替硝唑對盆腔炎模型大鼠血漿和子宮組織中左氧氟沙星藥動學的影響Δ

黃 艷，孔令希，王 寧#（1.重慶市南川區人民醫院藥劑科，重慶 408400；.重慶醫科大學附屬第一醫院藥學部，重慶 400016）

替硝唑對盆腔炎模型大鼠血漿和子宮組織中左氧氟沙星藥動學的影響Δ

黃 艷1＊，孔令希2，王 寧2#（1.重慶市南川區人民醫院藥劑科，重慶 408400；2.重慶醫科大學附屬第一醫院藥學部，重慶 400016）

目的：探討替硝唑對盆腔炎模型大鼠血漿和子宮組織中左氧氟沙星（LVFX）藥動學的影響。方法：取雌性大鼠，復制慢性盆腔炎模型，將模型大鼠隨機分為實驗組（替硝唑溶液100 mg/kg+乳酸LVFX混懸液80 mg/kg）和對照組（乳酸LVFX混懸液80 mg/kg），每組48只，建模第4天ig相應藥物，分別于給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、12 h各處死6只大鼠，采集血漿和子宮，以環丙沙星為內標，采用高效液相色譜法測定血漿和子宮組織中LVFX濃度，DAS 2.0軟件計算藥動學參數。結果：實驗組和對照組大鼠血漿和子宮組織的藥-時曲線均符合二室模型，主要藥動學參數血漿cmax分別為（15.17±0.87）、（14.94±0.46）μg/ml，子宮組織cmax分別為（14.18±1.20）、（11.86±0.84）μg/ml；血漿tmax分別為（1.42±0.20）、（1.5±0.01）h，子宮組織tmax分別為（1.25±0.27）、（1.17± 0.26）h；血漿t1/2β分別為（7.69±2.61）、（7.32±2.80）h，子宮組織t1/2β分別為（7.95±5.29）、（9.16±3.00）h；血漿AUC0-12h分別為（52.65±6.07）、（51.15±3.53）μg·h/ml，子宮組織AUC0-12h分別為（52.92±5.87）、（42.59±3.91）μg·h/ml；血漿AUC0-∞分別為（61.27±7.93）、（58.86±4.58）μg·h/ml，子宮組織AUC0-∞分別為（60.64±7.20）、（47.41±4.75）μg·h/ml；血漿CL/F分別為（1.37± 0.26）、（1.35±0.10）L/（kg·h），子宮組織CL/F分別為（1.32±0.16）、（1.67±0.17）L/（kg·h）。兩組大鼠子宮組織的cmax、AUC0-12h、AUC0-∞和CL/F差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：替硝唑可明顯提高LVFX在盆腔炎模型大鼠子宮組織中的吸收，降低其消除率；其對血漿中LVFX的吸收幾乎無影響。

替硝唑；左氧氟沙星；盆腔炎；藥動學；雌性；大鼠

盆腔炎（Pelvic inflammatory disease，PID）是由女性生殖道炎癥引起的一組疾病，包括子宮內膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫和盆腔腹膜炎等[1]，是婦科常見疾病。PID能夠引起宮外孕、不孕癥及慢性盆腔疼痛等婦科疾病，是很多婦科疾病發病的重要因素[2]，嚴重影響婦女生殖健康及家庭和睦。PID患者發病部位較多，病情一般較為復雜，且容易發生混合感染等情況，因此其治療較為困難。PID常為混合感染，臨床上多采用左氧氟沙星（Levofloxacin，LVFX）聯合抗厭氧菌藥物替硝唑進行治療[3]，但是聯合使用替硝唑后對LVFX在盆腔組織分布的影響尚未見研究報道，所以有必要從藥動學方面探討替硝唑對LVFX藥動學的影響。本研究通過建立大鼠慢性PID模型，采用高效液相色譜（HPLC）法檢測模型大鼠血漿和子宮組織中LVFX的濃度，觀察聯合用藥后替硝唑對模型大鼠血漿和子宮組織中LVFX藥動學的影響。

1 材料

1.1 儀器

LC-20系列HPLC儀，包括雙泵、梯度洗脫、可調波長紫外檢測器、自動進樣系統和Labsolution工作站（日本島津公司）；GF-1型高速分散器（江蘇其林醫用儀器廠）；TGL-10型高速臺式離心機（白洋離心機廠，離心半徑：12 cm）；SK-1型快速混勻器（江蘇中大儀器廠）；BP61型電子天平（德國Sartoriμs公司）。

