馬關無角山羊卵巢顆粒細胞INHA基因siRNA的篩選與鑒定

富國文，王紹卿，祁會彩，滕曉紅，達永仙，樊月圓

（1.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201；2.西安市未央區動物衛生監督所，西安 710016）

繁殖與生理

馬關無角山羊卵巢顆粒細胞INHA基因siRNA的篩選與鑒定

富國文1，王紹卿1，祁會彩2，滕曉紅1，達永仙1，樊月圓1

（1.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201；2.西安市未央區動物衛生監督所，西安 710016）

為了研究INHA基因在馬關無角山羊卵泡發育中的作用，設計并化學合成了3條針對INHA基因的siRNA，脂質體法轉染至馬關無角山羊的卵巢顆粒細胞，Real-time PCR技術和Western-Blot技術對其干擾效率進行了篩選。結果表明：siRNA-2對INHA基因mRNA表達抑制率達到了94.3%，對蛋白表達的抑制率達到了93.4%，是INHA基因沉默的最佳干擾質粒，可為今后研究INHA基因的功能提供基礎。

馬關無角山羊；INHA基因；siRNA

馬關無角山羊是云南省優良的地方畜禽品種之一，公母羊均無角，故性情溫順，易于管理，其頭部有鬃，當地俗稱“馬羊”。主要產于云南省馬關縣，生活于海拔700～1 700 m的山區。該品種具有繁殖力高（200%～400%）、性成熟早（母羊3月齡即可發情配種，公羊6月齡即可配種）、生長快、性情溫順、肉膻味小、耐粗飼和抗病力強的特點。特別是在無角、多胎性和肉質方面，堪稱山羊珍稀品種資源［1-2］。

抑制素（inhibin，INH）是由睪丸支持細胞和卵巢顆粒細胞分泌的糖蛋白激素，屬于轉化生長因子超家族成員，該家族主要調控細胞的生長與分化。INH是由α、β兩個亞基組成的異二聚體，β亞基又分為A、B兩種，故INH存在兩種形式，即INHA（αβA）和INHB（αβB）［3-5］。研究發現，INH對豬、牛、羊、雞等動物的卵泡生長發育有著重要的作用［6-9］。INHA對雌性動物卵泡發育的作用隨著卵泡的逐漸成熟而增強，這種作用具有劑量依賴性，因此INHA被認為是確定單胎和多胎動物種屬特異性排卵數最重要的激素之一［10-12］。其主要功能是通過反饋調節FSH的分泌參與卵泡發育調節。同時，在卵泡顆粒細胞上存在INH的特異結合位點。Geng等［13］和滑國華［14］通過超表達和RNAi技術，研究了INHA基因對牛卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響，結果證明，INHA能抑制卵巢顆粒細胞的增殖，促進卵巢顆粒細胞的凋亡。

RNAi技術為研究者提供了很好的技術平臺，能高效特異性地阻斷基因的表達，進而實現細胞水平的基因敲除。本研究對構建的3個干擾質粒的干擾效率進行篩選，為進一步研究INHA基因的功能提供了基礎材料。

1　材料與方法

1.1試劑與主要儀器

主要試劑：DMEM/F12（Hyclone），胎牛血清（Gibco），PureYield質粒中量純化系統（去內毒素）（Promega），Lipofectamine 2000 Reagent（Invitrogen），TRIzol（北京天根），ReverTraAce-α-逆轉錄試劑盒（TOYOBO），AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix（Toyobo），Rabbit Anti-INHAPolyclonal Antibody（NOVUSbiologicals），PVDF膜（Millipore）。

主要儀器：CO2培養箱（ThermoFisher Forma），倒置熒光顯微鏡（Nikon），CFX PCR儀（Bio-Rad），轉膜槽（Bio Rad）。

1.2方法

1.2.1馬關無角山羊卵巢顆粒細胞的培養實驗母羊肌肉注射氯前列腺醇鈉，每只0.1 mg，40 h后麻醉，通過手術打開腹腔，用無菌注射器抽取卵巢表面顏色透明、微透亮，血管豐富的卵泡，獲得帶有顆粒細胞的卵泡液，將卵泡液用不含Ca2+和Mg2+的PBS液洗3次，0.2%透明質酸酶消化3 min，再用DMEM/F12細胞培養液洗2遍，每次1 500 r/min離心10 min，回收細胞，制得顆粒細胞懸液，按3×105/孔接種于24孔細胞培養板。

