衛氣虛模型大鼠血漿代謝標志物月節律變化的研究

李博林 王亞利 張明泉 王鑫國 賈琳 閆翠環 曹文利 師旭亮

摘要：目的 運用代謝組學方法研究衛氣虛證月周期性變化的物質基礎，尋找其潛在標志物，為衛氣虛證實質研究提供新的途徑。方法 以秋分日所在的農歷月，確定月初（農歷八月初一）、月中（八月十五）及月末（八月三十）3次實驗的取材時間。取材日前2周將20只大鼠隨機分為正常組與模型組，每組10只。模型組采用疲勞聯合寒熱交替法制備衛氣虛模型，正常組常規喂養。3次實驗均在其相應取材日正午12：00斷頭取血，采用高效液相色譜-質譜聯用儀檢測血漿代謝物，利用偏最小二乘法對數據進行統計分析，組間進行比較，探索衛氣虛證差異性代謝標志物，進而推測尋找衛氣虛證月周期變化的潛在標志物。結果 油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮質醇、脯氨酸、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸6種差異代謝物可能為月初衛氣虛證潛在證候標志物；1-磷酸鞘氨醇、蘋果酸、皮質醇、油酸酰胺、肉毒堿、二十碳五烯酸、富馬酸二甲酯7種差異代謝物可能為月中衛氣虛證潛在證候標志物；膽固醇乙酸酯、蘇氨酸、皮質醇、富馬酸二甲酯、油酸酰胺、二十碳五烯酸、焦谷氨酸7種差異代謝物可能為月末衛氣虛證潛在證候標志物。結論 衛氣虛證月周期性變化可能受油酸酰胺、皮質醇、二十碳五烯酸、富馬酸二甲酯影響，其周期性變化可能與能量代謝密切相關，同時還伴隨著細胞、激素及神經調節。

關鍵詞：衛氣虛證；月節律；代謝組學；實驗研究

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0046-05

Abstract： Objective To use metabonomics method to study the change of the basic materials of month rhythm of wei qi deficiency syndrome； To find the potential markers so as to provides a new way for the essence of the wei qi deficiency syndrome research. Methods Based on the autumnal equinox in lunar calendar month， the beginning of a month （the first day of lunar August）， the middle of a month （the 15th day of lunar August）， and the end of a month （the 30th day of lunar August） were set as the three days to draw experimental materials. Two weeks before drawing materials， 20 rats were randomly divided into control group and model group， 10 rats in each group. The model rats were modeled by the stimulus of fatigue combined with coldness and hotness. Control group rats received conventional breeding. The rats in the both groups during the three experiments received decollation and the blood was taken at the 12 oclock at noon. HPLC-MS was used to detect plasma metabolites， and partial least squares were used to make statistical analysis on the data for comparing plasma metabonomics original data of control group and model group. Possible metabolic markers of wei qi deficiency syndrome were explored， and the potential makers of month rhythm change of wei qi deficiency syndrome were deduced. Results Oleamide， phosphatidyl glycerol， cortisol， proline， dimethyl fumarate， and eicosapentaenoic acid may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the beginning of a month. Sphingosine-1-phosphate， malic acid， cortisol， oleamide， carnitine， eicosapentaenoic acid and dimethyl fumarate may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the middle of a month. Cholesteryl acetate， threonine， cortisol， dimethyl fumarate， oleamide， eicosapentaenoic acid and pyroglutamate may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the end of a month. Conclusion Month rhythm change of wei qi deficiency syndrome may be influenced by oleamide， cortisol， eicosapentaenoic acid， dimethyl fumarate， and aconitic acid， and may be closely related to energy metabolism， meanwhile accompanied by regulation of cell， hormone and nerves.

