武當山區不同品種重樓地上部分總黃酮含量比較研究

楊金霞，朱敏，葉方，陳黎，黃良永，孫良學，雷攀

（1.湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院，湖北十堰442000；2.湖北醫藥學院湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心，湖北十堰442000；3.湖北濟世藥業有限責任公司，湖北十堰442000）

武當山區不同品種重樓地上部分總黃酮含量比較研究

楊金霞1，2，朱敏2，葉方1，2，陳黎1，2，黃良永1，2，孫良學3，雷攀1，2

（1.湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院，湖北十堰442000；2.湖北醫藥學院湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心，湖北十堰442000；3.湖北濟世藥業有限責任公司，湖北十堰442000）

目的建立測定武當山區不同品種野生轉家種重樓地上部分總黃酮含量的熒光分光光度法。方法以蘆丁為對照品，激發波長445 nm、發射波長484 nm、狹縫寬度2.5 nm，測定總黃酮含量。結果與結論不同品種重樓地上部分總黃酮含量差異較大，其中多葉重樓含量較高，滇重樓最低，宜選擇多葉重樓地上部分進行開發利用。

重樓；總黃酮；野生轉家種；地上部分

重樓為百合科Liliaceae重樓屬Paris L.多年生草本植物，又名蚤休、七葉一枝花、草河車，具有消腫止痛、抗癌、清熱解毒和止血等作用，廣泛用于多種中藥制劑中，是宮血寧、紅藥、熱毒清等重要中成藥的主要成分。重樓為多年生草本，對生長環境要求較為苛刻，適合生長在海拔600～3 100 m、雨量充沛、氣候涼爽、腐殖質豐富的環境下［1］。武當山區地理氣候環境獨特，適于重樓等藥用植物的生長［2］。黃酮類成分對心血管、抗肝損傷、解痙、呼吸系統可起良好作用，有雌激素樣作用，可抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用，在醫藥、食品保健等方面已被廣泛應用［3-4］。重樓的傳統用藥部分為地下根莖，而地上部分常棄去，造成資源浪費。本研究中測定并比較了重樓不同品種間地上部分總黃酮含量的變化，以期為重樓地上部分資源的合理利用提供參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

日立F-7000型熒光光譜儀；FA-2004型電子分析天平（上海精密儀器）；PHSJ-A型數字式酸度計（上海雷磁儀器）；HW1A型電熱恒溫水浴箱（北京醫療設備廠）。

1.2試藥

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080-201408，含量92.8%）；重樓藥材采自武當山區馬家河龍王寨，原藥材地上部分洗凈，50℃烘干，粉碎過3號篩備用，由湖北醫藥學院藥學院葉方副教授鑒定，樣本保存在湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院藥學部標本室，見表1。無水乙醇、石油醚、硝酸鋁、醋酸鈉、冰乙酸均為分析純；水為自制去離子水。

表1　樣品基源信息及含量測定結果

2　方法與結果

2.1溶液制備

精密稱取10.3 mg蘆丁對照品于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶液定容至刻度，得對照品溶液。

精密稱定不同品種及不同采收期重樓的地上部分干燥粉末1.0 g，置100 mL錐形瓶中，加入25 mL石油醚，放入60℃恒溫水浴鍋水浴回流2 h，棄石油醚液后將藥渣揮干，加入30 mL 60%乙醇，再放入80℃恒溫水浴鍋回流2 h，濾過，用60%乙醇將容器和藥渣沖洗3次，合并濾液，轉移至50 mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至刻度［5］，得到供試品溶液A1～A12。

2.2檢測波長選擇

精密量取蘆丁對照品0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入1 mL 10%硝酸鋁溶液及3 mL pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液后，加60%乙醇定容至刻度［6］，搖勻，放置25 min［7］。精密量取A1樣品溶液0.5 mL，置10 mL容量瓶中，同上述操作。取上述對照品及供試品溶液進行激發光譜（λex）和發射光譜（λem）波長掃描：固定λex，掃描λem在200～700 nm波長范圍內蘆丁對照品及供試品溶液熒光強度，結果最佳λem為484 nm。見圖1A和圖1B。固定λem為484，掃描λex在200～700 nm范圍內蘆丁對照品及樣品溶液熒光強度，結果最佳λex為445 nm，見圖1C和圖1D。本試驗選擇確定熒光條件為：λex為445 nm，λem為484 nm，狹縫寬度為2.5 nm。

2.3方法學考察

圖1　熒光分光光度色譜圖

線性關系考察：精密吸取蘆丁對照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液3 mL，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置25 min。按擬訂熒光條件對標準溶液進行熒光強度檢測；以60%乙醇溶液作空白，同法操作，測定吸光度值。以標準品溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標，Δ吸光度值（吸光度值-空白）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.019 0 X+0.038 5，R2=0.996 8（n=6）。結果表明，蘆丁質量濃度在2.06～32.96 μg/mL范圍內與熒光強度呈良好的線性關系。

重復性試驗：精密稱取7號藥材粉末1 g，共6份，分別精密吸取0.5 mL置10 mL容量瓶中，按2.3項下方法與硝酸鋁顯色后，在擬訂熒光法條件下測定光度值，計算總黃酮含量。結果樣品平均含量為0.59%，RSD值為2.13%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，按2.3項下方法顯色后，在擬訂熒光條件下測定光度值，在0，0.5，1.0，1.5，2.0 h時測定吸光度。結果的RSD為1.28%（n=5），表明供試品溶液在2 h內穩定性良好。

