直接測序法與熒光定量PCR法檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變對比分析

閔生萍

?

·論著研究·

直接測序法與熒光定量PCR法檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變對比分析

閔生萍

目的：比較直接測序和熒光定量PCR法檢測非小細胞肺癌(NSCLC)EGFR基因突變狀態結果的差異。方法:分別采用熒光定量PCR(蝎形探針擴增阻滯突變系統ARMS)和直接測序法檢測155例石蠟包埋NSCLC樣本中EGFR基因18，19，20，21號外顯子突變狀態,比較檢測結果的差異。結果：80例手術切除樣本中，直接測序檢測EGFR突變陽性者25例(31.25%)，ARMS法為28例(35%)，差異無統計學意義(P>0.05)；75例活檢樣本中，直接測序檢測EGFR突變陽性者19例(25.33%)，ARMS法為26例(34.67%)，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論：對于手術切除樣本，直接測序和ARMS法均可有效檢測出EGFR基因突變狀態；但對于活檢組織樣本，ARMS較直接測序靈敏性更高。

癌，非小細胞肺； 表皮生長因子受體； 基因突變; 直接測序; 熒光光定量PCR

隨著癌癥基因組學計劃的實施和藥物基因組學的發展,人們對癌癥發病機制的認識逐步上升到了分子水平。靶向治療隨之迅猛發展，精準醫學的理念亦應運而生，成為惡性腫瘤診療發展的未來方向和必然趨勢。臨床研究已經證實，以吉非替尼等為代表的表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑類(EGFR-TKIs)藥物可顯著延長非小細胞肺癌(NSCLC)患者的無疾病進展生存期和總生存期[1-2]，但其療效與表皮生長因子受體(EGFR)基因突變狀態密切相關，因此，EGFR基因突變檢測成為EGFR-TKIs藥物臨床應用的前提和基礎。目前,EGFR基因突變的檢測方法有很多,主要包搞直接測序法、實時熒光定量PCR、高效液相色譜法等，在臨床檢測中最常用的方法為直接測序和熒光定量PCR法。直接測序法具有較強的特異性，而且可發現未知的突變,其曾被譽為基因突變檢測的“金標準”,但是其步驟繁瑣，耗時較長，結果判讀難度較大。PCR法相對測序而言，靈敏度高、操作簡捷、較易判讀，但其只能檢測已知突變位點。本研究中,筆者分別采用直接測序法和熒光定量PCR法檢測NSCLC樣本中EGFR基因突變狀態,比較2種方法檢測結果的差異,旨在為規范EGFR突變檢測方法的臨床應用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)標本收集:收集蚌埠醫學院第一附屬醫院2014年1月-2016年6月期間,經病理學確診的NSCLC患者組織樣本155例,其中:手術切除樣本80例，氣管鏡活檢樣本55例，經皮肺穿刺活檢樣本20例。(2)樣本處理:腫瘤組織樣本均在離體后1 h內用10%中性福爾馬林固定,常規石蠟包埋,每例樣本均連續切片8～10張,每張厚度為5 μm,第1張用于常規HE染色,確定腫瘤細胞區域，其余用于DNA提取。