1.2.2轉染將純化后的卵巢顆粒細胞用0.25%的胰酶消化，轉于25 cm2的培養瓶中，待細胞長滿瓶底的60%～80%時，用Lipofectamine 2000轉染INHA基因干擾片段，轉染步驟如下：①用250 μL無血清的DMEM/F12培養基稀釋10 μL的干擾片段（20 μM），同時用250 μL無血清培養基稀釋8 μL的Lipofectamine 2000，輕輕混勻后，分別靜置5 min；②將干擾片段和脂質體的稀釋液混合，輕輕混勻后，靜置20 min；③將混合液加入含卵巢顆粒細胞的培養瓶中，補加1.5 mL的無血清培養基，使終體積為2 mL；④放入CO2培養箱中，6 h后換成含10%血清的培養基培養。培養48 h后收集細胞進行鑒定。

表1　INHA基因的siRNA序列信息

1.2.3Real-time PCR檢測干擾質粒的干擾效率將細胞收集于RNase-Free離心管中，采用傳統的Trizol法提取總mRNA，反轉錄獲得cDNA。根據Genbank中山羊的INHA的mRNA全序列，取其保守區，設計RT-PCR引物，引物序列為：F：5'-CCGGCCATCCCAGCACACAC-3'，R：5'-GGCGGAGCAGGAACAGAG AGG-3'，內參基因GAPDH的引物序列為：F：5'-CGGCTACAGCAACAGGGTGG-3'，R：5'-GGTGGAGGTGGGGCAGGAC-3'?；虮磉_量計算公式為：PCR反應后，根據軟件分析數據，應用2-△△CT方法對基因的表達水平進行相對定量。

1.2.4Western blot檢測干擾質粒的干擾效率細胞收集于1.5 mL離心管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，于冰上裂解30 min，為使細胞充分裂解，對裂解液反復吹打，離心獲得總蛋白，BCA法測蛋白濃度。目的蛋白分子量大小為40 KD，配置5%的濃縮膠和8%的分離膠，煮樣后電泳、轉膜、封閉，一抗孵育稀釋，4℃搖床過夜。置室溫30 min后，洗膜3次，每次10 min，加入過氧化物酶標記的二抗，置搖床搖2 h后，化學發光法采集照片。應用Metamorph圖像分析軟件分析INHA與β-actin的蛋白灰度值，得到各組蛋白相對含量。

1.3統計學處理

試驗數據采用SPSS21.0軟件進行統計分析，數據用平均數±標準差（SD）來表示，采用One-way ANOVA進行方差分析，采用EXCEL繪制比較圖譜。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2　結果與分析

2.1馬關無角山羊卵巢顆粒細胞的培養

剛分離出來的卵巢顆粒細胞呈圓形或橢圓形，懸浮在含10%胎牛血清的DMEMF12的培養液中，如圖1（A）所示。經原代培養后進行了傳代，傳代24 h后，細胞貼壁，呈梭型或不規則三角形圖1（B），72 h鋪滿了瓶壁的90%（圖1（D））。細胞狀態良好，可用于下一步實驗。

圖1　卵巢顆粒細胞的培養結果

2.2卵巢顆粒細胞轉染結果

如圖2所示，倒置熒光顯微鏡下可見發綠色熒光的卵巢顆粒細胞。

圖2　轉染后的卵巢顆粒細胞

2.3Real-time PCR法檢測干擾后INHA基因的mRNA表達量

卵巢顆粒細胞中的INHA基因經3個干擾質粒干擾后的mRNA的表達量如圖3所示。干擾后siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3組的INHA基因的mRNA的表達量與正常組和NC組比較明顯降低（P＜0.01），其中siRNA-2組的表達量最低。

