丹參通絡解毒湯對骨髓干細胞移植急性心肌梗死模型大鼠炎癥反應的影響

李鑫輝 李雅婧 黃淼鑫 杜建芳 許福麗 肖青 郭晨鶴

摘要：目的 觀察丹參通絡解毒湯對骨髓間充質干細胞（BMSCs）移植急性心肌梗死（AMI）模型大鼠炎癥反應的影響，探討其作用機制。方法 采用全骨髓貼壁法結合密度梯度離心法分離、培養BMSCs。結扎冠狀動脈左前降支建立AMI模型。大鼠隨機分為假手術組、模型組、BMSCs組、丹參通絡解毒湯組、丹參通絡解毒湯+BMSCs組，每組10只。BMSCs細胞懸液直接注入梗死區邊緣心肌組織；各組大鼠給予相應藥物或生理鹽水灌胃。4周后，ELISA測定大鼠血清單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、可溶性細胞間黏附因子-1（sICAM-1）含量，Western blot測定心肌組織Toll樣受體4（TLR-4）蛋白表達，HE染色觀察心肌組織病理形態。結果 與模型組比較，BMSCs組、丹參通絡解毒湯組、丹參通絡解毒湯+BMSCs組大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量及心肌組織TLR-4蛋白表達均顯著降低（P<0.05，P<0.01），且丹參通絡解毒湯組優于BMSCs組（P<0.05，P<0.01），丹參通絡解毒湯+BMSCs組優于BMSCs組、丹參通絡解毒湯組（P<0.05，P<0.01）。結論 BMSCs移植聯合丹參通絡解毒湯能夠抑制AMI模型大鼠的炎癥反應，修復缺血心肌組織，其機制可能與調節TLR-4介導的炎癥反應有關。

關鍵詞：丹參通絡解毒湯；急性心肌梗死；單核細胞趨化蛋白-1；可溶性細胞間黏附因子-1；Toll樣受體4；炎癥反應；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0057-05

Abstract： Objective To explore the effects of Danshen Tongluo Detoxication Decoction on the inflammatory response of rats with bone marrow stem cell （BMSC） transplantation in acute myocardial infarction （AMI）； To discuss its mechanism of action. Methods The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. After the modeling， SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group and BMSCs group （BMSCs transplantation group）， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group， 10 rats in each group. BMSCs cell suspension was injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area； Chinese medicine or normal saline were administered for gavage. 4 weeks later， the contents of MCP-1 and sICAM-1 in each group were detected by ELISA. TLR-4 expression was measured by Western blot method， and HE staining was used to observe the myocardial tissue pathological changes. Results Compared with the model group， the contents of MCP-1 and sICAM-1 and the protein expression of TLR-4 in BMSCs group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group decreased， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group was better than BMSCs group （P<0.05， P<0.01）， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group was better than BMSCs group and Danshen Tongluo Detoxication Decoction group （P<0.05， P<0.01）. Conclusion BMSCs transplantation combined with Danshen Tongluo Detoxication Decoction can restrain the inflammatory response of AMI model rats and repair ischemic myocardium issue， which mechanism may be related to regulating TLR-4 induced inflammatory response.

Key words： Danshen Tongluo Detoxication Decoction； acute myocardial infarction； MCP-1； sICAM-1； TLR-4； inflammatory response； rats

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致殘率逐年增高，成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。近年來骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有取材方便、體外擴增能力強、可來源于自身、應用于臨床的可行性高等優勢[1]，成為治療AMI新途徑研究的熱點。研究顯示，BMSCs的應用可促進心肌組織細胞再生，刺激梗死區毛細血管新生，調節梗死區域心肌組織細胞的凋亡，改善心臟功能[2]。同時，有實驗研究表明，中藥干預BMSCs可調控BMSCs的歸巢、定植以及分化，抑制BMSCs凋亡，為BMSCs移植提供良好微環境[3]。丹參通絡解毒湯由丹參、水蛭、玄參、黃連等配伍組成，全方具有益氣活血、通絡解毒功效，臨床治療冠心病療效顯著[4]。為研究該方對AMI后大鼠的抗炎作用，本實驗通過結扎冠狀動脈左前降支的方法構建AMI大鼠模型，觀察丹參通絡解毒湯對大鼠血清單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、可溶性細胞間黏附因子-1（sICAM-1）含量及心肌組織Toll樣受體4（TLR-4）蛋白表達的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

