XBP1對低氧環境下膠質瘤細胞活力及糖酵解的影響*

柴雙 卞齊龍 于濤 歐陽仲瑞 趙海杞 劉珈杞 侯旭 趙世光 劉耀華

·基礎研究·

XBP1對低氧環境下膠質瘤細胞活力及糖酵解的影響*

柴雙 卞齊龍 于濤 歐陽仲瑞 趙海杞 劉珈杞 侯旭 趙世光 劉耀華

目的：明確低氧應激對膠質瘤細胞X-盒結合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）的作用；明確膠質瘤細胞XBP1表達與糖代謝之間的關系；抑制XBP1表達對膠質瘤細胞在常氧和低氧環境下細胞活力的影響；明確低氧環境中XBP1對膠質瘤細胞糖酵解的影響。方法：分別在常氧和低氧條件下培養人腦膠質瘤細胞系，檢測XBP1激活情況；使用siRNA技術抑制XBP1表達，使用氧化磷酸化抑制劑處理細胞，檢測細胞活力及糖代謝方式的改變，在常氧和低氧條件下檢測細胞存活及糖酵解產物。結果：低氧環境下XBP1活化增加。低氧環境下XBP1沉默降低膠質瘤細胞活力、ATP和乳酸生成，葡萄糖消耗量減少。細胞氧化磷酸化受到抑制后，XBP1沉默降低膠質瘤細胞存活率。結論：低氧環境可誘導膠質瘤細胞XBP1的活化。在低氧環境下XBP1沉默降低膠質瘤細胞活力和糖酵解，膠質瘤細胞的糖酵解依賴于XBP1活化。

XBP1 膠質瘤 腫瘤能量代謝 糖酵解 低氧應激

Correspondence to:Yaohua LIU;E-mail:liu_yaohua@163.com

Department of Neurosurgery,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China

This work was supported by the National Nature Science Foundation of China(No.81372701)

由于膠質瘤生長需要大量的氧和營養物質，新生血管往往不能滿足腫瘤組織的生長需要，使得腫瘤細胞處于供氧不足和營養物質匱乏的微環境中［1-2］。低氧是指可利用氧的減少或氧分壓降至臨界值以下的狀態［3］。低氧是腫瘤所處微環境的首要理化特點［4］。腫瘤所處微環境促使腫瘤代謝方式的轉變，活躍的糖酵解是惡性腫瘤顯著的生化特征，即使是在氧氣充足的條件下腫瘤細胞的代謝方式仍然從氧化磷酸化轉向無氧酵解來獲取ATP，這被稱為Warburg效應［5］。腫瘤在低氧微環境下，表現出特殊的生物學特點，包括內質網應激（ER stress，ERS）和未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）以及代謝方式的改變等。X-盒結合蛋白-1（X-box binding protein 1，XBP1）是UPR的1個重要轉錄因子，調控相應內質網分子伴侶基因表達，以保護細胞免受內質網應激，利于細胞正常功能的維持，對實體腫瘤在低氧環境中生存至關重要［6］。XBP1有剪接型XBP1（XBP1 spliced，XBP1s）和未剪接型XBP1（XBP1 unspliced，XBP1u）兩種類型。XBP1s是在ERS下，由Ⅰ型跨膜蛋白激酶/核糖核酸內切酶剪切XBP1u mRNA的26 bp內含子后產生，XBP1s的轉錄活性遠高于XBP1u。耐受低氧應激微環境和特殊能量代謝方式是腫瘤生存、侵襲的關鍵因素［7］。低氧應激同糖酵解之間的協調機制尚不明確，抑制膠質瘤細胞特殊的能量代謝途徑將會削弱其對應激微環境的耐受，從而抑制腫瘤的發生發展，而XBP1或許是兩者間的關鍵因子。本研究發現XBP1對于膠質瘤細胞耐受低氧和糖酵解有重要作用，并為明確它們之間的關系尋找證據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系C6、U87、HEK293和U251細胞系（購自美國IBMS、CAMS/PUMC細胞資源中心）。

