限食條件下下丘腦神經肽基因表達量對中緬樹鼩體質量調節的影響

朱萬龍, 陳金龍, 葉芳艷, 左木林, 張浩

(1.云南省高校西南山地生態系統動植物生態適應進化及保護重點實驗室，云南師范大學生命科學學院，昆明650500；2.昆明市?？诹謭?，昆明650114)

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限食條件下下丘腦神經肽基因表達量對中緬樹鼩體質量調節的影響

朱萬龍1*, 陳金龍2, 葉芳艷1, 左木林1, 張浩1

(1.云南省高校西南山地生態系統動植物生態適應進化及保護重點實驗室，云南師范大學生命科學學院，昆明650500；2.昆明市?？诹謭?，昆明650114)

為闡明中緬樹鼩Tupaiabelangeri下丘腦神經肽基因表達量在限食條件下的體質量調節作用，本研究測定了限食(正常攝食量的80%)條件下中緬樹鼩的體質量、體脂含量、血清瘦素濃度以及神經肽Y(NPY)、刺鼠相關蛋白(AgRP)、阿片促黑色素原(POMC)和可卡因-安他非明轉錄調節肽(CART)表達量。結果表明：限食極顯著降低中緬樹鼩的體質量和體脂含量(P<0.01)。對照組和限食組的血清瘦素濃度差異有統計學意義(P<0.05)，血清瘦素濃度與體脂含量呈正相關。下丘腦神經肽基因NPY、AgRP、POMC和CART表達量差異有高度統計學意義(P<0.01)。以上結果表明限食可以降低中緬樹鼩的體質量、體脂含量和血清瘦素濃度，調整下丘腦神經肽基因表達量。瘦素通過調節NPY/AgRP和POMC/CART表達量來調節中緬樹鼩的體質量。

食物限制；下丘腦神經肽；中緬樹鼩

生理和行為的可塑性對小型哺乳動物適應環境變化起著重要的作用(Vezina & Williams，2003)。已有研究表明：在長時間尺度上，動物器官的形態和功能與持續耗能有關，而在短時間尺度上與動物的有氧運動能力有關(Speakman & McQueenie，1996；Derting & Austin，1998)。在不可預測的自然環境中，食物資源的可利用性對于動物的生存至關重要(Liang & Zhang，2006)，動物在環境改變(包括食物資源的改變)的條件下會調整自身的體質量、食物攝入量和能量支出，但是最近的研究表明食物攝入量對動物的體質量和能量平衡的影響是不一致的(Zhao & Cao，2009)，如食物限制可以降低大鼠的體質量(Sucajtys-Szulcetal.，2008)，但對小鼠的體質量卻沒有影響(Hambly & Speakman，2005)，因此，在短時間尺度上研究食物資源的改變對于動物能量穩態的可塑性并不清楚。

瘦素對小型哺乳動物的能量攝入和能量支出有著重要的調節作用(Friedman & Halaas，1998)。許多研究表明瘦素與脂肪含量存在正相關關系(Zhuetal.，2011，2012)。此外，還有研究表明食物限制可以降低小型哺乳動物的血清瘦素濃度(Klingensporetal.，2000；Rousseauetal.，2003)。下丘腦神經肽在限食條件下對于動物的生存也很重要。研究表明喂以高脂食物，可以使大鼠的神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)表達量和體質量顯著增加(Toshihiro & Akio，2001)；長期的饑餓使大鼠下丘腦的NPY表達量增加(Sucajtys-Szulcetal.，2008)；哺乳期的大鼠在限食條件下較自由取食組的NPY表達量顯著增加(Abizaidetal.，1997)。長期的饑餓使得實驗組綿羊的體質量、體脂含量顯著下降，而刺鼠相關蛋白(agouti aelated peptide，AgRP)表達量則顯著增加，阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)和可卡因-安他非明轉錄調節肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide，CART)表達量顯著降低(Henryetal.，2001)；在限食的條件下，肥胖型大鼠比健康型大鼠的AgRP表達量增加(Harroldetal.，1999)；同時在食物短缺的條件下，西伯利亞倉鼠Phodopussungorus會增加AgRP表達量以維持能量穩態(Merceretal.，2000)。也有研究表明高脂食物可以顯著增加大鼠的體質量、瘦素濃度和胰島素含量，但對POMC表達量沒有影響(Marcoetal.，2013)，而長期喂食高脂食物的大鼠，其后代的POMC表達量較對照組明顯上調(Lukaszewskietal.，2013)。此外，禁食也可以使大鼠的CART表達下降(Tianetal.，2004)。48 h的饑餓使小鼠的CART表達下降，食欲增加(Yooetal.，2011)。

