融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發的皮炎小鼠模型的影響

方富民 焦晴晴 朱婷婷 陸一楓 葉麗彩 錢齊宏

215006蘇州大學附屬第一醫院皮膚性病科

·論著·

融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發的皮炎小鼠模型的影響

方富民 焦晴晴 朱婷婷 陸一楓 葉麗彩 錢齊宏

215006蘇州大學附屬第一醫院皮膚性病科

目的 探討單純皰疹病毒侵入介質配體信號通路LIGHT-HVEM阻斷劑LTβR-Fc融合蛋白對卵清蛋白誘發的特應性皮炎小鼠模型的影響。方法 將BALB/c小鼠隨機分為空白對照組（以100 μl生理氯化鈉溶液進行刺激）、模型組（將100 μg卵清蛋白溶于100 μl生理氯化鈉溶液中進行刺激）以及阻斷劑組（在卵清蛋白致敏前24 h將100 μg LTβR-Fc溶于100 μl生理氯化鈉溶液作為阻斷劑進行刺激），在開始致敏后第0、4、8、12、15、20、23、27、31、34天分別對各組實驗小鼠進行病情嚴重程度評分，同時測量記錄皮損面積大小，最后于造模結束時行眼眶取血并提取血清，處死各組小鼠，首先分別采用RT-PCR法和ELISA法檢測小鼠皮損和脾細胞上清液內干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素（IL）-4和IL-5的mRNA和蛋白的表達情況，隨后采用ELISA方法檢測血清內卵清蛋白特異性以及總IgE和IgG1的表達水平。結果 LTβR-Fc顯著抑制了卵清蛋白誘發的皮炎小鼠模型的炎癥反應。與模型組相比，阻斷劑組小鼠皮損面積顯著減少（P<0.05），濕疹面積與嚴重度指數（EASI）評分降低（P<0.05）。皮炎小鼠模型組與阻斷劑組小鼠皮損處IL-4 mRNA（1.81±0.25比0.88±0.25，P<0.05）、IL-5 mRNA（1.24± 0.26比 0.75± 0.15，P<0.05）、IFN-γ mRNA（1.11± 0.19比 0.62 ± 0.09，P<0.05）水平差異均有統計學意義，脾細胞上清液中IL-4蛋白（20.12±5.39比9.58±1.44，P<0.05）、IL-5蛋白［（22.77±4.07）ng/L 比（11.37 ± 2.02）ng/L，P<0.05）］、IFN-γ 蛋白［（23 930 ± 44.20）ng/L 比（16167 ± 950.40）ng/L，P<0.05）］水平差異亦具有統計學意義。經LTβR-Fc處理后，特應性皮炎小鼠模型血清內總IgE和卵清蛋白特異性IgE水平較模型組顯著下降，IgG1的表達均顯著下調。結論 融合蛋白LTβR-Fc可通過阻斷LIGHT-HVEM信號通路顯著緩解卵清蛋白誘發的皮炎小鼠的臨床癥狀，提示LIGHT-HVEM信號通路可作為治療皮炎（特應性皮炎）的潛在靶點。