1.1.2主要試劑胎牛血清、DMEM高糖培養基、青霉素鏈霉素雙抗（購自美國Gibco公司），RIPA裂解緩沖液、蛋白酶、磷酸酶抑制劑、抗XBP1（1∶1 000）和siRNA試劑盒（購自上海麥約爾生物技術有限公司），2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）、溴丙酮酸（購自美國Sigma公司），內皮生長因子（購自美國PeproTech公司），臺盼藍溶液（購自上海碧云天生物技術有限公司），寡霉素A（oligomycin A，OA）、ATP檢測試劑盒、葡萄糖類似物2-NBDG、乳酸檢測試劑盒（購自美國Invitrogen生物技術有限公司），Wistar大鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養實驗用培養基由高糖DMEM培養基加入10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素溶液配制而成，每個培養瓶中加入5 mL細胞培養基，在37℃、5%CO2孵箱中培養。當細胞培養瓶中的膠質瘤細胞在長滿瓶底80%～90%時，進行細胞傳代。根據不同細胞系膠質瘤細胞的生長情況，每2～3天傳代1次。1.2.2Western blot分析收集細胞，細胞裂解液提取蛋白，測定蛋白濃度，每個標本加入SDS sample buffer，100℃沸水加熱5 min，每泳道上樣蛋白30 μg，15%SDS凝膠電泳，半干轉膜，封閉，一抗4℃過夜，洗膜，二抗室溫1 h，洗膜，ECL法顯影，觀察結果。

1.2.3細胞轉染在實驗中篩查出能夠有效抑制膠質瘤細胞XBP1表達的siRNA為5′-CCAGUCAUG UUCUUCAAAU-3′，通過該siRNA制備XBP1shRNA。陰性對照組為5′-UUCUCCGAACGUGUCACG U-3′，siRNA為隨機對照序，通過該siRNA制備NC shRNA。將XBP1shRNA和NC的片段嵌入到含有綠色熒光蛋白（GFP）的pENTR/U6-GFP載體中，讓包含XBP1和NC的shRNA片段的pENTR/U6-shRNA-GFP聯合載體與pLenti6/Block-it-DEST載體進行再結合反應。將結合后的載體和包裹質粒共同轉染到HEK293細胞中，48 h后收集病毒顆粒。將慢病毒包裹的XBP1 shRNA和NC載體轉染到U87和U251細胞中，48 h后選擇帶有綠色熒光的細胞進行培養為下一步實驗做準備。

1.2.4臺盼藍檢測細胞死亡收集6孔板或12孔板培養孔內細胞培養液，胰蛋白酶消化貼壁細胞后，用原培養液中和胰酶，重懸細胞，100 μL重懸細胞與100 μL 0.4%臺盼藍染色液混合，輕輕混勻，染色重懸細胞3 min，吸取少量經過染色的細胞，用血細胞計數板計數，每個樣品至少數500個細胞，計數藍染細胞和細胞總數。

細胞死亡率=藍色細胞數/細胞總數×100%。

1.2.5ATP檢測加100 μL ATP檢測工作液到檢測孔或檢測管內。室溫放置3～5 min，使本底性ATP全部消耗掉。用ATP檢測裂解液將ATP標準液稀釋成0.1、1.0、10.0 μm/L的濃度梯度。在檢測孔或檢測管內加入10 μL不同濃度的標準溶液，迅速用微量移液器混勻，至少間隔2 s后，立即用光度計測定RLU值。根據所測RLU值繪制標準曲線，根據標準曲線計算出樣品中ATP的濃度。

1.2.6乳酸檢測實驗細胞在6孔板中培養，每孔加入1×106，細胞培養基中分別加入2-DG（25 μm），溴丙酮酸（BRPA，30 μm），內皮生長因子（EGF，100 ng/mL）。將各實驗組細胞培養液分別依次吸出50 μL加入到96孔板中各孔，每個實驗孔中加入乳酸檢測液50 μL，放入37℃細胞培養箱中反應30 min，取出后每孔加入50 μL，0.5 m冰乙酸終止反應。將96孔板放入分光光度計，分光光度計以OD490nm測定各孔吸光度值。

1.2.7葡萄糖檢測實驗細胞在6孔板中培養，每孔加入1×106，細胞培養基中加葡萄糖類似物2-NBDG（100 μM）熒光染色，30 min后PBS清洗，并用流式細胞術進行分析。

1.2.8氧消耗量的檢測將新鮮的培養基預熱至37℃并用95%的空氣和5%CO2進行預充氣。取上述1 mL培養液將細胞再次懸浮。再次懸浮的細胞液放置在一個具有溫度控制、微攪拌裝置和Clark型氧電極的密封裝備室內。使用Mitocell MT200呼吸計和氧電極來測定密封室內的氧含量和細胞懸液中的氧消耗量。

1.2.9C6膠質瘤細胞鼠腦標本制作抽取C6細胞懸浮液（含5×105細胞）分別注射至3支體質量為200～250 g的雄性Wistar大鼠的尾狀核。在C6細胞種植后21 d處死大鼠取出膠質瘤及其鄰近正常組織，-80℃冷凍待用，實驗遵從國家有關實驗動物保護規范和管理條例。