中緬樹鼩Tupaiabelangeri為東洋界特有種。之前的研究表明，短期的禁食和重喂食可以改變中緬樹鼩的體質量、瘦素濃度、產熱能力和相關生化指標(Gaoetal.，2014)，中緬樹鼩的體質量、能量代謝和下丘腦神經肽基因表達量具有季節性變化(朱萬龍等，2014)，低溫會影響中緬樹鼩的NPY、POMC和CART表達量(張浩等，2015)。因此，本研究在以上研究基礎上從神經水平來探討下丘腦神經肽基因是如何調節限食條件下中緬樹鼩的體質量和能量代謝，同時闡明瘦素是如何作用于下丘腦神經肽基因。

1 材料與方法

1.1 動物來源

中緬樹鼩于2014年6月捕自云南省昆明市祿勸地區，捕捉后帶回云南師范大學生命科學學院(昆明)動物飼養房單盒飼養，中度光照(12L∶12D)，溫度控制在25 ℃±1 ℃，自由取食和飲水。

1.2 動物處理

所捕中緬樹鼩為非繁殖期成年個體。選取18只(10♀，8♂)隨機分為2組：對照組(n=8)，自由取食和飲水；限食組(n=10)，食物量為每日取食量的80%，自由飲水。25 ℃，12L∶12D條件下馴化4 周。第0天和第28天測定體質量和食物攝入量，28 d后處死，測定體脂含量、下丘腦神經肽基因表達量及血清瘦素濃度。實驗前，對照組和限食組中緬樹鼩的體質量差異無統計學意義(P>0.05)。

1.3 體脂含量的測定

對照組和實驗組中緬樹鼩于實驗28 d后處死。體脂含量用索氏抽提法(SoxtecTM2043型浸提儀，福斯中國有限公司)測定(Gaoetal.，2014)。去除尸體內臟，保留消化道上的脂肪，置于烘箱中至恒重(60 ℃)，小型粉碎機將樣品粉碎混勻，稱取2 g左右用干燥濾紙包嚴、烘干、稱重，此時的質量記為a，放入含50%～67%體積乙醚的抽提瓶中，濾紙包的高度低于虹吸管，水浴(70 ℃)加熱、回流，乙醚回流次數控制在每小時120～150滴，回流時間約5 h，抽提完畢，取出的濾紙烘干、稱重，此時的質量記為b。樣品中的體脂含量=a-b。

1.4 血清瘦素濃度測定

對照組和實驗組中緬樹鼩于實驗28 d后處死取血，4 ℃靜置1 h后于4 ℃ 4 000 r·min-1離心30 min，取上層血清置于-80 ℃超低溫冰箱保存。血清瘦素濃度采用瘦素放射免疫分析試劑盒(美國Linco公司)進行測定(朱萬龍等，2014)。

1.5 下丘腦神經肽表達量測定

中緬樹鼩的下丘腦總RNA參照高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.)提供的方法進行提取與純化。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性。提取和純化的RNA置于-80 ℃保存。cDNA第一鏈的合成以下丘腦總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉錄引物，按照M-MLV Frist Strand Kit試劑盒(Invitrogen Co.)方法進行。反應體系為：RNA模板8 μL，10 mM dNTP 1 μL，Oligo(dT) 1 μL，0.1 M DTT 2 μL，5×第一鏈合成緩沖液4 μL，M-MLV 1 μL，RNase ddH2O 3 μL，總反應體系20 μL。反應完畢后，-20 ℃保存。NPY、AgRP、POMC、CART基因cDNA核心序列擴增的引物參照朱萬龍等(2014)。

以上述cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR，反應體系總體積25 μL，其中模板DNA (10 ng·μL-1) 1 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶(4 U·μL-1) 0.5 μL，ddH2O 16 μL，反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃～56 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸90 s，37個循環。RT-PCR產物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用ABI-7000TM熒光定量PCR(FQ-PCR)儀(美國應用生物系統公司)擴增模板cDNA，并檢測熒光信號。FQ-PCR反應體系總體積20 μL，其中模板1.8 μL，KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2×) 10 μL，上、下游引物(200 nM)各0.4 μL，Rox Low 0.4 μL，ddH2O 7 μL。反應條件如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，30個循環；熔解曲線階段95 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s。

采用比較CT值法(2-ΔΔCT法)計算相對定量，公式為：①改變的倍數(fold-change)=2-ΔΔCT；②ΔΔCT=(CT靶基因-CT內參)處理組-(CT靶基因-CT內參)未處理組。對于對照組樣本，ΔΔCT=0，2-△△CT=1，對于實驗組樣本，如果2-△△CT>1，說明該基因表達量增加，如果2-△△CT<1，則說明該基因表達量下降。