10～12周齡清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，體質量（200±30）g，用于移植；4～6周幼齡大鼠20只，雌雄各半，體質量（100±10）g，湖南中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005。大鼠采用普通飼料飼養，自由飲食，12 h/ 12 h明暗環境交替。

1.2 藥物

丹參通絡解毒湯（丹參15 g，檀香10 g，水蛭6 g，川芎10 g，當歸15 g，紅花10 g，玄參15 g，黃芩10 g，梔子15 g，黃連6 g，黃芪30 g等），飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，由該院制劑室煎煮，濃縮至含原藥材0.35 g/mL，共350 mL，4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

MCP-1、sICAM-1 ELISA試劑盒、TLR-4單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔HRP標記二抗，上海碧云天生物技術有限公司。SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司；Galaxy型CO2培養箱，英國New Brunswick公司；倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯；多導生理信號采集系統，成都儀器廠；DW-2000型動物人工呼吸機，上海嘉鵬科技有限公司；mini protean 3 cell型電泳儀，BIO-RAD公司。

2 實驗方法

2.1 骨髓間充質干細胞制備和培養

從4～6周清潔級雄性SD小鼠股骨的髓腔中收集細胞，采用全骨髓貼壁法結合密度梯度離心法進行分離、培養。經多次換液和消化，將傳至P3的BMSCs采用流式細胞儀檢查細胞表面抗原，以CD34陽性率低于5%及CD90、CD44陽性率高于95%鑒定所得細胞為高純度的BMSCs。

2.2 造模

參照文獻[5]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后固定，氣管插管連接小動物呼吸機，開胸暴露心臟，于肺動脈圓錐與左心耳右緣之間交點和心尖的假想連線中下1/3處穿線結扎。以心電圖出現QRS波群增高增寬伴ST段抬高、心肌組織顏色發紺為結扎成功；以結扎部位以下心肌組織搏動減弱、顏色變蒼白，及心電圖顯示肢體Ⅱ導聯R波振幅升高、QRS波改變、J點偏移超過0.1 mV或出現病理性Q波，證實大鼠AMI造模成功[6]。

2.3 分組及給藥

當P3或P4代大鼠BMSCs達70%～80%融合時進行移植。SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、BMSCs組、丹參通絡解毒湯組（中藥組）、丹參通絡解毒湯+BMSCs組（中藥+BMSCs組），每組10只。假手術組只穿線不結扎，其余各組進行AMI造模。BMSCs組和中藥+BMSCs組冠狀動脈結扎30 min后，于心肌梗死區邊緣心肌組織3個位點直接注入共100 μL BMSCs細胞懸液（含細胞數3×106），假手術組和模型組則注入100 μL PBS。術后各組分籠飼養，給予常規飼料和飲水，48 h后，每日9：00中藥組和中藥+BMSCs組給予1 mL/100 g丹參通絡解毒湯藥液灌胃，其余各組用給予等量生理鹽水灌胃，連續14 d。

2.4 心肌組織病理改變的觀察

術后4周，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血后，脫頸處死大鼠，迅速取出心臟，用冰生理鹽水沖洗，取左心室缺血處心肌組織置于100 g/L多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋，切片（厚4 μm），HE染色觀察心肌組織的病理改變。

2.5 血清單核細胞趨化蛋白-1、可溶性細胞間黏附因子-1水平測定

術后4周，采集大鼠腹主動脈血5 mL，3500 r/min離心10 min，取血清，ELISA檢測MCP-1、sICAM-1水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.6 心肌組織Toll樣受體4蛋白表達測定

提取心肌組織梗死邊緣區心肌組織總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，電泳后電轉于NC膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜。孵育TLR-4抗體（1∶500）過夜。TBST洗滌3次，加入1∶15 000稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育2 h，TBST洗滌3次，通過熒光掃描儀采集信號，應用Quantity One軟件分析計算灰度值。

3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，進行方差齊性檢驗，方差齊采用方差分析，方差不齊采用非參數檢驗或Welch檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 丹參通絡解毒湯對模型大鼠心肌組織病理形態的影響

假手術組心肌組織未見明顯的病理形態改變，橫紋較清晰；模型組大鼠心肌組織病理形態改變較明顯，心肌組織間質炎性細胞浸潤、細胞腫脹明顯，部分心肌組織細胞變性、壞死，肌束排列不整齊；干細胞移植組細胞腫脹及肌束紊亂程度較模型組減輕；中藥組有炎性細胞浸潤，細胞腫脹輕度，肌束紊亂程度有所改善；中藥+BMSCs組肌束排列較整齊，細胞腫脹輕度，炎性細胞浸潤改善，細胞溶解情況減少。結果見圖1。