1.2 藥品與試劑

乳酸LVFX片（浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：20140214，規格：每片0.2 g）；替硝唑對照品（印度Aarti Drugs公司，批號：140819，純度：99.5%）；LVFX對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130455-200604，純度：97.3%）；環丙沙星（CF，內標，重慶藥友制藥有限公司，批號：060402，純度：98.16%）；甲醇、二氯甲烷為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級健康SD大鼠，♀，體質量180～220 g，由重慶醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK（渝）2012-0001。動物實驗經重慶醫科大學附屬南川人民醫院倫理委員會論證通過。

1.4 菌種

大腸埃希菌標準菌種，由重慶醫科大學附屬第一醫院傳染科實驗室提供，使用時用生理鹽水配制成濃度為1.8×107CFU/ml的混懸液。

2 方法與結果

2.1 慢性PID模型的建立

參照文獻[4]，取大鼠100只，禁食不禁水12 h，iv 3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，剪去下腹正中皮毛，乙醇棉球消毒，于下腹部正中切口2 cm，暴露子宮，用0.1 ml注射器配0.2 ml注射器的針頭，于子宮分岔處進針入左右子宮腔內并行黏膜損傷，將1.8×107CFU/ml的大腸埃希菌混懸液0.1 ml多點注入。建模完成縫合大鼠腹壁肌肉皮膚，碘伏消毒傷口后放回鼠籠，術后自由進食及飲水。

2.2 分組與給藥

成模后，將大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組48只。實驗組大鼠于建模第4天ig替硝唑溶液（100 mg/kg，按人臨床常用劑量折算）和乳酸LVFX混懸液（80 mg/kg，按人臨床常用劑量折算），對照組大鼠同法ig相同質量濃度的乳酸LVFX混懸液。

2.3 標本采集

于給藥后的0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、12 h分別取各組6只大鼠處死，采集血樣，并取出子宮。血樣經5 000 r/min離心后吸取血漿；子宮經濾紙吸干，稱質量后剪碎放入試管中，加入2 ml生理鹽水，制成組織勻漿；血漿和組織勻漿均置于－20℃低溫冰箱中保存，用于LVFX濃度的測定。

2.4 樣品的處理

分別取血漿、子宮組織勻漿上清液500μl，均加入33.6 μg/ml的CF溶液30 μl，渦旋10 s混勻后，加入4 ml二氯甲烷，渦旋提取1 min，3 000 r/min離心2 min，靜置分層，取下層有機相，50℃水浴氮氣吹干，加入100μl流動相復溶，渦旋混勻，進樣40μl。

2.5 LVFX血漿與組織濃度的測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-Ⅱ（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（0.008 mol/L）-磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L）-四丁基溴化銨（25∶75∶4，V/V/V），流速：0.4 ml/min；紫外檢測波長：290 nm；柱溫：40℃；進樣量：40μl。

2.5.2 專屬性考察 取空白血漿、空白子宮組織勻漿、空白血漿+LVFX+CF、空白子宮組織勻漿+LVFX+CF及給藥1 h后的血漿樣品和子宮組織勻漿樣品，處理后進樣測定，記錄色譜。結果顯示，LVFX與CF二者峰形良好，且均不受內源性物質干擾；LVFX保留時間為5.0 min左右，其與CF達到基線分離，分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5.3 線性關系考察 在空白血漿和空白子宮組織勻漿中加入LVFX使其質量濃度分別為18.432、11.52、5.76、2.88、1.44、0.72、0.36、0.18 μg/ml和7.936、3.968、1.984、0.992、0.496、0.248、0.124、0.062 μg/ml，按“2.4”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積。以LVFX峰面積與CF峰面積之比（y）為縱坐標、LVFX質量濃度（x）為橫坐標進行回歸分析。得血漿樣品中LVFX的回歸方程為y血漿＝3.313 9x血漿－0.322（r＝0.999 9），線性范圍為0.18～18.432 μg/ml，定量下限為0.18 μg/ml；子宮組織勻漿樣品中LVFX的回歸方程為y子宮＝3.032 2x子宮－0.277 8（r＝0.999 9），線性范圍為0.062～7.936 μg/ml，定量下限為0.062 μg/ml。