皮炎，特應性；模型，動物；卵白蛋白；T淋巴細胞，輔助誘導；白細胞介素類；干擾素γ；LIGHTHVEM信號通路

特應性皮炎（AD）是一種慢性炎癥性皮膚病，T細胞的過度激活在其發病機制中扮演重要角色。在AD的急性期以Th2型細胞為主，而在AD的慢性期則以Th1型細胞為主［1］。T細胞的激活主要是通過T細胞受體（TCR）和主要組織相容性復合體、輔助分子或共刺激分子的結合實現，因此，共刺激分子受體-配體結合在T細胞的激活、增殖、分化和凋亡過程中扮演著重要角色［2］。針對共刺激分子受體-配體結合的治療策略不僅可用于預防急性移植免疫排斥，還可以用于維持自身免疫抑制［3］，對變應性、炎癥性皮膚病的治療同樣具有重要的臨床意義。單純皰疹病毒侵入介質配體（LIGHT，或稱TNFSF14，HVEML）是近期發現的腫瘤壞死因子（TNF）配體超家族的成員之一，參與許多炎癥性疾病的發病進程，其受體為單純皰疹病毒侵入介質（HVEM，也可稱為 TNFRSF14 或 LIGHTR）［4］，主要表達在激活的T細胞上。研究表明，LIGHT參與類風濕性關節炎、強直性脊柱炎以及炎癥性腸病的發病進程，可望成為上述疾病新的治療靶點［5-6］。AD患者外周血血清中LIGHT的表達水平較正常健康對照者顯著上調，且與患者血清內IgE水平和濕疹面積與嚴重度指數（eczema area and severity index，EASI） 評分顯著相關［7］。我們擬通過觀察LIGHT-HVEM信號通路阻斷劑對卵清蛋白誘發的皮炎小鼠的影響，進一步研究LIGHT在AD發病機制中的作用，為LIGHT-HVEM信號通路作為AD的治療靶點提供理論支持。

材料和方法

一、實驗動物及材料

BALB/c小鼠（6～8周齡，雌性，合格證號：2013001801706）來自上海斯萊克實驗動物有限公司，卵清蛋白（V級）產自美國Sigma公司，斑試器產自北京百億怡達科技開發有限公司，融合蛋白LTβR-Fc產自美國Bethyl公司，RNA抽提試劑盒產自上海捷瑞生物工程有限公司，抗鼠IgG1、IgG2a和IgE單克隆抗體產自英國Abcam公司，小鼠干擾素（IFN）-γ、白細胞介素（IL）-4和 IL-5酶聯免疫檢測試劑盒（ELISA Kit）產自南京凱基生物科技發展有限公司，小鼠血清IgE和IgG1 ELISA試劑盒產自北京百奧萊博科技有限公司，RPMI 1640細胞培養基和胎牛血清均產自美國Gibco BRL公司，IFN-γ、IL-4和IL-5引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，細胞培養板均產自美國Becton Dickinson公司。

二、AD小鼠模型的建立和干預

于SPF級別環境下飼養BALB/c小鼠，12 h日夜更替，室溫24～25℃，濕度5%～10%，自由進食。30只小鼠，隨機分成3組，每組10只。實驗設空白對照組、模型組以及阻斷劑組，實驗前24 h剔除小鼠背部毛發，膠帶在除毛部位反復粘貼8次?？瞻讓φ战M：以100 μl生理氯化鈉溶液進行刺激；模型組：將100 μg卵清蛋白溶于100 μl生理氯化鈉溶液中進行刺激；阻斷劑組：在每次卵清蛋白致敏前以及更換斑試器前24 h，預先以100 μg阻斷劑LTβR-Fc溶于100 μl生理氯化鈉溶液預處理小鼠。刺激與預處理過程除所用溶液成分不同外，其余步驟相同。將含不同成分的生理氯化鈉溶液滴在8 mm大圓形斑試器中的濾紙片上,隨后將斑試器用繃帶固定于背部，每2～3 d更換斑試器，1周后取下，間隔2周重復1次上述致敏和阻斷過程，共致敏3次，計7周。采用EASI方法每周進行臨床評分，評分標準：輕度（0～24分），中度（25～50分）和重度（51～ 103分）［7］。造模結束后，在 24 h內處死小鼠，按照實驗要求切取皮損，凍于液氮內；于超凈臺內摘取脾臟，制成單細胞懸液。

三、RT-PCR法檢測皮損處IFN-γ、IL-4和IL-5 mRNA的表達

按照RNA抽提試劑盒說明書抽提皮損標本總RNA，配制逆轉錄反應液，建立20 μl反應體系，用DNA擴增儀進行逆轉錄合成cDNA，采用熒光實時定量PCR檢測IFN-γ、IL-4和IL-5 mRNA的表達（以GAPDH為內參照），引物以及PCR反應條件均參考既往文獻［8-9］設計，反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線，以驗證產物的特異性，另將反應產物行瓊脂糖凝膠電泳再次確認所擴增DNA片段的單一性。由系統自動生成試驗數據，采用2-△△Ct法進行數據分析，以2-△△Ct值代表相應細胞因子mRNA的表達量。每例標本設3個復孔。