1.3統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。方差分析采用t檢驗和單因素方差分析，實驗組的實驗次數至少重復3次，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1低氧環境可誘導膠質瘤細胞XBP1的活化對體外C6膠質瘤細胞和C6鼠腦膠質瘤模型中的XBP1s的水平進行比較，結果顯示體外培養的C6細胞XBP1s被輕度激活，而在體內膠質瘤組織則顯著激活。將培養的膠質瘤細胞置于1%O2的低氧環境中來模擬膠質瘤組織所處的低氧微環境。將U87和U251細胞在1%O2的環境中培養12 h和24 h，在XBP1蛋白水平沒有明顯改變的情況下，XBP1s的表達量明顯升高（圖1）。

2.2低氧環境下XBP1沉默降低膠質瘤細胞的細胞活力

使用XBP1 shRNA抑制膠質瘤細胞中XBP1的表達，致使XBP1沉默，在低氧環境下同NC對照組相比較，XBP1沉默細胞的XBP1s活化受到了抑制。臺盼藍實驗顯示在常氧環境下，XBP1沉默對膠質瘤細胞的生存幾乎沒有影響；而在缺氧環境中24 h，膠質瘤細胞的存活率下降顯著。由此可見低氧應激同樣能夠誘導膠質瘤細胞XBP1的激活，而XBP1沉默則降低膠質瘤細胞對低氧應激的耐受（圖2）。

2.3低氧環境下XBP1沉默抑制膠質瘤細胞糖酵解能力

檢測在低氧和常氧環境下膠質瘤細胞ATP、乳酸的生成量和葡萄糖的消耗量。實驗結果顯示盡管單純的XBP1沉默在常氧環境中對代謝幾乎不存在影響，但在低氧環境中它明顯降低ATP和乳酸的生成量及葡萄糖的消耗量。這組數據說明在低氧環境中XBP1沉默時膠質瘤糖酵解受到明顯抑制，膠質瘤細胞的死亡明顯增加（圖3）。

2.4膠質瘤細胞的糖酵解依賴于XBP1活化

檢測膠質瘤細胞的氧耗水平，XBP1 shRNA轉染膠質瘤細胞比NC膠質瘤細胞的氧耗水平更高。因此，采用OA抑制膠質瘤細胞氧化磷酸化后，觀察XBP1沉默對膠質瘤細胞能量代謝和細胞活力的影響。臺盼藍實驗顯示OA能夠輕微的降低NC細胞存活率，而在XBP1沉默組OA的作用顯著擴大。經過OA處理的膠質瘤細胞，氧化磷酸化受到抑制，糖酵解的水平可能會因此增加。在OA作用于膠質瘤細胞后12 h檢測ATP和乳酸的產生量及葡萄糖的消耗量，結果顯示OA明顯增加NC細胞ATP和乳酸的產量以及葡萄糖的消耗量，而在XBP1沉默組結果為陰性。實驗結果說明XBP1沉默膠質瘤細胞的能量代謝更加依賴于氧化磷酸化，實驗結果顯示OA能夠誘導XBP1s的表達（圖4）。

圖1　低氧環境可誘導膠質瘤細胞XBP1活化Figure 1Hypoxia can induce XBP1 activation in glioma cells

圖2　低氧環境下XBP1沉默降低膠質瘤細胞的細胞活力Figure 2XBP1 silencing suppressed glioma cell viability under hypoxia

圖3　低氧環境下XBP1沉默抑制膠質瘤細胞糖酵解能力Figure 3Silencing XBP1 depresses glioma cell glycolysis under hypoxia

圖4　在低氧環境下膠質瘤細胞糖酵解依賴XBP1活化Figure 4Glioma cell glycolysis under hypoxia relied on XBP1s activation

3 討論

低氧是體內腫瘤局部的重要特征，低氧應激是引起ERS的主要條件之一，其顯著影響細胞的行為［8］。UPR是細胞發生ERS時所形成的自我保護信號傳導通路，細胞通過UPR來維持正常功能［9］。有研究表明，UPR路徑通過增加體內腫瘤細胞的適應性來抵抗應激微環境，對于腫瘤細胞的存活和生長起到關鍵作用［10-11］。在不同腫瘤中阻礙包括IRE1-XBP1在內的UPR途徑會抑制腫瘤的生長和增加癌細胞的凋亡［12］。有研究表明XBP1在多種腫瘤細胞中高表達，強調XBP1對腫瘤發生發展的重要性［13-16］。有實驗證明在體內膠質瘤組織中XBP1被顯著激活。XBP1s的激活可能是實體膠質瘤細胞耐受缺氧和營養物質匱乏等應激內環境的標志。暴露于低氧環境后，XBP1沉默細胞生存能力明顯下降，XBP1的缺失能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長，能夠降低這些細胞在低氧應激環境下的適應能力［17-18］。