2.5.4 精密度試驗 制備含LVFX高、中、低質量濃度的血漿樣品（11.52、2.88、0.36 μg/ml）和子宮組織勻漿樣品（3.968、0.992、0.248 μg/ml），每個質量濃度5份，按“2.4”項下方法處理后進樣測定，記錄峰面積。同日內測定5次，考察日內精密度；連續測定5 d，考日間精密度。結果顯示，高、中、低質量濃度血漿樣品峰面積的日內RSD分別為4.32%、7.31%、8.42%（n＝5），日間RSD分別為3.25%、4.68%、6.12%（n＝5）；子宮組織勻漿樣品峰面積的日內RSD分別為4.30%、4.93%、8.84%（n＝5），日間RSD分別為5.63%、4.72%、7.26%（n＝5）。

2.5.5 凍融穩定性 制備含LVFX高、中、低質量濃度的血漿樣品（11.52、2.88、0.36 μg/ml）和子宮組織勻漿樣品（3.968、0.992、0.248 μg/ml），每個質量濃度3份，經反復凍融后，按“2.4”項下方法處理，進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，高、中、低質量濃度血漿樣品的峰面積RSD分別為4.84%、9.66%、3.98%（n＝3）；子宮組織勻漿樣品的峰面積RSD分別為6.27%、4.32%、6.38%（n＝3）。

2.5.6 回收率試驗 制備含LVFX高、中、低質量濃度的血漿樣品（11.52、2.88、0.36 μg/ml）和子宮組織勻漿樣品（3.968、0.992、0.248 μg/ml），每個質量濃度5份，按“2.4”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積，依據回歸方程計算LVFX濃度，計算方法回收率。結果顯示，高、中、低質量濃度血漿樣品的方法回收率分別為（100.01±5.9）%、（97.63±7.83）%、（95.43± 8.95）%（n＝5）；子宮組織勻漿樣品的方法回收率分別為（96.21±5.75）%、（97.09±2.69）%、（101.82±9.6）%（n＝5）。

2.5.7 基質效應考察 同“2.5.6”項下方法測定高、中、低質量濃度的血漿樣品和子宮組織勻漿樣品中LVFX的峰面積；另取同上質量濃度的LVFX甲醇液500 μl，氮氣吹干后流動相復溶，測定其中LVFX的峰面積，計算基質效應。結果顯示，高、中、低質量濃度血漿樣品的基質效應分別為（96.18±4.88）%、（96.04±6.83）%、（100.91±3.88）%（n＝5）；子宮組織勻漿樣品的基質效應分別為（97.88±3.98）%、（94.55±3.23）%、（98.29±7.84）%（n＝5）。

2.6 藥-時曲線

取兩組大鼠不同時間點的血漿樣品和子宮組織勻漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積，依據回歸方程計算LVFX濃度，繪制藥-時曲線，結果見圖2。

圖2 兩組大鼠血漿與子宮組織中LVFX的藥-時曲線（n＝6）Fig 2 Plasma concentration-time curves of LVFX in plasma and uterine tissue of rats in two groups（n＝6）

2.7 藥動學參數

采用DAS 2.0軟件自動擬合兩組大鼠血漿樣品和子宮組織勻漿樣品中LVFX濃度的數據結果，按二室模型計算藥動學參數。采用PASS 17.0軟件進行統計分析，組間比較行t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。兩組大鼠體內LVFX的藥動學參數見表1。

由表1可知，兩組大鼠血漿樣品中LVFX的藥動學參數差異均無統計學意義（P＞0.05）；兩組大鼠子宮組織中LVFX的藥動學參數cmax、AUC0-12h、AUC0-∞和CL/F差異有統計學意義（P＜0.05），這說明聯用替硝唑后，LVFX在子宮組織的達峰時間和分布均有所提高，藥物在子宮組織的清除減慢。

3 討論

LVFX體內濃度的測定可采用HPLC法，此法簡便、靈敏、回收率高、重復性好[5]。本研究采用有機相二氯甲烷一次性萃取，簡單方便，萃取率高。在流動相選擇上，本研究采取低濃度甲醇和較高濃度磷酸鹽緩沖液加上一定量的離子極化劑四丁基溴化銨，該流動相可避開血漿或組織中雜峰對藥物峰的影響，使藥物與內標充分分離，峰形良好。本文所采用的方法可適用于生物樣品中LVFX的測定。