1.6 統計分析

采用SPSS 13.0進行實驗數據的統計分析。數據經過正態分布和方差齊性檢驗，符合參數檢驗條件。不同性別中緬樹鼩的生理指標差異無統計學意義，合并所有數據。體質量、體脂含量、血清瘦素濃度和下丘腦表達量的組間差異均采用獨立樣本t檢驗。血清瘦素濃度與體脂含量的關系采用Pearson相關分析。數據以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，P<0.05表示差異具有統計學意義，P<0.01表示差異具有高度統計學意義。

2 結果

2.1 體質量和體脂含量

實驗前對照組和限食組中緬樹鼩體質量分別為121.35 g±2.21 g和122.03 g±2.17 g，差異無統計學意義(t1,16=-0.124，P>0.05)。28 d后，2組體質量差異具有高度統計學意義(t1,16=4.21，P<0.01，圖1)，限食組的體質量較對照組降低了16.94%。2組的體脂含量在28 d后差異具有高度統計學意義(t1,16=3.56，P<0.01，圖2)，對照組和限食組中緬樹鼩體脂含量分別為6.54 g±0.58 g和3.24 g±0.26 g，限食組的體脂含量較對照組降低了50.46%。

圖1 限食條件下中緬樹鼩的體質量變化

*P<0.05,**P<0.01; 下同; the same below.

圖 2 限食條件下中緬樹鼩的體脂含量變化

2.2 血清瘦素濃度和下丘腦表達量

2組中緬樹鼩的血清瘦素濃度在28 d后差異具有統計學意義(t1,16=2.13，P<0.05，圖3)，限食組較對照組降低了32.61%。瘦素濃度與體脂含量呈正相關關系(r=0.54，P<0.05)。限食條件下，2組中緬樹鼩下丘腦神經肽基因NPY、AgRP、POMC和CART表達量差異均具有高度統計學意義(NPY：t1,16=-4.32，P<0.01；AgRP：t1,16=-6.03，P<0.01；POMC：t1,16=2.95，P<0.01；CART：t1,16=2.61，P<0.01，圖4)。

圖3 限食條件下中緬樹鼩的血清瘦素濃度變化

圖4 限食條件下中緬樹鼩的下丘腦神經肽基因的表達量變化

3 討論

在不同食物數量或質量的馴化條件下，小型哺乳動物會出現顯著的體質量變化(Zhang & Wang，2008)。研究表明體質量的改變程度受食物限制程度的影響：如果限食程度較小，動物可以維持能量穩態和體質量平衡，這主要是通過增加消化道吸收能力，調整產熱和降低活動行為；相反，如果限食程度較大，動物就不能維持能量穩態，從而導致體質量下降(Sucajtys-Szulcetal.，2008)。在本研究中，中緬樹鼩的體質量在限食組顯著降低，這與昆明小鼠的研究結果一致(Zhaoetal.，2009)。限食對中緬樹鼩的體脂含量影響差異有高度統計學意義，說明中緬樹鼩在限食條件下需要動員脂肪去彌補食物不足導致的產熱。在限食條件下中緬樹鼩的體質量和體脂含量降低的程度高于溫度馴化實驗中的結果(張浩等，2015)，而與季節性馴化的結果相似(朱萬龍等，2014)，說明中緬樹鼩在野外對于食物的敏感性高于溫度，這可能和其分布有關：中緬樹鼩主要棲息在熱帶亞熱帶地區，環境溫度較高，因此對溫度的敏感度低。

