貫葉金絲桃提取過程中黃酮類成分含量變化規律研究

唐小龍，羅旭，王小林，楊宋琪，陳海燕，柯瀟

（四川濟生堂藥業有限公司，四川成都610041）

貫葉金絲桃提取過程中黃酮類成分含量變化規律研究

唐小龍，羅旭，王小林，楊宋琪，陳海燕，柯瀟

（四川濟生堂藥業有限公司，四川成都610041）

目的研究貫葉金絲桃提取過程中黃酮類成分變化規律，建立其含量變化與提取時間的關系。方法色譜柱采用Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，測定貫葉金絲桃提取過程中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的含量。結果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷在70%乙醇和水提取過程中穩定，15 min達到峰值，后趨于穩定。槲皮素在水提取過程中穩定，15 min達到峰值，后趨于穩定；在70%乙醇提取過程中，緩慢增加，6 h達到峰值。結論貫葉金絲桃在提取過程中黃酮類成分穩定，70%乙醇提取受熱過程中，穩定性優于水提取。

貫葉金絲桃；提??；黃酮類成分；變化規律

貫葉金絲桃為藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分，原產于歐亞大陸，分布于我國湖北、四川、貴州、陜西、甘肅、湖南、新疆、山西、河南、江西、江蘇、山東等地。貫葉金絲桃性平，味辛苦澀，具有疏肝解郁、清熱利濕、消腫痛的功效。貫葉金絲桃醇提取物主要有萘并二蒽酮類、間苯三酚類、黃酮類、雙黃酮類、苯丙烯酸類和花青素等成分，少量的單寧酸、氧雜蒽酮、揮發油和氨基酸等。黃酮類成分是貫葉金絲桃抗抑郁癥的主要有效成分之一，具有較好的生理活性，對中、輕度抑郁癥有效，且不良反應較傳統的化學抗抑郁藥物輕微，主要化合物為蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素等［1-16］。本研究中分析了貫葉金絲桃提取過程中黃酮類成分的變化規律，為臨床應用提供參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括四元泵、紫外檢測器、柱溫箱、自動進樣器、工作站）；Sartorius BP-211D型電子天平（德國賽多利斯）；美國Milli-Q型純水器。

1.2試藥

試驗藥材購于甘肅禮縣，由成都康弘藥業集團國家企業技術中心葉亮教授鑒定為藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分；蘆丁對照品（批號100080-201409，供含量測定用，91.9%），金絲桃苷對照品（批號111521-201406，供含量測定用，92.5%），異槲皮苷對照品（批號111809-201403，供含量測定用，92.9%），槲皮素對照品（批號100081-201408，供含量測定用，99.1%），均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為超純水；其余試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動相：0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～25 min時84%～84%A，25～40 min時84%～35%A；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；進樣量：5 μL。在此條件下，色譜圖見圖1。

2.2溶液制備

取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁76.30 μg、金絲桃苷57.86 μg、異槲皮苷60.12 μg、槲皮素71.59 μg的混合溶液，即得對照品溶液。

圖1　高效液相色譜圖

取貫葉金絲桃藥材50 g，分別置1 L圓底燒瓶中，加70%乙醇或水0.5 L，加熱回流提取，保持微沸狀態，分別于0，0.25，0.5，1，2，4，6，8 h取樣2 mL，立即冰水浴冷卻，并分別補加2 mL 70%乙醇或水，以3 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3方法學考察

線性關系考察：精密量取含0.323 5 g/L蘆丁、0.2322g/L金絲桃苷、0.3214g/L異槲皮苷、0.3439 g/L槲皮素混合對照品溶液0.5，1，2.5，5，10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻。分別吸取5 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的進樣量（X，μg）為橫坐標，以其峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸。結果見表1。

表1　黃酮類成分線性關系試驗結果

精密度試驗：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素混合對照品溶液，按擬訂色譜條件測定，連續進樣6次，記錄峰面積。結果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的RSD分別為0.07%，0.11%，0.24%，0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