Key words： wei qi deficiency syndrome； month rhythm； metabonomics； experimental research

衛氣虛證是臨床常見證型，本課題組前期采用分子生物學、基因學等現代研究方法，從分子、細胞和整體層面對衛氣虛證進行了深入研究[1-2]，在一定程度上揭示了衛氣虛的本質，但均難以從整體層面多系統闡釋其變化規律。代謝組學作為一種系統性和整體性的研究方法，可從整體上反映生物體的功能水平，能比較全面地揭示疾病發展過程中生物體系內發生的一系列生物化學變化[3]，而發現的差異性代謝標志物能夠多靶點、多層面網絡式反映機體內部變化，這與中醫整體恒動觀念相一致。因此，我們采用代謝組學方法研究衛氣虛證的物質基礎，并結合《素問·八正神明論篇》所言“月始生，則血氣始精，衛氣始行；月郭滿，則血氣實，肌肉堅；月郭空，則肌肉減，經絡虛，衛氣去，形獨居”的衛氣月節律循行特點采取動態檢測的方式，觀察衛氣虛模型大鼠血漿代謝標志物的月周期性變化，以期為衛氣虛證實質研究提供新的途徑。

1 實驗材料

1.1 動物

6周齡健康雄性SD大鼠60只，SPF級，體質量160～200 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于河北中醫學院動物實驗中心恒溫、通風、安靜的環境，自由進食飲水，每日更換墊料，定期給鼠籠消毒。

1.2 主要試劑與儀器

乙腈、甲醇，色譜級，美國Fisher Scientific公司；蒸餾水，屈臣氏；色譜柱，美國phenomenex公司；乙酸、乙酸銨，色譜級，中國Dikmapure公司。高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（HPLC-MS），美國AB公司；液相系統，ekspertTM ultraLC100；質譜系統，AB Sciex QTRAP 4500，配有EI、離子肼；渦旋振蕩器，QL-901，Vortex，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；液氮罐，YDS-10，河南新鄉市新亞低溫容器有限責任公司；MDF-382E型超低溫保存箱，日本三洋公司；高速臺式冷凍離心機，TGL-16M，湖南湘儀離心機儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

以秋分日所在農歷月，確定月初取材時間為2013年農歷八月初一正午12：00、月中取材時間為2013年農歷八月十五正午12：00、月末取材時間為2013年農歷八月三十正午12：00。每次實驗取材日前2周，將20只大鼠按隨機數字表法分為正常組和模型組，每組10只，適應性喂養7 d后造模。其中月初正常組大鼠體質量為（173.89±8.61）g，模型組大鼠體質量為（181.96±9.21）g；月中正常組大鼠體質量為（179.64±10.09）g，模型組大鼠體質量為（184.09±10.65）g；月末正常組大鼠體質量為（180.16±7.95）g，模型組大鼠體質量為（177.65±7.86）g，各組大鼠體質量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。正常組常規飼養，模型組給予疲勞聯合寒熱交替法造模[4-5]。模型組大鼠先在20 ℃左右常溫水中游泳30 min，再取出，常規飼養，室溫（25±1）℃，0.5 h后，將大鼠放入（40±1）℃恒溫箱中15 min，再0.5 h后將大鼠放入-20 ℃冰柜中20 min進行寒冷刺激。以上過程每日1次，連續7 d。造模成功標準參考文獻[4，6-7]制定：大鼠蜷縮、扎堆、怕冷、惡風；背毛凌亂、無光澤，汗出明顯；噴嚏，有痰鳴音及鼻分泌物；反應遲鈍，懶動。

2.2 樣本采集與制備

取材前1 d開始禁食，24 h后大鼠斷頭處死，血液中加肝素鈉20 μL，3500 r/min離心10 min，取上清液于凍存管中，液氮暫存，轉-80 ℃冰箱保存。檢測前血漿置4 ℃條件下復融。乙腈預冷提前在4 ℃條件下過夜。按100 μL血漿加300 μL乙腈比例沉淀蛋白，渦旋混勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液，與水按1∶1稀釋配比，14 000 r/min離心10 min。將上清液移入液相小瓶中備用待測。