四、ELISA檢測小鼠血清中總IgE和IgG1的表達水平

按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中總IgE和IgG1以及卵清蛋白特異性IgE和IgG1的表達水平。根據標準曲線直線回歸方程以及樣本450 nm處吸光度A值，計算樣本實際濃度。

五、ELISA法檢測IL-4、IL-5和IFN-γ蛋白表達水平

分離空白對照組、模型組以及阻斷劑組小鼠脾臟，分別制成脾臟單細胞懸液重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640溶液內，以2×106/ml細胞密度種在24孔板內（預先以抗CD3單克隆抗體包被，1 mg/L），孵育6 h后離心收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測IL-4、IL-5和IFN-γ水平。

六、數據分析

用SPSS 19.0統計軟件包進行統計分析。計量資料的數據以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），Bonferroni檢驗進行多重比較，P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠皮膚炎癥反應

造模結束后，肉眼觀察模型組和阻斷劑組小鼠背部接觸斑試器部位皮膚均出現不同程度炎癥反應，表現為紅斑、鱗屑以及少許結痂。模型組紅斑和鱗屑表現較阻斷劑組嚴重，空白對照組未見明顯皮損（圖1）。與模型組相比，阻斷劑組皮損面積在開始致敏后第27、31以及34天顯著降低（均P<0.05，圖 2），EASI評分在第 23、27、31 天顯著降低（均 P<0.05，圖 3）。

圖1 各組小鼠開始致敏后第34天皮膚表現 每組3只小鼠。模型組小鼠背部接觸斑試器部位皮膚均出現明顯的炎癥反應，表現為紅斑、鱗屑以及少許結痂，而阻斷劑組紅斑和鱗屑較模型組明顯減輕，空白對照組未見明顯皮損

圖2 各組小鼠皮損面積隨時間變化比較 a：模型組與阻斷劑組比較，P<0.05

圖3 各組小鼠濕疹面積與嚴重度指數（EASI）評分隨時間變化比較a：模型組與阻斷劑組比較，P<0.05

表1 皮炎小鼠皮損處白細胞介素（IL）-4、IL-5和干擾素γ（IFN-γ）mRNA表達及脾細胞上清液內3種細胞因子蛋白表達水平（±s，ng/L）

表1 皮炎小鼠皮損處白細胞介素（IL）-4、IL-5和干擾素γ（IFN-γ）mRNA表達及脾細胞上清液內3種細胞因子蛋白表達水平（±s，ng/L）

注：n=10。a：與空白對照組比較，P<0.05；b：與阻斷劑組比較，P<0.05

組別 皮損脾細胞上清液IL-4 mRNA IL-5 mRNA IFN-γ mRNA IL-4 IL-5 IFN-γ模型組 1.81±0.25ab 1.24±0.26ab 1.11±0.19ab 20.12±5.39ab 22.77±4.07ab 23 930±4 419.69ab阻斷劑組 0.88±0.25a 0.75±0.15a 0.62±0.09a 9.58±1.44a 11.37±2.02a 16 166.67±950.40a空白對照組 0.51±0.07 0.47±0.03 0.37±0.11 3.93±1.72 5.01±0.69 130±17.09 F值 105.295 49.838 73.596 59.428 115.002 216.244 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

二、LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠皮損處和脾細胞上清液內IL-4、IL-5和IFN-γ表達

RT-PCR檢測結果顯示，與空白對照組相比，模型組皮損處 IL-4、IL-5、IFN-γ mRNA表達水平顯著上調，而阻斷劑組皮損處IL-4、IL-5和IFN-γ mRNA的表達水平相對于模型組則顯著下調（均P<0.05，表1）。與空白對照組相比，模型組脾細胞上清液內IL-4、IL-5和IFN-γ表達水平亦顯著上調，而阻斷劑組脾細胞上清液內上述3種細胞因子的表達水平相對于模型組亦顯著下調（均 P<0.05，表 1）。

