轉基因大豆質粒DNA標準物質的研制

梁 文， 許 麗， 李蘭英， 李 妍， 聞艷麗， 徐 勤， 任淑貞， 劉 剛

(上海市計量測試技術研究院 化學與電離輻射所，上海 201203)

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轉基因大豆質粒DNA標準物質的研制

梁 文， 許 麗， 李蘭英， 李 妍， 聞艷麗， 徐 勤， 任淑貞， 劉 剛

(上海市計量測試技術研究院 化學與電離輻射所，上海 201203)

為了方便、快速地檢測大豆及其加工食品中的轉基因成分，準確定量轉基因大豆的轉基因含量，構建含常用轉基因插入元件花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、NOS終止子、新霉素磷酸轉移酶基因NPTⅡ、玄參花葉病毒FMV35S啟動子和大豆內源基因Lectin-1的質粒DNA標準物質，質粒DNA中靶基因元件均為單拷貝。開展了質粒DNA標準物質的均勻性、穩定性、檢測適用性、定值及不確定度評價。結果表明，在實時熒光定量PCR(qPCR)檢測中，質粒DNA的4種轉基因插入元件分別與大豆內源基因Lectin-1的比值為0.98±0.06(CaMV35S:L-1)，0.95±0.06(FMV35S:L-1)，1.05±0.08(NOS:L-1)，1.11±0.08(NPTII:L-1)(k=2)，靶基因擴增的標準曲線R2>0.99，可用于轉基因檢測實驗室的結果質量控制，能力驗證等活動。

轉基因大豆； 質粒標準物質； 不確定度評定

0 引 言

轉基因技術將基因在不同物種之間轉移，改造生物的遺傳物質，使其在性狀、營養品質、消費品質等方面向人類所需要的目標轉變，滿足人類的各種需求，例如提高產量、表達特殊營養成分甚至獲得抗除草劑抗病毒或抗蟲害的能力[1-3]。但是，隨著轉基因作物在全世界范圍內的廣泛種植，其食用安全和環境安全問題也引起了廣大消費者和各國政府及相關機構人員的重視[4-5]。轉基因成分檢測已成為各國轉基因產品監管的重要部分。qPCR是轉基因核酸檢測的主要方法[6-7]。轉基因作物中常用的插入元件CaMV35S、NOS、NPTⅡ、FMV35S常作為靶標基因，用于鑒定轉基因成分和含量[8-10]，而轉基因大豆內源基因Lectin-1由于保守性強，常作為大豆內標準靶標基因[11]。

本文首先構建的質粒DNA標準物質含有4個轉基因插入元件和一個大豆內源基因，測序驗證各轉基因元件和內源基因的比例均為1∶1；然后優化了qPCR法檢測靶標基因的引物探針和PCR體系，并用該體系研究了質粒DNA的均勻性、穩定性、檢測適用性、量值及不確定度評價，為其作為轉基因檢測陽性標準物質提供數據支持。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 試劑及儀器

基因組提取試劑盒(OMEGA)；質粒提取試劑盒(OMEGA)；限制性內切酶、λ-Hind III DNA Marker(寶生物工程有限公司)；質粒載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，全基因人工合成、引物合成(寶生物工程有限公司)；轉基因大豆粉末標準物質(ERM-410gk)；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

快速梯度PCR儀(Bio-rad)；實時熒光定量PCR儀(Life technologies)；微量核酸蛋白定量儀(Nanodrop 2000)；電泳儀、電泳槽(BioRad)；凝膠成像儀(BioRad)。

1.2 實驗方法

(1) 質粒DNA分子的構建和提取。在數據庫中檢索轉基因通用元件的保守序列：花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子(269 bp)、NOS終止子(256 bp)、新霉素磷酸轉移酶基因NPT Ⅱ(831 bp)、玄參花葉病毒FMV 35S啟動子(564 bp)，人工合成并插入到質粒載體pcDNA3.1(+)中，得到質粒pLW09，設計引物序列，提取大豆的基因組DNA，克隆大豆內源基因Lectin-1，并插入到質粒載體pLW09，得到轉基因大豆檢測質粒pLW12。將構建的質粒轉入大腸桿菌中，大量提取質粒DNA。

(2) 質粒DNA純度的驗證。用紫外分光光度法測定DNA在A230，A260，A280處的吸光值。純DNA的A260/A280應為1.8～2.0[12]，而A260/A230應達到2.0。用凝膠電泳圖像分析法鑒定單酶切前后的質粒分子。