2.3 代謝物檢測

供試血漿樣品用HPLC-MS檢測。色譜條件：色譜柱為phenomenex Kinetex XB-C18（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；流動相：A為水（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸銨溶液），B為乙腈（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸銨溶液）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃，進樣量：5 μL。梯度洗脫條件設置見表1。質譜條件：正離子（ESI+）模式下進行檢測，質譜檢測數據采集范圍：質荷比50～850 Da；Curtain Gas：30 psi，Gas1：55 psi，Gas2：55 psi；DP：60 V；EP：10 V；CE：5 eV；ISP：5500 V；Tem：500 ℃。

3 統計學方法

應用markerview1.2.1代謝組學分析軟件進行峰識別、峰過濾、峰對齊，最終獲得包括質荷比、保留時間及峰面積的二維數據陣。采用SIMCA13.0.3軟件對數據進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）[8]。將分析結果結合網上數據庫檢索鑒定可能的生物標志物。通過代謝組學分析軟件行t檢驗，分析標志性代謝物的組間差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

采用PLS-DA的重要變量因子（閾值>1），并結合t檢驗P值（P<0.05）來尋找差異性表達代謝物。篩選確定候選代謝物后，搜索在線數據庫進行檢索，查找可能的代謝物，進一步縮小范圍，分析推測代謝物。

4.1 月初衛氣虛潛在標志物

在正離子模式下，經過PLS-DA，具有4個主成分，R2X=0.539，R2Y=0.994，Q2=0.86；PLS-DA得分圖顯示正常組與模型組被第一主成分完全分開，表明2組間有顯著差異，見圖1。模型組和正常組結果顯示，預測能力Q2=0.86，53.9%X變量可用于解釋2組間99.4%的差異Y。適合于解釋2組間的代謝差異和發現2組間的差異性表達代謝物。結果在正離子模式下初步比對并推測出油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮質醇、脯氨酸、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸6種差異代謝物為月初衛氣虛證潛在證候標志物，見表2。

4.2 月中衛氣虛潛在標志物

在正離子模式下，經過PLS-DA，具有2個主成分，R2X=0.335，R2Y=0.999，Q2=0.968；PLS-DA得分圖顯示正常組與模型組被第一主成分完全分開，表明2組間有顯著差異，見圖2。模型組和正常組結果顯示，預測能力Q2=0.968，33.5%的X變量可用于解釋2組間99.9%的差異Y。適合于解釋2組間的代謝差異和發現2組間的差異性表達代謝物。結果在正離子模式下初步比對并推測出1-磷酸鞘氨醇、蘋果酸、皮質醇、油酸酰胺、肉毒堿、二十碳五烯酸、富馬酸二甲酯7種差異代謝物為月中衛氣虛證潛在證候標志物，見表3。

4.3 月末衛氣虛潛在標志物

在正離子模式下，經過PLS-DA，具有2個主成分，R2X=0.202，R2Y=0.989，Q2=0.708；PLS-DA得分圖顯示正常組與模型組被第一主成分完全分開，表明2組間有顯著差異，見圖3。模型組和正常組結果顯示預測能力Q2=0.708，20.2%的X變量可用于解釋2組間98.9%的差異Y。適合于解釋2組間的代謝差異和發現2組間的差異性表達代謝物。結果在正離子模式下初步比對并推測出膽固醇乙酸酯、蘇氨酸、皮質醇、富馬酸二甲酯、油酸酰胺、二十碳五烯酸、焦谷氨酸7種差異代謝物為月末衛氣虛證潛在證候標志物，見表4。

4.4 衛氣虛月周期差異性代謝物挖掘

依據月初、月中、月末3個時間點衛氣虛潛在證候標志物，其中油酸酰胺、皮質醇、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸4種差異性代謝物同時出現在3次實驗中，推測這4種物質影響了衛氣虛證月周期性變化。