1.2 方法 (1)DNA的提取:采用DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國凱杰公司)，參照說明書操作步驟進行石蠟切片DNA提取。采用Thermo Fisher公司的NanoDrop2000超微量分光光度計對提取后的DNA濃度和純度進行檢測，其中OD260/OD280要求在1.8～2.0之間。(2)直接測序分析:根據GenBank公開發表的人EGFR基因序列 (編號AY588246)，采用ABI PrismTM Primer Express 軟件，采用 PCR擴增法分別擴增EGFR 第18～21外顯子。其引物序列分別是：第18號外顯子上游引物(順義鏈)5’-GAGGTGACCCTTGTCTCTGTGT-3’，下游引物(反義鏈)5’-CCCAAACACTCAGTGAAACAAA - 3 ’ ；第 1 9 外顯子上游引物 ( 順義鏈)5’-TGCCAGTTAACGTCTTCCTTCT-3’，下游引物(反義鏈)5’-TGAACATTTAGGATGTGGAGAT- 3 ’ ；第 2 0 外顯子上游引物 ( 順義鏈)5’-ACTTCACAGCCCTGCGTAAAC-3’，下游引物(反義鏈)5’-ATGGGACAGGCACTGATTTGT- 3 ’ ；第 2 1 外顯子上游引物(順義鏈)5’-GAGCTTCTTCCCATGATGATCT-3’，下游引物(反義鏈)5’-GAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’。PCR擴增產物經純化后用ABI377測序儀進行雙向測序，測序結果采用Chromas軟件進行分析。(3)熒光定量PCR檢測:按照人類EGFR基因突變檢測試劑盒(蘇州為真生物科技有限公司)說明書的操作步驟，采用蝎形探針擴增阻滯突變系統(ARMS)法，應用實時熒光定量PCR儀(LightCycler 480II)檢測樣本中EGFR第18～21外顯子的突變情況。PCR擴增過程包括三個階段，第一階段包含1個循環(95℃，5 min)，第二階段包含45個循環(95℃，20s；63℃，40s)，第三階段包含1個循環(40℃，10s)。最終反應結果以試劑盒提供的判讀原則確定標本EGFR基因突變狀態。

1.3 統計學方法 所有統計學檢驗采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

155例入組的患者中，直接測序法檢測到EGFR基因突變陽性者44例，陽性率為28.38%(44/155)；ARMS法檢測到EGFR基因突變陽性者54例，陽性率為34.83%(54/155)，后者陽性率高于前者(P<0.05)。見表1。

表1 直接測序與ARMS法檢測所有樣本EGFR基因突變結果比較

80例手術樣本中，直接測序法檢測到EGFR基因突變陽性者26例，陽性率為31.25%(25/80)，ARMS法檢測到EGFR基因突變陽性者28例，陽性率為35%(28/80)，2種方法檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 直接測序與ARMS法檢測手術切除樣本EGFR基因突變結果比較

75例活檢小標本中，直接測序法檢測到EGFR基因突變陽性者19例，陽性率為25.33%(19/75)，ARMS法檢測到EGFR基因突變陽性者26例，陽性率為34.67%(26/75)，ARMS法檢測小標本中EGFR基因突變的陽性率明顯高于直接測序法(P<0.01)。見表3。

表3 直接測序與ARMS法檢測小樣本EGFR基因突變結果比較

3 討論

肺癌的發病率﹑死亡率在我國及全球范圍內均居惡性腫瘤之首位[3-4],其對人們健康已構成嚴重威脅。以EGFR-TKIs為代表的靶向治療，開辟肺癌治療的新途徑。己有多項臨床研究證實，EGFR突變陽性的NSCLC患者對EGFR-TKIs的反應率顯著高于EGFR野生型患者，無進展生存時間(PFS)和總生存期(OS)也顯著延長[5]。因此，明確NSCLC患者EGFR基因突變狀態及其突變類型，無疑有助于篩選出適合EGFR-TKIs治療的人群。

由于大多數NSCLC患者確診時已處于中、晚期，臨床治療上失去了手術機會，所能獲得的組織樣本樣本更多情況下是活檢小標本。因此，針對這類標本的EGFR突變檢測，選用以上哪種方法更為合適，具有更高的臨床指導作用。本研究重點探討了當前EGFR基因突變檢測工作中應用較為廣泛的兩種方法—直接測序法和ARMS法針對不同組織樣本檢測結果的差異。結果發現，ARMS法檢測EGFR基因突變的總陽性率略高于直接測序法，尤其對于纖維支氣管鏡活檢、經皮肺穿刺活檢等小樣本，差異更為顯著。但對于手術切除等大樣本而言，二者檢測結果差異無統計學意義。本研究結果與趙婧雅等研究結果基本一致[6]。