圖3　轉染后INHA基因的mRNA相對表達量

2.4Westernblot法檢測干擾后INHA蛋白的表達量

轉染48 h后抽提蛋白，經Western blot檢測發現，正常組與陰性對照組的Western blot圖譜灰度基本一致，而3個干擾組的Western blot圖譜灰度都明顯降低，其中SiRNA-2的蛋白圖譜灰度最低（圖4）。應用Metamorph圖像分析軟件分析INHA與β-actin蛋白灰度值，得到各組蛋白相對含量。如圖5所示，siRNA-1、siRNA-2和 siRNA-3組的INHA蛋白的表達量與正常組和NC組比較明顯降低（P＜0.01），其中siRNA-2組的蛋白表達量極顯著低于其他兩組（P＜0.01）。

圖4　轉染后的Western blot檢測結果

圖5　轉染后INHA蛋白的相對表達量

3　討論

繁殖性狀是家畜的重要經濟性狀，也是畜牧業生產的主要經濟性狀之一，尤其對于繁殖力低、繁殖周期和世代間隔長的牛、羊等草食家畜而言，繁殖成本就占據總生產成本的60%～70%。因此，提高牛、羊等草食家畜繁殖力，對降低繁殖成本，提高養殖業經濟效益，促進我國畜牧業的快速發展具有重要的意義。動物的繁殖性狀主要包括排卵數、產仔/羔數、精液品質等因素，這些因素主要受自體激素水平、相關細胞因子以及相關基因的共同調控。大量研究表明，下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamus-pituitary-ovarial axis，HPO）對卵泡發育、配子發生及胚胎發育等具有重要的調節作用。抑制素是HPO軸調控系統的重要調節激素，通過調節卵巢顆粒細胞的凋亡/增殖對卵泡的正常生長、分化及閉鎖起到刺激或抑制作用［15］。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術的主要目的是高效特異性降解目標信使RNA（mRNA），阻斷翻譯蛋白質的過程，從而抑制目標基因的表達［16］。本研究對設計的3條抑制INHA基因表達的siRNA干擾質粒進行了實驗驗證，結果顯示，干擾后INHA基因的mRNA表達水平變化為，siRNA-1干擾質粒使INHA基因的mRNA表達量下降了84%，siRNA-2干擾后，INHA基因的mRNA表達量僅5.7%，siRNA-3干擾質粒的干擾效率為68%；干擾后INHA蛋白的表達水平分別為，siRNA-1干擾質粒使INHA蛋白的表達量下降了61%，siRNA-2干擾后，INHA蛋白表達量僅6.6%，siRNA-3與siRNA-1的干擾效果差別不大，蛋白表達量43%。由此可見，不論是mRNA水平還是蛋白水平，siRNA-2質粒對INHA基因的干擾效率都達到了最佳。為下一步體內、外研究INHA基因的功能奠定了實驗基礎。

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Selection and Identification of siRNA against INHA Gene in Ovarian Granular Cells of Maguan Polled Goats

Fu Guowen，WangShaoqing，Fan Yueyuan，et al
（College Animal Science&Technology，Yunnan Agriculture University，Kunming650201，China）

In order tostudythe role ofINHA gene in the follicular development ofMaguan polled goat，three siRNAagainst INHA gene were designed and synthesized，then these siRNA were transfected into the ovarian granular cells of goats via lipofectamine，and the interference efficiency were screened by Real-time PCR and Western-Blot.The results showed that the inhibition rate of siRNA-2 for INHA gene mRNA expression was 94.3%，and that for protein expression was 93.4%.So siRNA-2 is the best interference plasmid ofINHA gene silencing，and which can provide the basis for the studyofINHA gene function in the future.

Maguan polled goats；INHA gene；SiRNA

S827.3

A

2095-3887（2016）01-0015-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.005

2015-11-25

云南省科技計劃面上項目（2012FB147）

富國文與王紹卿同為第一作者。富國文（1980-），男，在讀博士；王紹卿（1972-），男，碩士，副教授。

樊月圓（1979-），女，講師，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。