4.2 丹參通絡解毒湯對模型大鼠血清單核細胞趨化蛋白-1、可溶性細胞間黏附因子-1含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明顯降低（P<0.05），其中，中藥組優于BMSCs組，中藥+BMSCs組優于中藥組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。

4.3 丹參通絡解毒湯對模型大鼠心肌組織Toll樣受體4蛋白表達的影響

假手術組心肌組織有少量TLR-4表達，模型組TLR-4表達明顯增多（P<0.01）；各給藥組較模型組TLR-4表達明顯減少（P<0.01），其中，中藥組優于BMSCs組（P<0.01），中藥+BMSCs組優于中藥組，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見表2、圖2。

5 討論

AMI后，由于組織缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎癥調節系統，誘導心肌組織細胞壞死、凋亡等梗死后效應，機體為了清除壞死細胞，又進一步激活炎癥反應，從而導致心肌組織損傷[7]，故通過調節AMI后免疫炎癥反應來減輕心肌組織缺血性損傷十分關鍵。AMI是一個急性炎癥過程，大量實驗研究表明，ICAM-1可以介導白細胞和內皮細胞的滾動和穩定黏附，并在MCP-1等炎性因子的協助下啟動局部的炎癥反應，AMI后MCP-1、sICAM-1呈高表達狀態[8-9]。sICAM-1為ICAM-1在組織損傷后經蛋白酶裂解脫落存在于血清中的可溶性形式。TLR-4作為炎性反應的跨膜受體，可通過MyD88依賴性及非依賴性細胞信號轉導途徑實現NF-κB早期及晚期的活化，致使ICAM-1的表達量上調[10]，并促使MCP-1等趨化因子的合成及釋放，開啟炎癥反應。因此，TLR-4與sICAM-1、MCP-1關系密切，都參與AMI過程。本實驗結果顯示，AMI后大鼠心肌組織TLR-4表達增加，而血清sICAM-1、MCP-1水平也呈現高表達狀態，提示AMI可能通過TLR-4激活核因子-κB，從而誘導sICAM-1、MCP-1的表達和釋放，參與AMI的病理過程。

BMSCs是一種存在于骨髓組織中具有自我增殖及能分化為心肌組織細胞、血管內皮細胞潛能的多能干細胞。無論是在動物模型研究還是臨床前試驗中，通過BMSCs移植治療缺血性疾病都取得了顯著的成果[11-12]。有研究顯示，BMSCs不僅具有獨特的免疫學特性，還能在移植后在宿主體內存活并對AMI后病理性免疫反應起到一定的調節作用。中藥干預BMSCs移植可促進BMSCs的歸巢、定植及分化，為BMSCs移植提供良好微環境，從而提高移植后的成活率，增強對缺血心肌組織的保護作用[13]。前期實驗研究表明，疏肝活血中藥可以改善BMSCs移植IRI大鼠心肌病理形態和心功能[14]，益氣活血方對骨髓干細胞具有動員作用[15]。

冠心病屬中醫學“心痛”“胸痹”“真心痛”等范疇，其發病主要是由于六淫犯心、七情內傷、飲食不節、年老體弱等致心臟的陰、陽、氣、血虧損，痰濁、瘀血、氣滯、寒凝等阻于心絡。然而，外邪和內邪在機體中積聚日久，逐漸蘊積成毒，毒損心絡，導致心絡不通，即使心肌組織再灌注治療血液再通，但缺血心肌組織原有代謝毒物未能排出，再灌注產生的氧自由基和炎癥因子等新的“濁毒”對心體的損害又進一步加重。丹參通絡解毒湯是多年臨床經驗方，由丹參、玄參、黃芩、水蛭、川芎等組成，方中丹參主要有效成分丹參酮和丹酚酸具有擴張冠狀動脈、防止心肌組織缺血和心肌梗死、改善微循環、降低心肌組織耗氧量、抑制炎癥反應等作用[16]；川芎有效成分川芎嗪可改善冠狀動脈的血液循環，減輕心肌組織缺血后心肌組織細胞損傷，減少梗死面積[17]；玄參提取物降低炎癥細胞因子過量表達，對心肌組織具有明顯保護作用[18]；黃芩有效成分黃芩素、黃芩苷具有抗氧化、清除自由基的作用，從而修復損傷心肌組織[19]。全方具有益氣活血、通絡解毒的功效。本實驗結果顯示，該方能有效降低AMI大鼠血清sICAM-1、MCP-1含量，減少心肌組織TLR-4的表達，明顯改善心肌組織病理形態，提示丹參解毒通絡湯可能通過抑制TLR-4激活，減少sICAM-1、MCP-1的表達和釋放，從而抑制AMI后的炎癥反應，修復心肌組織損傷。并且，丹參通絡解毒湯聯合干細胞移植對大鼠AMI后干預作用較單純丹參通絡解毒湯和單純干細胞移植干預作用更為顯著，提示丹參通絡解毒湯與BMSCs移植的聯合作用，可以通過抑制TLR-4激活，增強對梗死心肌局部炎癥的抑制作用，進而加強對梗死心肌的修復作用，減輕心室重構。