瘦素在小型哺乳動物體質量調節中有重要作用(Abelendaetal.，2003)?！爸|理論”認為血清瘦素水平可以反映體脂含量(Schneideretal.，2000)。本研究結果表明瘦素濃度和體脂含量呈正相關，支持瘦素可以作為一個脂類信號分子(Zhao & Wang，2006)。下丘腦神經肽基因作為調節體質量的影響因素，其中NPY和AgRP為促食類神經肽，其表達量的增加使動物食欲增加，從而增加食物攝入量，導致體質量增加，相反，POMC和CART為厭食類神經肽，其表達量的增加會降低動物食欲，使食物攝入量減少，體質量下降。之前的研究表明：不同的食物質量和數量可以改變大鼠的NPY表達量和體質量(Toshihiro & Akio，2001；Sucajtys-Szulcetal.，2008)；在限食條件下，哺乳期的大鼠較自由取食組的NPY表達量顯著增加(Abizaidetal.，1997)。長期限食使動物的體質量、體脂含量顯著下降，而AgRP表達量則增加，POMC和CART的表達量顯著降低(Henryetal.，2001)；在食物限制的條件下，大鼠和西伯利亞倉鼠的AgRP表達量也會增加(Harroldetal.，1999；Merceretal.，2000)。但也有研究表明高脂食物可以顯著增加大鼠的體質量、瘦素濃度，但對POMC表達量的影響差異不顯著(Marcoetal.，2013)，而長期喂食高脂食物的大鼠，它們的后代POMC表達量較對照組的顯著上調(Lukaszewskietal.，2013)。此外，禁食也可使大鼠和小鼠的CART表達下降(Tianetal.，2004；Yooetal.，2011)。本研究結果表明：限食條件下中緬樹鼩的下丘腦神經肽基因表達量差異均有統計學意義，說明中緬樹鼩在限食環境下，通過增加NPY和AgRP表達量增加食欲，降低產熱，從而維持生存。在限食條件下，由于食物不足，POMC和CART表達量降低，有利于增加食物攝入。瘦素通過參與NPY/AgRP和POMC/CART通路調節中緬樹鼩的體質量和能量代謝。通過比較限食條件和溫度馴化的結果(張浩等，2015)，可以看出瘦素濃度和下丘腦神經肽基因表達量對食物的敏感性更高，這和體質量變化趨勢一致。但考慮到瘦素和NPY、AgRP、POMC、CART四類神經肽均和食物攝入有關，因此在野外環境條件下，中緬樹鼩受哪個因子的作用更強，有待于進一步的研究。

綜上所述，中緬樹鼩在限食條件下通過降低體質量、體脂含量和血清瘦素濃度來維持生存，下丘腦神經肽基因NPY和AgRP表達量顯著增加，而POMC和CART表達量顯著降低。以上結果表明食物是影響中緬樹鼩體質量調節的重要因素，瘦素在限食條件下通過調節下丘腦神經肽基因的表達量來調節其能量穩態。

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4.2 隨著發酵時間的延長，不同混合青貯中主要微生物的數量均呈逐步減少的趨勢，發酵至第11 d時，25%的青貯飼料中乳酸菌達到最高峰；50%、75%、100%的青貯飼料中乳酸菌數量在第20 d時達到高峰。之后乳酸菌數量緩慢下降，75%的青貯飼料中乳酸菌數量下降較慢且數量最多。綜上所述，75%的青貯飼料有利于甜高粱混貯飼料的制作。

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Effects of Hypothalamic Neuropeptide Genes Expression on Body Mass Regulation ofTupaiabelangeriunder Food Restriction

ZHU Wanlong1*, CHEN Jinlong2, YE Fangyan1, ZUO Mulin1, ZHANG Hao1

(1.Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation on Animals-Plants in Southwest Mountain Ecosystem of Yunnan Province Higher Institutes College, School of Life Sciences，Yunnan Normal University, Kunming 650500, China;2.Haikou Forest Farm of Kunming, Kunming 650114, China)

The aim of this study was to examine the effects of hypothalamic neuropeptide genes expression on body mass regulation ofTupaiabelangeriunder food restriction.Body mass, body fat mass, serum leptin level and the expression of hypothalamic neuropeptide genes including neuropeptide Y (NPY), agouti aelated peptide (AgRP), pro-opiomelanocortin (POMC), cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) were measured inT.belangeri.The results showed that the body mass and body fat mass were extreme significantly decreased under food restriction (P<0.01).Significant difference of serum leptin level was observed between control group and food restriction group (P<0.05), and the variation of serum leptin levels showed a positive correlation with body fat mass (P<0.05).The expression levels of hypothalamic neuropeptide NPY, AgRP, POMC and CART were extreme significantly different between the two groups (P<0.01).All of the results suggested that food restriction could reduce body mass, body fat mass and serum leptin level, and regulate the expression of hypothalamic neuropeptide genes.Leptin may adjust body mass by regulating the expression of hypothalamic neuropeptide genes of NPY/AgRP and CART/CART inT.belangeri.

food restriction; hypothalamic neuropeptide;Tupaiabelangeri

2016-01-04 接受日期：2016-01-30 基金項目：國家國際科技合作項目(No.2014DFR31040); 十二五國家支撐計劃(No.2014BAI01B00); 國家自然科學基金項目(No.31360096); 云南師范大學博士科研啟動項目

朱萬龍(1983—), 男, 副教授, 主要從事動物生理生態研究

*通信作者Corresponding author，E-mail：zwl_8307@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160002

Q427; Q95-33

A

1000-7083(2016)03-0404-05