(3) 實時熒光定量PCR引物探針和程序。參考已報道的檢測4種轉基因元件和大豆內標準基因Lectin-1的引物探針[13]，并根據PCR的擴增效率對引物探針進行優化，序列詳見表1。PCR擴增程序為：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40個循環。

表1 轉基因插入基因及植物內標準基因的引物及探針序列

(4) 適用性考察。梯度稀釋質粒DNA標準物質，濃度從(106～100)copies/μL，以梯度稀釋的質粒DNA標準物質為模板進行qPCR擴增。每個反應重復3次，根據不同濃度模板擴增的Ct值與濃度之間的關系，建立標準曲線。

(5) 均勻性分析。方差分析法是用來統計檢驗均勻性的最常用方法，是通過組間、組內方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統性差異，如果兩者的比小于統計檢驗的臨界值，則認為樣品是均勻的[14]。

具體方法：從質粒DNA標準物質中隨機抽取15瓶；對所取每個樣品取樣3次，每次取樣量為5 μL。每個取樣量用qPCR法進行重復測定，將外源轉基因元件CaMV35S和大豆內標準基因擴增得到的Ct值相比后，對測定結果用方差分析法(F-檢驗法)進行統計，判斷均勻性檢驗結果。

(6) 穩定性考察。穩定性考察包括短期穩定性考察與長期穩定性考察[14]。將制備的質粒DNA標準物質放置在室溫20 ℃和4 ℃下，以轉基因元件和內標準基因在PCR擴增中的Ct比值為特性量值，進行15 d的短期穩定性考察。同樣，分別在樣品制備完成后0～4、6個月對制備的質粒DNA標準物質進行長期穩定性考察。

2 結果與分析

2.1 質粒DNA的分子構建

質粒分子在載體pcDNA3.1(+)上首先連續插入4種轉基因元件CaMV35S(269 bp)、NOS(256 bp)、NPTⅡ(831 bp)、FMV35S(564 bp)，然后再克隆大豆內標準基因Lectin-1(789 bp)，得到總長為8 149 bp的質粒分子(見圖1)。

圖1 質粒分子的結構示意圖

2.2 質粒DNA的純度鑒定

質粒DNA用紫外分光光度計Nanodrop2000檢測，A260/A280=1.89，A260/A230=2.02，均滿足紫外分光光度法鑒定核酸的標準。電泳分析DNA純度，質粒DNA經內切酶Kpn I單酶切處理(37 ℃水浴酶解2 h)，用0.8%瓊脂糖電泳凝膠成像分析DNA條帶(見圖2)。

圖2 酶切前后質粒DNA電泳圖

電泳上樣順序：1-Marker，2-環狀質粒，3-酶切后線狀質粒(50 ng)，4-酶切后線狀質粒(100 ng)

2.3 質粒測序驗證

通過測序驗證質粒DNA的序列與設計序列的一致性和拷貝數的單一性。6家單位的測序結果均表明，轉基因元件和大豆內標準基因的序列和設計序列的正確性為100%，參與測序的6家單位分別是：英濰捷基(上海)貿易有限公司，生工生物工程(上海)股份有限公司、上海美吉生物醫藥科技有限公司，鉑尚生物技術(上海)有限公司，蘇州金唯智生物科技有限公司，上海杰李生物技術有限公司。最終結果顯示轉基因插入元件和內標準基因的比例均為1∶1。

2.4 適用性考察結果

以質粒DNA標準物質建立的標準曲線見圖3，相關線性系數均達到0.99，各梯度之間無交叉，每個靶基因拷貝數檢測的最低檢出限(LOD)均小于100 copies/μL，表明質粒DNA標準物質適合應用于qPCR檢測，可作為qPCR法檢測轉基因作物常用靶基因序列的陽性標準物質。

圖3 質粒DNA靶基因的PCR擴增標準曲線

(圖(a)～(e)的靶基因分別為大豆內標基因Lectin-1，轉基因元件CaMV35S、NOS、NPTⅡ、FMV35S)

2.5 均勻性分析結果

將質粒DNA作為模板，qPCR擴增得到轉基因元件與內標準基因的Ct比值為特性量值，用F檢測對數據進行分析。質粒DNA標準物質的瓶間均勻性統計結果表明，在95%置信水平下，F值均小于F0.05(14，30)，證明各質粒DNA標準物質的瓶間均勻性良好，符合《JJG1006-94 一級標準物質技術規范》瓶間均勻性檢驗合格要求。