綜上所述，丹參通絡解毒湯聯合干細胞移植可以抑制大鼠AMI后炎癥反應，改善急性心肌組織缺血大鼠的心肌損傷，其機制可能是通過調節TLR-4介導的炎癥反應實現的。

參考文獻：

[1] DHARMASAROJA P. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of ischemic stroke[J]. J Clin Neurosci，2009， 16（1）：12-20.

[2] 余紅，朱錦云，王建安，等.干細胞治療缺血性心肌病研究進展[J].中國介入心臟病學雜志，2015，23（5）：286-290.

[3] 劉慧萍，谷旭宇，張國民，等.中醫藥在干細胞移植中的作用[J].中華中醫藥學刊，2015，33（3）：606-608.

[4] 李雅婧，李鑫輝，黃淼鑫，等.李鑫輝教授治療冠心病經驗[J].中國中醫急癥，2015，24（11）：1954-1955.

[5] 楊濤濤，肖潁，奚賽飛，等.大鼠心肌梗死模型構建和評價方法的改良[J].中國比較醫學雜志，2014，24（2）：46-51.

[6] 楊洋.加味丹參飲含藥血清對hVEGF165轉染BMSCs移植IRI大鼠心肌血管新生的研究[D].長沙：湖南中醫藥大學，2013.

[7] FRANGOGIANNIS N G. Regulation of the inflammatory response in cardiac repair[J]. Circ Res，2012，110（1）：159-173.

[8] KOBUSIAK-PROKOPOWICZ M， ORZESZKO J， MAZUR G， et al. Kinetics of chemokines in acute myocardial infarction[J]. Kardiol Pol， 2005，62（4）：301-314.

[9] JEGIER B， JASZEWSKI R， KURNATOWSKI P， et al. Mycotic DNA in non-atherosclerotic aortic wall of coronary patients is associated with sICAM-1 expression[J]. Circ J，2010，74（4）：749- 753.

[10] ZEUK E S， ULMER A J， KUSUMOTO S， et al. TLR4-mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial cells by LPS[J]. Cardiovasc Res，2002，56（1）：126-134.

[11] WILLIAMS A R， HATZISTERGOS K E， ADDICOTT B， et al. Enhanced effect of combining human cardiac stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells to reduce infarct size and to restore cardiac function after myocardial infarction[J]. Circulation， 2013，127：213-223.

[12] SPAETH E L， KIDD S， MARINI F C. Tracking inflammation-induced mobilization of mesenchymal stem cells[J]. Methods Mol Biol， 2012，904：?173-190.

[13] 李慧影，馬亞珂，楊岳，等.中藥干預骨髓干細胞治療缺血性心臟病研究進展[J].湖北中醫藥大學學報，2015，17（6）：107-109.

[14] 李鑫輝，黃政德，謝雪姣，等.疏肝活血中藥對骨髓間充質干細胞移植心肌缺血再灌注損傷大鼠心功能和心肌病理形態的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2014，21（8）：54-56.

[15] 李鑫輝，黃政德，蘇麗清，等.益氣活血方動員骨髓干細胞對心肌IRI大鼠血管新生的影響[J].中華中醫藥學刊，2015，33（8）：1848-1850.

[16] 楊志霞，林謙，馬利，等.丹參對心血管疾病藥理作用的文獻研究[J].世界中西醫結合雜志，2012，7（2）：93-97.

[17] 金玉青，洪遠林，李建蕊，等.川芎的化學成分及藥理作用研究進展[J].中藥與臨床，2013，4（3）：44-48.

[18] 李靜，陳長勛，高陽，等.玄參提取物抗炎與抗動脈硬化作用的探索[J].時珍國醫國藥，2010，21（3）：532-534.

[19] 肖靈芝.中藥黃芩的藥理和作用[J].中醫臨床研究，2014，6（3）：133-134.