5 討論

衛氣具有防御、調節、溫煦等功能，如《靈樞·本藏》所言“衛氣者，所以溫分肉，充皮膚，肥腠理，司開合者也”。衛氣虛證是衛氣的功能減弱降低，其屬于中醫診斷學的一個基本證型，又名肺衛氣虛不固證、肺虛表疏證，指肺氣虛弱、衛表不固的證候。癥見惡風、自汗、時常感冒、氣短乏力、舌淡脈弱等。衛氣虛證是機體在疾病發展過程中某個階段的病理概括，能夠反映疾病特定階段病理變化的本質。每個證候都有其外在證象與內在本質，外在證象通過四診所獲信息辨證所得，而出現外在證象的根本在于內在本質，中醫將其本質歸結于五臟病變與氣血陰陽失調。然而這種解釋難以從現代醫學角度闡釋證的本質，中西醫結合醫學認為中醫證的發生、發展必然有其相應的物質基礎，這些物質決定了證候發生發展的動態變化[9]。有學者從免疫功能、神經調節、熱代謝等方面闡述衛氣與衛氣虛的本質[10-11]，這些研究都從不同層面對衛氣虛證本質做出解釋，但忽略了整體觀念。代謝組學具有整體性、系統性、綜合性的特點，將生物體作為一個完整的系統研究，能夠多靶點、多層面網絡式反映機體內部整體性變化，故本研究采用代謝組學方法研究衛氣虛證的物質基礎。并結合《內經》所言的衛氣月節律循行特點，采取與之相應的動態檢測方式，觀察衛氣虛證代謝標志物的月周期變化。

本研究結果顯示，油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮質醇、脯氨酸、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸、1-磷酸鞘氨醇、蘋果酸、肉毒堿、膽固醇乙酸酯、蘇氨酸、焦谷氨酸等差異代謝物可能為衛氣虛證潛在證候標志物，其中油酸酰胺、皮質醇、富馬酸二甲酯、二十碳五烯酸4種潛在證候標志物貫穿于衛氣虛證月周期變化的始終。這些物質的變化涉及能量代謝，還包括了激素、細胞、神經調節。其中油酸酰胺最早發現于動物腦脊液中，能誘導動物產生生理性睡眠[12]，屬內源性脂肪酰胺，具有生理及神經調節作用。研究表明，油酸酰胺對小鼠產生顯著的鎮靜作用，并能拮抗中樞興奮劑的動物興奮作用，增加慢波睡眠[13]。此外，油酸酰胺對5-羥色胺能神經傳遞具有調節作用，表明其具有外周及中樞神經調節的功能。中醫認為，衛氣的晝夜循行與人體寤寐密切相關，油酸酰胺則可能是衛氣調節人體寤寐的重要物質之一，同時也是衛氣受神經調節的有利證明。二十碳五烯酸是n-3多不飽和脂肪酸，屬必需長鏈不飽和脂肪酸，通過調節脂肪酸合成和β-氧化改善脂肪酸、三酰甘油代謝。同時具有抗腫瘤、降血糖、保護腎臟、改善胰島素抵抗、防治心腦血管疾病的作用[14-15]。富馬酸二甲酯能夠調節細胞氧化還原系統[16]及免疫炎癥[17]，被認為是具有無重大免疫抑制的免疫調節劑。皮質醇是一種糖皮質激素，可以調節糖、蛋白質以及脂肪的代謝，對維持血壓穩定和控制機體的炎癥反應有重要作用[18]。這3種物質均與免疫功能相關，對人體的能量代謝平衡，保護機體防治臟腑疾病有重要意義，這與衛氣的衛外固護、溫養臟腑的功能相一致。這些差異性代謝物質含量的變化勢必影響到衛氣的功能，當其失衡時則出現衛氣功能下降，即衛氣虛證的表現。這些代謝標志物的發現表明，衛氣虛證的月周期性變化可能與能量代謝有關，同時還伴隨著細胞、激素與神經調節，是機體整體多層面網絡式的變化過程。

本研究首次應用代謝組學方法探討衛氣虛的物質基礎，并結合衛氣月節律采取與其相一致的動態檢測方式，觀察衛氣虛證潛在標志物的月周期變化。以期為中醫證候學提供客觀依據，為衛氣學說研究提供新的途徑，揭示衛氣及衛氣虛的本質。由于動物實驗的局限性，研究尚存在不足。課題組將在此基礎上進行人體大樣本研究，以期更為全面闡釋衛氣的實質。

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