2.6 穩定性檢測結果

實驗采用同步穩定性研究，利用qPCR法，將質粒標準物質各轉基因元件基因和植物內標準基因擴增的Ct相比，將比值采用線性模型進行分析。質粒DNA標準物質在20 ℃和4 ℃下的短期穩定性統計結果表明，斜率不顯著(P>0.05)，質粒DNA標準物質在20℃和4℃下保存15 d是穩定的。質粒DNA標準物質在-20 ℃條件下進行6個月的長期穩定性統計結果顯示，斜率不顯著，因此質粒DNA標準物質在-20 ℃條件下保存6個月內是穩定的，見表2。

表2 質粒DNA標準物質pLW12在-20 ℃保存的長期穩定性檢測數據

2.7 定值結果

用qPCR測定轉基因元件和植物內標準基因在PCR反應中的Ct值，以轉基因元件和內標準基因的Ct比值為特性量值給標準物質定值，共得到6組數據，每組平行測定3次取平均值，進行定值分析。匯總全部原始數據，經檢測，全部原始數據符合正態分布，且各組數據等精度。以t-檢驗法和狄克遜(Dixon)法檢驗數據，證明每組數據的平均值不存在顯著性差異；將6個平均值再次計算平均值，求出質粒DNA標準物質的Ct比值的平均值，即為質粒DNA標準物質的特性量值(單位：1)，數據見表3。

2.8 不確定度評定

質粒DNA標準物質的不確定度來源由三部分組成：①標準物質的不均勻性引起的不確定度；②標準物質在有效期內的變動性引起的不確定度；③標準物質的定值過程帶來的不確定度，包括數據統計引入的不確定度和通過對定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度[15]。

表3 質粒DNA標準物質pLW12的定值結果

(1) 均勻性引入的不確定度。均勻性分析結果表明，質粒DNA標準物質的瓶間差異極小。瓶間均勻性引入的不確定度(具體數據見表4)：

(2) 穩定性引入的不確定度。在6個月穩定性檢測中，有效期t=6月長期穩定性引起的不確定度為：

其中：s(β1)為長期穩定性檢驗部分求出的與斜率相關的不確定度因素。

(3) 定值和數據統計引入的不確定度。標準物質定值過程帶來的不確定度包括：數據統計引入的不確定度和通過對定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度。

質粒DNA標準物質由數據統計引入的不確定度為由6組測量結果計算的A類不確定度。合成標準不確定度為下式所示：

通過對測量影響因素的分析，得出B類不確定度的分量(uB)。該分量與標準物質研制的整個過程有關，本研究主要考慮移液器的加樣過程，移液器帶來的不確定度主要為質粒核酸溶液取用的重復性偏差。根據10 μL移液器的檢定結果，最大相對標準偏差為0.38%，按照均勻分布轉化，則

(4) 擴展不確定度。標準物質的合成不確定度：

標準物質的擴展不確定度u(c)計算，取擴展因子k=2，結果見表4。

3 結 語

本研究通過調研國內外轉基因作物PCR相關檢測方法，構建了一個包含4種轉基因常用插入元件靶基因序列CaMV35S啟動子、NOS終止子、新霉素磷酸

表4 質粒DNA標準物質的不確定度分量

不確定度分量CaMV35SFMV35SNOSNPTIIurel(bb)0.0080.0080.0080.007urel(s)0.0240.0320.0400.032urel(A)0.0100.0090.0080.011urel(B)0.0020.0020.0020.002u(c)0.0600.0600.0800.080

轉移酶基因NPTⅡ、FMV35S啟動子和大豆內標準基因Lectin-1的質粒DNA標準物質，使轉基因檢測質粒DNA標準物質中的轉基因元件和作物內標準基因的比例為1∶1，即轉基因含量為100%，利于轉基因成分含量的計算。對質粒DNA標準物質的定值方法進行了探索，應用基因測序法和qPCR兩種方法對質粒DNA標準物質進行了定值；依照標準物質研制技術要求對質粒DNA標準物質的均勻性和穩定性進行了考察，證明其具有良好的均勻性和穩定性。用優化后的qPCR檢測方法，以研制的質粒DNA標準物質為模板，針對5種轉基因檢測靶標基因均能建立線性良好的標準曲線，證明其適用于轉基因大豆的qPCR法檢測。

[1] Nuti M,Felici C, Agnolucci M. The use of GMOs (genetically modified organisms):agricultural biotechnology or agricultural biopolitics?[J]. Riv Biol, 2007, 100(7):189-202.