精密度試驗：精密吸取1 mL蘆丁對照品溶液置10 mL容量瓶中，按2.3項下方法顯色后，在擬訂熒光條件下連續測定光度值。結果5次光度值數據的RSD值為1.97%（n=5），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：精密稱取同一批次7號藥材粉末0.5 g，共計6份，按2.2項下方法用石油醚除去葉綠素后，分別精密加入5 mL蘆丁對照品溶液質量濃度為0.612 0 g/L，加60%乙醇回流提取后過濾，藥渣沖洗3次，合并濾液至50 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，按2.3項下方法顯色，在擬訂熒光條件下測定吸光度值，計算加樣回收率。結果見表2。

表2　加樣回收試驗結果（n=6）

2.4樣品含量測定

在擬訂熒光條件下，按2.3項下方法與硝酸鋁顯色后，測定樣品中總黃酮的光度值，計算樣品中總黃酮的含量。結果見表1。

3　討論

重樓是多年生藥用植物，塊莖繁殖需4～5年采收，種子繁殖需要8～9年采收，生長周期較長。人工種植重樓時，為了讓養分集中供應根莖部位以利生長，一般在5～6月花萼片展開后，及時剪去全部花花薹，以提高產量［8-9］。如此一來地上部分均被浪費，在野生資源日趨緊張的大環境下，有必要開展藥材新資源的研究［10］。由表可知，武當山區家種多葉重樓地上部分總黃酮含量高，建議取多葉重樓地上部分為原料提取黃酮，以擴大其臨床用藥的藥源的經濟意義。

品種選擇：由表1可知，不同品種重樓地上部分總黃酮含量差異較大。其中多葉重樓、寬葉重樓、狹葉重樓總黃酮含量較高，華重樓、滇重樓含量較低。2015年版《中國藥典（一部）》規定，華重樓和滇重樓為正品重樓，以重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ4種成分作為質量控制指標，前期研究證明華重樓和滇重樓中皂苷含量較高，多葉重樓、寬葉重樓中皂苷類成分較低，表明重樓中黃酮類成分與皂苷類成分可能存在負相關，建議宜選用多葉重樓、寬葉重樓等品種開發重樓中黃酮類成分。

熒光分光光度法測定總黃酮含量：根據黃酮類化合物能與鋁離子反應形成熒光螯合物的原理，可采用熒光光度法測定藥用植物中總黃酮的含量［7］。本研究中盡管在樣品處理過程中采用石油醚去除葉綠素，但可能還是會干擾對黃酮含量的測定。采用硝酸鋁在酸性條件下與樣品中黃酮類成分產生熒光物質的原理，用熒光分光光度法測定總黃酮含量，專屬性高。

［1］年四輝，劉麗敏.重樓地上部分初步開發實驗研究［J］.云南中醫中藥雜志，2007，28（4）：35-36.

［2］葉方，胡培，楊光義，等.湖北武當山地區重樓資源調查［J］.中藥材，2015，38（8）：1 615-1 617.

［3］唐栩，許東暉，梅雪婷，等.26種黃酮類天然活性成分的藥理研究進展［J］.中藥材，2003，26（1）：46-54.

［4］任珊珊，包保全，毛婷，等.中藥中總黃酮的含量測定方法研究進展［J］.北方藥學，2015，12（3）：112-116.

［5］黃鎖義，龍鳳，梁宇，等.熒光光度法測定榕樹葉總黃酮含量的研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17（6）：983-984.

［6］馬登磊，邵建群，何深知，等.熒光分析法測定元寶楓葉中總黃酮含量的研究［J］.首都醫科大學學報，2014，35（1）：113-117.

［7］邵菊芳，溫宗壯，朱紅威，等.基于熒光光譜法對銀杏黃酮糖苷的檢測研究［J］.光譜學與光譜分析，2013，33（11）：3 055-3 060.

［8］楊斌，李紹平，王馨，等.滇重樓的栽培與合理利用［J］.中國野生植物資源，2008，27（6）：70-73.

［9］梅中青，梅益麗.七葉一枝花野生變人工栽培的技術研究［J］.中國中藥雜志，2004，29（12）：1 213-1 214.

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Comparative Study on Content of Total Flavonoids from the Aerial Parts of Different Varietals Paris from WuDang M ountain Area

Yang Jinxia1，2，Zhu Min2，Ye Fang1，2，Chen Li1，2，Huang Liangyong1，2，Sun Liangxue3，Lei Pan1，2
（1.Shiyan Taihe Hospital·Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China442000；2.Engineering Research Center for Herbal Utilization of Hubei Province，Hubei University of MedicineHubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China442000；3.Hubei Jishi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shiyan，Hubei，China442000）

ObjectiveTo compare the content of total flavonoids from the aerial parts of different varietals Paris from WuDang mountain area.M ethodsRutin was used as contrast calibre，for the excitation wavelength of λex=445 nm，emission wavelength of λem=484 nm，slitwidth 2.5nm，and contentof totalflavonoidswasdetermined by usingfluorescencespectrophotometricmethod.Resultsand ConclusionThe content of total flavonoids in the aerial parts of different varietals Paris varied in different regions，and it was the highest in Paris polyphylla Sm.，and was lowest in Paris polyphylla Sm.var.yunnanensis.To exploit and use the aerial parts，it is better to select the Paris polyphylla Sm.

Paris；total flavonoids；cultivated from wild；aerial parts

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0016-03

湖北省2011計劃，項目編號：4；2014年湖北省中青年創新團隊項目，項目編號：T201414；湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心項目，項目編號：GC2015204。

楊金霞（1974-），女，大學本科，主管藥師，研究方向為醫院藥學，（電子信箱）236172734@ qq.com；陳黎（1973-），女，博士研究生，主任藥師，主要從事醫院藥事管理與中藥研發工作，本文通訊作者，（電子信箱）chenli0201@sina.com。

（2016-04-22）