三、LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠血清內總IgE和IgG1以及卵清蛋白特異性總IgE和IgG1的表達

結果顯示，與空白對照組相比，模型組血清內總IgE和IgG1的表達水平顯著上調。阻斷劑組血清內總IgE和IgG1的表達水平相對于模型組顯著下調（均P<0.05，表2）。此外，與空白對照組相比，模型組血清內卵清蛋白特異性IgE和IgG1的表達水平亦顯著上調，而阻斷劑組相對于模型組則顯著下調（均 P<0.05，表2）。

討 論

表2 融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發的皮炎小鼠血清內總的和卵清蛋白特異性的IgE和IgG1表達的影響（±s，μg/L）

表2 融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發的皮炎小鼠血清內總的和卵清蛋白特異性的IgE和IgG1表達的影響（±s，μg/L）

注：n=10。a：與空白對照組比較，P<0.05；b：與阻斷劑組比較，P<0.05

組別 總IgE 總IgG1 卵清蛋白特異性IgE卵清蛋白特異性IgG1模型組 32 277.00±407.53ab 2 323.33±502.43ab 0.84±0.11ab 0.86±0.07ab阻斷劑組 27 446.67±2 052.64a 1 296.33±32.72a 0.46±0.10a 0.62±0.10a空白對照組 1 967.00±85.49 206.67±12.06 0 0 F值 1 813.699 132.510 234.224 393.095 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

本研究中我們發現，LTβR-Fc這一阻斷LIGHT-HVEM信號通路的融合蛋白顯著抑制了卵清蛋白誘發的皮炎小鼠模型的皮膚炎癥反應，降低了其皮損面積以及EASI評分；此外，LTβR-Fc亦顯著下調了皮炎小鼠模型皮損處和脾臟內IFN-γ、IL-4和IL-5的表達以及血清內卵清蛋白特異性和總IgE以及IgG1的表達水平。上述結果提示，LIGHT可以作為治療皮炎，尤其是AD的潛在靶點。

以往研究表明，LIGHT不僅參與T細胞增殖和活化，還在抗原激活記憶性Th細胞的維持以及適應性免疫反應過程中發揮重要作用［10］。有研究者認為，以被抗原激活的T細胞為靶點的治療策略對炎癥性疾病是非常有效的［4］。近期有研究表明，阻斷LIGHT-HVEM信號通路能顯著抑制哮喘小鼠模型記憶性Th2細胞數量的上調，并與其炎癥反應的下調顯著相關［11］。此外，在嗜酸性食管炎患者中，LIGHT和HVEM的表達顯著上調，并可能通過轉化生長因子β依賴機制導致組織壞死［12］。而小鼠模型實驗結果顯示，阻斷或清除LIGHT-HVEM信號通路可導致小鼠對利什曼蟲感染易感性上升，表明LIGHT-HVEM信號通路在樹突細胞以及淋巴細胞介導的免疫反應中起重要作用［13］。我們的研究表明，以融合蛋白LTβR-Fc阻斷LIGHT-HVEM信號通路顯著抑制卵清蛋白誘發的皮炎小鼠模型的皮膚炎癥反應。我們的發現為共刺激分子網絡信號通路以及蛋白類藥物在變應性、炎癥性疾病中作為研發靶點提供了新的依據。

除了患者皮損面積以及EASI評分之外，Th1和Th2細胞因子表達失衡，患者血清內IgE和IgG1的表達上調也是AD患者常見的表現［14］。目前研究發現，在AD小鼠模型中，IL-4可誘導B細胞產生合成IgE，募集嗜酸性粒細胞至皮損處；IL-5是嗜酸性粒細胞分化和激活的必要條件之一；而IFN-γ則在AD慢性期的炎癥反應中發揮重要作用［15］。我們的研究結果顯示，LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠模型皮損處和脾臟內IFN-γ、IL-4和IL-5的表達，并下調血清內IgE和IgG1的表達。