[2] Jones R. Genetically modified organisms crops in agriculture? Food for thought[J]. Mo Med,2015,112(1):28-29.

[3] Acharya S,Ranjan R, Pattanaik S,etal. Efficient chimeric plant promoters derived from plant infecting viral promoter sequences[J]. Planta,2014,239(2):381-396.

[4] Sweet J. The 10th International Symposium on the Biosafety of Genetically Modified Organisms [J]. Environ Biosafety Res, 2009, 8(3):161-181.

[5] Holst-Jensen A,Bertheau Y, de Loose M,etal. Detecting un-authorized genetically modified organisms (GMOs) and derived materials[J]. Biotechnol Adv, 2012, 30(6):1318-1335.

[6] Peano C, Bordoni R, Gulli M,etal. Multiplex polymerase chain reaction and ligation detection reaction/universal array technology for the traceability of genetically modified organisms in foods[J].Anal Biochem,2005, 346(1):90-100.

[7] Meric S,Cakir O, Turgut-Kara N,etal. Detection of genetically modified maize and soybean in feed samples[J].Genet Mol Res, 2014, 13(1):1160-1168.

[8] Wang X M, Teng D, Yang Y,etal. Construction of a reference plasmid molecule containing eight targets for the detection of genetically modified crops[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 90:721-731.

[9] 朱元招,尹靖東. 抗草甘膦轉基因大豆定量檢測研究[J]. 中國農業大學學報， 2005,10(3):25-29.

[10] 金榮愉,崔海峰. 含多個基因元件的質粒標準分子的構建與分析[J]. 農業生物技術學報, 2013, 21(10):1249-1260.

[11] Huang C,Pan T, Event-specific real-time detection and quantification of genetically modified Roundup Ready soybean[J]. Agric Food Chem, 2005, 53(10):3833-3839.

[12] Lin C H, Chen Y C, Pan T M. Quantification bias caused by plasmid DNA conformation in quantitative real-time PCR assay[J]. PLoS One, 2011, 6(12):e29101.

[13] SN/T 1204-2003 植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法[S].

[14] ISO Guide 35：2006 Reference materials General and statistical principles for certification.Geneva:International Organization for Standardization[S].

[15] 黃文勝,鄧婷婷. 轉基因定量檢測的不確定度研究[J].中國生物工程雜志, 2012, 32(1):49-55.

Development of a Plasmid DNA Reference Material for PCR Analysis of Genetically Modified Roundup Ready Soybean

LIANGWen,XULi,LILan-ying,LIYan,WENYan-li,XUQin,RENShu-zhen,LIUGang

(Chemical and Ionizing Radiation Metrolology Institute, Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology, Shanghai 201203, China)

In order to find a simplified and accurate detection of the genetically modified soybean and its processed food, we developed an unique plasmid molecule for genetically modified soybean PCR analysis, it contained four exogenous target DNA element of genetically modified organisms (CaMV35S, NOS, NPTII and FMV35S), and one element of soybean endogenous (Lectin-1 gene, L-1). All the target genes were inserted into the plasmid with single copy. We quantified the ratios of the exogenous target DNAs and the L-1 as the certified valued of the reference material, and we evaluated the uniformity, stability, and the uncertainty, and examined the applicability of our plasmid. The certified values and expanded uncertainties (k=2) for the candidate reference material in the real time PCR were 0.98±0.06 (CaMV35S:L-1), 0.95±0.06 (FMV35S:L-1), 1.05±0.08 (NOS:L-1), 1.11±0.08 (NPTII:L-1), respectively. TheR2values of the standard curve for target genes were all higher than 0.99. The plasmid reference material can be used in quality control and proficiency testing for GMOs analysis. It is innovative that plasmid DNA standard material containing multiple transgenic testing element and the ratio of gene copy number for each element and soybean is 1∶1.

genetically modified roundup ready soybean; plasmid reference material; uncertainty evaluation

2015-08-06

國家質檢公益性行業科研專項(201310016)；上海市計量測試技術研究院項目(HOORY1406)

梁 文 (1986-)，女，四川德陽人，碩士，工程師，主要研究方向為生物計量。

Tel.：021-38839800*35350；E-mail：liangw@simt.com.cn

Q 819

A

1006-7167(2016)05-0018-04