CYP2C19突變純合子的CL/F值則明顯低于野生組（P＜0.05）。詳見表4。

表4　CYP2C19的CL/F、AUC0-36及AUC0-∞的多重比較

3　討論

藥代動力學是定量研究藥物在生物體內吸收、分布、代謝和排泄的規律，并運用數學原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規律的一門學科［8］。了解和掌握藥代動力學，對于提高藥物療效和安全性具有重要的臨床意義，可指導給藥劑量、給藥時間、給藥途徑的選擇，規避與其他藥物的不良相互作用［9］。

研究證實，影響藥物代謝的因素中，20%～95%的是由基因引起，非基因因素的作用是可變的，但遺傳因素卻恒定地影響人一生對藥物的反應［10］?；蚨鄳B性在生物群體中十分普遍，由于基因水平的變異，人體對疾病、毒物的易感性與耐受性各有不同，因此對藥物治療的反應也不相同［11］。伏立康唑主要依賴P450酶系中的CYP3A5和CYP2C19進行代謝，已有文獻報道，CYP3A5＊3會對多種藥物的代謝產生影響［12］，東方人體內CYP2C19慢代謝型的發生率為13%～25%［13］，這種變異的頻率是否足以導致酶功能改變而影響伏立康唑的藥代動力學值得探討。

本研究中用主效應模型單獨分析CYP3A5和CYP2C19的t1/2，CL/F，Cmax，AUC0-36和AUC0-∞。CYP3A5不同基因型伏立康唑的藥代動力學參數均無統計學差異，這與國外的研究結果相同［14］；CYP2C19不同基因型的t1/2和Cmax無顯著性差異，而CL/F，AUC0-36，AUC0-∞有顯著性差異，與國外相關報道結果一致［15］。對CYP2C19的CL/F，AUC0-36，AUC0-∞用Scheffe法進行多重比較，結果顯示，CYP2C19突變純合型的AUC0-36及AUC0-∞值顯著高于野生型和突變雜合型；而CYP2C19突變純合型的CL/F值則明顯低于野生型。因此，CYP2C19的基因多態性對伏立康唑的藥代動力學有較明顯的影響，而CYP3A5的基因多態性對伏立康唑的藥代動力學則無顯著影響。

由于本研究樣本量較少，CYP3A5和CYP2C19基因多態性對伏立康唑藥代動力學影響的研究還不夠全面，尚需增大樣本量研究，以為臨床的用藥提供更準確的依據。

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Influence of Gene Polymorphisms of Cytochrome P4503A5 and Cytochrome P4502C19 on the Pharmacokinetics of Voriconazole

Huang Jinmei1，Chen Guixiang2，Li Zhiping1，Yuan Jiao1
（1.Dongguan Fifth People′s Hospital，Dongguan，Guangdong，China523900；2.Dongguan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Dongguan，Guangdong，China523125）

ObjectiveToanalyze the influence of gene polymorphism of cytochrome P4503A5（CYP3A5）and CYP2C19 on the pharmacokinetics of voriconazole.M ethodsBy RFLP-PCR method，CYP3A5，CYP2C19 whole blood genotyping was carried out on 20 healthy male volunteers.All volunteers took a single oral dose of voriconazole tablets 200 mg，and the liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS）of plasma concentrations of volunteers at various points was determined，and DAS 2.0 software was used for calculating the pharmacokinetic parameters of drugs.Main effects model was used with a separate analysis on the half-life period（t1/2），the apparent clearance（CL/F），peak plasma concentration（Cmax），area under the curve at 0～36 h drug（AUC0-36）and The total area under the curve（AUC0-∞）of CYP3A5 and CYP2C19.ResultsDifferent CYP3A5 genotypes showed no significantly difference in pharmacokinetic parameters of voriconazole（P＞0.05）；different CYP2C19 genotypes showed no significant difference ont1/2，Cmax（P＞0.05），whileCL/F，AUC0-36andAUC0-∞showed significant differences（P＜0.05）；multiple comparison method onCL/F，AUC0-36，AUC0-∞Scheffeof CYP2C19showed，AUC0-36andAUC0-∞valuesof CYP2C19mutationsweresignificantlyhigher than homozygous wild group and heterozygous mutation group（P＜0.05），whileCL/F value of CYP2C19 mutant homozygotes was significantly lower than wild group（P＜0.05）.ConclusionGene polymorphism of CYP2C19 has a significant effect on voriconazole pharmacokinetic process；while gene polymorphism of CYP3A5 has no obvious influence on voriconazole pharmacokinetic process.

cytochrome P4503A5；cytochrome P4502C19；gene polymorphism；voriconazole；pharmacokinetics

R969．1；R978．5

A

1006－4931（2016）16－0063－04

（2016－02－10；

2016－04－29）