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Effects of a fusion protein LTβR-Fc on ovalbumin-induced dermatitis in a mouse model

Fang Fumin,Jiao Qingqing,Zhu Tingting,Lu Yifeng,Ye Licai,Qian Qihong

Department of Dermatovenereology,First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China

Objective To evaluate effects of a fusion protein LTβR-Fc,which can block the herpesvirus entry mediator ligand（LIGHT-HVEM）signaling pathway,on ovalbumin-induced dermatitis in a mouse model.Methods Thirty BALB/c mice were randomly and equally divided into 3 groups:blank control group treated with 100 μl of sodium chloride physiological solution,model group sensitized with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg ovalbumin,blocker group firstly blocked with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg LTβR-Fc followed by sensitization with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg ovalbumin at 24 hours after the blocking.Disease severity was evaluated by eczema area and severity index（EASI）score,and lesional size was measured on day 0,4,8,12,15,20,23,27,31 and 34 after the first sensitization.A total of three sessions of sensitization were carried out.At the end of treatment,all the mice were sacrificed after serum was obtained from their orbital cavities.Thereafter,tissue specimens were obtained from skin lesions,and single cell suspensions of the spleen were prepared.RT-PCR was performed to detect mRNA expressions of interferon γ （IFN-γ）,interleukin 4 （IL-4）and IL-5 in murine lesions,ELISA to measure IFN-γ,IL-4 and IL-5 levels in culture supernatants of murine splenocytes,as well as ovalbumin-specific and total IgE and IgG1 levels in murine sera.Results LTβR-Fc significantly suppressed inflammatory response in the mouse model of dermatitis induced by ovalbumin.Compared with the model group,the blocker group showed significantly decreased lesion area and EASI score （bothP<0.05）.In addition,a significant decrease was observed in the mRNA expressions of IL-4（0.88±0.25 vs.1.81±0.25,P＜0.05）,IL-5（0.75±0.15 vs.1.24±0.26,P＜0.05）and IFN-γ （0.62±0.09 vs.1.11±0.19,P＜0.05）in murine lesions,and in supernatant levels of IL-4（9.58±1.44 ng/L vs.20.12±5.39 ng/L,P＜0.05）,IL-5（11.37±2.02 ng/L vs.22.77±4.07 ng/L,P＜0.05）and IFN-γ （16 167±950.40 ng/L vs.23 930±44.20 ng/L,P＜0.05）in the blocker group compared with the model group.The serum levels of both total IgE and ovalbumin-specific IgE were significantly lower in the blocker group than in the model group（total IgE:27 466.67 ± 2 052.64 μg/L vs.32 277 ± 407.53 μg/L,P ＜ 0.05;ovalbumin-specific IgE:1 296.33 ±32.72 μg/L vs.2 323.33 ± 502.43 μg/L,P ＜ 0.05）,so were those of total IgG1 （0.46 ± 0.11 μg/L vs.0.84 ± 0.11 μg/L,P ＜ 0.05）and ovalbumin-specific IgG1 （0.62 ± 0.11 μg/L vs.0.86 ± 0.07 μg/L,P ＜ 0.05）.Conclusion The fusion protein LTβR-Fc can alleviate symptoms of ovalbumin-induced dermatitis in the mouse model likely by suppressing the LIGHT-HVEM signaling pathway,suggesting that this signaling pathway may serve as a target for the treatment of dermatitis（such as atopic dermatitis）.

Dermatitis,atopic;Models,animal;Ovalbumin;T-lymphocytes,helper-inducer;Interleukins;Interferongamma;LIGHT-HVEM

Qian Qihong,Email:qqihong@126.com

錢齊宏，Email：qqihong@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.010

國家自然科學基金（81402597）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81402597）

2015-04-04）

（本文編輯：尚淑賢）