在低氧應激環境下，腫瘤細胞的能量代謝方式發生異常改變，通過糖酵解獲取能量來適應低氧微環境，由于這種代謝方式的轉變造成其對放化療的抵抗，并抵制細胞凋亡的過程，為腫瘤的增殖和侵襲提供前期所需的物質［19］。己糖激酶（hexokinase，HK）是糖酵解的關鍵酶，在一些腫瘤細胞中HK的表達出現明顯的變化［20］。HKⅡ在大多數惡性腫瘤中的表達明顯升高。低氧應激能夠刺激缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的表達，能夠促進包括HK在內的大多數糖酵解酶的表達［21-23］。低氧環境下XBP1沉默能夠明顯的降低膠質瘤細胞ATP的生成量，糖酵解產物-乳酸的生成量也明顯降低，膠質瘤細胞糖酵解能力受到嚴重影響。XBP1沉默阻礙膠質瘤細胞低氧環境下通過糖酵解獲取能量的途徑，這將導致膠質瘤細胞的死亡。Chen等［10］研究顯示，在低氧環境下XBP1參與調控包括HKⅡ在內的HIF-1α介導缺氧反應途徑基因的表達。此項研究結果顯示，低氧環境下XBP1沉默膠質瘤細胞ATP生成量及乳酸生成量顯著降低，糖酵解明顯抑制。故確定XBP1參與低氧環境下膠質瘤細胞糖代謝的調節。在實驗中發現XBP1沉默膠質瘤細胞的氧耗水平高于NC膠質瘤細胞，由此推測XBP1沉默膠質瘤細胞能量代謝更加依賴氧化磷酸化，使用OA抑制膠質瘤細胞氧化磷酸化后，XBP1沉默膠質瘤細胞幾乎喪失利用葡萄糖的能力，而這樣的結果必將導致膠質瘤細胞的死亡，表明膠質瘤細胞糖酵解依賴于XBP1的活化。缺氧或氧化磷酸化抑制劑等使膠質瘤細胞能量代謝向糖酵解轉變所必需的應激狀態是XBP1s激活的重要條件。目前，XBP1調控低氧環境下膠質瘤細胞糖代謝的機制尚不明確。最新的研究結果顯示HKⅡ是糖酵解的第一關鍵酶，并在膠質瘤中大量地表達［24］。雖然目前其發揮作用的具體機制尚不清晰，提示XBP1可能是膠質瘤治療的分子靶標，其研究前景良好；而XBP1沉默對于膠質瘤細胞成瘤能力的影響也需要通過進一步的動物實驗來證明。

在低氧環境下膠質瘤細胞的糖酵解依賴于XBP1s活化，XBP1沉默降低膠質瘤細胞活力和能量代謝。XBP1對于腫瘤低氧耐受和糖酵解調節相關機制對于膠質瘤的治療意義值得關注和進一步研究。

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（2016-05-19收稿）

（2016-08-04修回）

柴雙專業方向為膠質瘤的基礎與臨床研究。

E-mail：cs90@qq.com

Effects of XBP1 on glioma cell viability and glycolysis under hypoxia

Shuang CHAI,Qilong BIAN,Tao YU,Zhongrui OUYANG,Haiqi ZHAO,Jiaqi LIU,Xu HOU,Shiguang ZHAO,Yaohua LIU

Objective:To determine the effect of hypoxic stress on glioma cell XBP1 expression,the relationship between XBP1 expression and sugar metabolism,the influence of XBP1 repression on the survival rate of glioma cells under normoxia and hypoxia,and the influence of XBP1 on glioma cell glycolysis.Methods:We tested XBP1 activation in human glioma cell lines cultured under normoxia and hypoxia.XBP1 expression was repressed with siRNA technology.Cells were treated with oxidative phosphorylation inhibitor.We then detected the variation in cell apoptosis,sugar metabolism mode,and cell apoptosis and glycolysis products under normoxia and hypoxia.Results:XBP1 activation increased under hypoxia.Silencing XBP1 expression reduced glioma cell survival level,ATP and lactic acid production,and glucose consumption under hypoxia.After inhibiting cell oxidative phosphorylation,XBP1 repression significantly reduced the survival level of glioma cells.Conclusion:Hypoxia can activate XBP1 in glioma cells.Under hypoxia,XBP1 silencing depresses cell activity and glycolysis.Glycolysis of glioma cells under hypoxia depends on XBP1 activation.

XBP1,glioma,tumor metabolism,glycolysis,hypoxic stress

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.20.588

哈爾濱醫科大學附屬第一醫院神經外科（哈爾濱市150001）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81372701）資助

劉耀華liu_yaohua@163.com