表2　黃酮類成分加樣回收試驗結果（n=6，%）

重復性試驗：取貫葉金絲桃0.25 h 70%乙醇提取液6份，按供試品制備方法制備，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積。結果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的RSD分別為1.03%，0.50%，0.42%，1.17%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取2.2項下貫葉金絲桃0.25 h 70%乙醇提取液供試品溶液，室溫放置0，2，4，8，12，24 h后，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積。結果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的RSD分別為0.38%，0.26%，0.30%，0.51%（n=6），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

加樣回收試驗：按2.2項下貫葉金絲桃供試品制備方法，取貫葉金絲桃0.25 h 70%乙醇提取液，共6份，冷卻后分別加入一定量的混合對照品，依法測定，結果見表2。

2.4含量測定

按擬訂色譜條件，分別測定貫葉金絲桃各提取液蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素的含量。結果見表3和圖2。

表3　70%乙醇提取液和水提取液含量測定結果（%，n=2）

圖2　貫葉金絲桃提取過程中變化規律

3　討論

3.1提取成分選擇

貫葉金絲桃提取主要有醇提和水提兩種提取方式，主要考察了70%乙醇和水作為溶劑提取過程中黃酮類成分的變化規律。黃酮類成分主要有蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等，故考察了4種黃酮類成分的變化規律。

3.2提取時間選擇

貫葉金絲桃70%乙醇提取過程中，除槲皮素外，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷15 min內迅速升高，后趨于穩定。槲皮素緩慢增加，6 h趨于穩定。由圖2可見，貫葉金絲桃黃酮類成分70%乙醇提取過程中溶出迅速，受熱過程相對穩定。貫葉金絲桃水提取過程中，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素15 min內迅速升高，達到頂峰，后趨于穩定，2 h后略有降低。由圖2可見，貫葉金絲桃黃酮類成分水提取過程中溶出迅速，受熱過程中，穩定性比70%乙醇過程中較差。

3.3供試溶液處理

貫葉金絲桃70%乙醇和水提取離心和0.45 μm濾膜過濾后直接注入液相色譜儀測定，由圖1可知，貫葉金絲桃提取液分離效果良好，可直接進樣。

［5-13］，本試驗經進一步優化，建立了HPLC法同時測定貫葉金絲桃中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素4種黃酮類成分含量的方法，方法簡便、可行。

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Study on the Variation Patterns of Flavonoids inHypericum PerforatumL.at Different Decocting Time

Tang Xiaolong，Luo Xu，Wang Xiaolin，Yang Songqi，Chen Haiyan，Ke Xiao
（Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan，China610041）

ObjectiveTo study on the variation patterns of the flavonoids in Hypericum Perforatum L.at different decocting time and to establish the relationship between the content and extraction time.MethodsThe Agilent C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）was used，0.1%phosphoric acid（A）and acetonitrile（B）as mobile phase，gradient elution，to determine the extract content o rutin，hyperoside，isoquercitrin，quercetinHypericum Perforatum L.ResultsRutin，hyperoside and isoquercitrin in 70%ethanol and water extraction process of stability，reached a peak of 15 min and then tended to be stable；quercetin in water extraction process of stable for 15 min，reached a peak and then tended to be stable.In the 70%ethanol extraction process，slowly increased，peaked at 6h.ConclusionHypericum perforatum L.in the extraction process of flavonoids in stable，70%ethanol extraction in the process of heating，the stability is better than water extraction.

Hypericum perforatum L.；extraction；flavonoids；variation patterns

R284.2；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0013-04

四川省重大產業技術創新專項，項目編號：2012CD00082；四川科技成果轉化項目，項目編號：2012SC0029。

唐小龍（1987-），男，碩士研究生，工程師，研究方向中藥質量標準研究，（電話）028-64287669（電子信箱）594195569@qq.com；柯瀟（1983-），男，大學本科，高級工程師，研究方向為中藥新藥研究，本文通訊作者，（電話）028-64287669。

（2016-02-18；

2016-04-30）