由于正常細胞對腫瘤細胞EGFR基因突變信號具有抑制作用[7]，檢測腫瘤組織的突變含量至少達到20%才能被直接測序法有效檢出[8]。腫瘤組織樣本中往往混有部分，甚至大部分非腫瘤成份，因此，直接測序法檢測EGFR基因突變的靈敏度較低。而以熒光定量PCR技術為基礎的ARMS法，其特異性探針僅識別并擴增EGFR突變序列，使得突變信號的收集過程較少受到腫瘤組織中混雜的成份的干擾?；贏RMS法的高選擇性及高靈敏性，即使腫瘤組織突變含量低至1%也能被其檢出。由于活檢小標本所含腫瘤細胞數量較少，且比例普遍偏低，導致兩種方法檢測EGFR基因突變在結果上差異性更為顯著。

總而言之，本研究結果提示，對于手術切除大樣本，直接測序和ARMS法均可有效檢出EGFR基因突變狀態，但對于小活檢標本應選用靈敏度相對較高的ARMS法，從而降低假陰性率，使更多患者能及時獲得EGFR-TKI靶向治療。

[1] MITSUDOMI T,MORITA S,YATABE Y,et al.Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2010,11(2):121-128.

[2] MAEMONDO M,INOUE A,KOBAYASHI K,et al.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J].N Engl J Med,2010,362(25):2380-2388.

[3] ZHENG R,ZENG H,ZHANG S,et al.National estimates of cancer prevalence in China,2011.Cancer Lett,2016,370(1):33-38.

[4] JEMAL A,BRAY F,CENTER MM,et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[5] SHI Y,ZHANG L,LIU X,et al.Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer (ICOGEN):a randomised,double-blind phase 3 non-inferiority trial.Lancet Oncol.2013，14(10):953-961.

[6] 趙婧雅，王笑影，曾海英，等.直接測序法與蝎形探針擴增阻滯突變系統檢測肺癌小活檢標本EGFR基因突變的比較[J].中國癌癥雜志，2013，23(2)：106-113.

[7] ELLISON G,DONALD E,MCWALTER G,et al.A comparison of ARMS and DNA sequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:132.

[8] LI J,WANG L,MAMON H,et al.Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing[J].Nat Med,2008,14(5):579-584.

Comparison of direct sequencing and fluorescence quantitative PCR for EGFR mutations detection in Non-small cell lung cancer

MINSheng-ping.(DepartmentofRespiratoryandCriticalMedicine.ThefirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege)

Objective：To compare the differences between fluorescence quantitative PCR and direct sequencing of detecting EGFR mutations in non-small cell lung cancer.Methods:Both direct sequencing and fluorescence quantitative PCR (amplification refractory mutation system, ARMS) were used to detect EGFR mutations in exon 18, 19, 20, and 21 in 155 formalin-fixed and parrffin-embeded (FFPE) NSCLC specimens,and the differences between the two methods were analyzed.Results:In 80 surgical excision samples, EGFR mutations were identified in 25 cases with a mutation rate of 31.5% by direct sequencing, and in 28 cases with a mutation rate of 35% by ARMS, showing no statistical differences in the two detections(P>0.05). In 75 biopsy specimens, EGFR mutations were identified in 19 cases with a mutation rate of 25.33% by direct sequencing, while in 26 cases with a mutation rate of 34.67% by ARMS. There were significant differences of EGFR mutation rate between the two methods(P<0.05).Conclusion:Both direct sequencing and ARMS can effectively identify EGFR mutation in surgical excision samples, but in biopsy specimens, ARMS gains a higher sensitivity than direct sequencing in detection of EGFR mutation.

Cancer,non-small celllung; NSCLC; EGFR; Gene mutation; Direct sequencing; Fluorescence quantitative PCR

蚌埠醫學院第一附屬醫院 呼吸與危重癥醫學科,安徽 蚌埠 233040

閔生萍(1980-)，女，檢驗師，大學。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2016.06.002

R 734.2

A

1008-7044(2016)06-0633-03

2016-09-12)