表1 兩組大鼠體內LVFX的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of LVFX in rats of two groups（±s，n＝6）

表1 兩組大鼠體內LVFX的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of LVFX in rats of two groups（±s，n＝6）

注：與對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05

參數cmax，μg/ml tmax，h t1/2β，h AUC0-12h，μg·h/ml AUC0-∞，μg·h/ml CL/F，L/（kg·h）V，L/kg對照組11.86±0.84 1.17±0.26 9.16±3.00 42.59±3.91 47.41±4.75 1.67±0.17 3.39±0.57血漿樣品實驗組15.17±0.87 1.42±0.20 7.69±2.61 52.65±6.07 61.27±7.93 1.37±0.26 3.56±1.73對照組14.94±0.46 1.50±0.01 7.32±2.80 51.15±3.53 58.86±4.58 1.35±0.10 2.65±1.02子宮組織樣品實驗組14.18±1.20＊1.25±0.27 7.95±5.29 52.92±5.87＊60.64±7.20＊1.32±0.16＊2.78±0.52

PID是婦科常見病及多發病，引起PID的致病菌通常分為內源性與外源性兩種，內源性病原體為來自寄居于陰道內的菌群，主要包括需氧菌（葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌等）及厭氧菌（消化鏈球菌、消化球菌及脆弱類桿菌等）；外源性病原體包括沙眼衣原體、淋病奈瑟菌及支原體等。多數引起PID的致病微生物是由陰道上行而來的，且多為混合感染，并常為需氧菌及厭氧菌同時感染。在選擇抗菌藥物時，應注意抗菌譜應覆蓋這些常見病原體與厭氧菌[6]，臨床常用硝基咪唑類聯合頭孢菌素或氟喹諾酮類藥物（對頭孢菌素過敏時）治療PID。

LVFX是氧氟沙星的左旋體，抗菌活性約高于氧氟沙星2倍，主要機制是通過抑制細菌DNA的復制發揮藥效，LVFX的生物利用度可高達99%，吸收迅速且組織滲透性強，在血漿及組織中藥物濃度高，適用于敏感菌引起的輕、中度泌尿生殖系統感染，尤其是PID感染[7]。硝基咪唑類藥物包括甲硝唑、奧硝唑、替硝唑等，主要用于厭氧菌感染的治療，臨床上多采用LVFX聯合抗厭氧菌藥物治療PID[8]。兩種抗菌藥物聯合針對PID常見致病菌及厭氧菌廣覆蓋，兩者合用具有協同作用，在臨床上療效顯著。但是對于聯合用藥后對LVFX的藥動學是否改變還未見研究報道。LVFX屬于濃度依賴性的抗菌藥物，聯合用藥后LVFX的濃度是否增加對于治療效果及不良反應的發生密切相關，所以有必要從藥動學方面探討聯合用藥后替硝唑對LVFX藥動學的影響。

本研究通過建立大鼠慢性PID模型，用HPLC法檢測模型大鼠血漿和子宮組織中LVFX的濃度，觀察聯合用藥后替硝唑對模型大鼠血漿和子宮組織中LVFX藥動學的影響。結果顯示，替硝唑與LVFX聯合后，替硝唑可明顯提高后者在模型大鼠子宮組織中的藥物濃度，并且可明顯改變LVFX在子宮組織分布的藥動學參數，如cmax、AUC0-12h、AUC0-∞、CL/F。這提示替硝唑可通過增加LVFX在子宮組織中濃度，達到提高藥效的目的。替硝唑提高LVFX在子宮組織中濃度可能是因為替硝唑有較強的抗炎作用，可改善子宮組織周圍的炎癥反應，降低腫脹，使微循環得到改善，進而有益于LVFX到達子宮組織而提高其濃度。如圖2所示，子宮組織中LVFX藥物濃度的增加均呈現在給藥后4～6 h后。但該作用是否與替硝唑直接影響血管的舒縮有關，尚有待進一步探討。本研究對PID的聯合用藥的藥動學相互作用作了初步的探索，可為臨床用藥提供參考。

[1] 秦君璞，張帝開.盆腔炎性疾病與盆腔痛[J].中國實用婦科與產科雜志，2013，29（3）：170.

[2] 楊秀英.盆腔炎致病因素100例分析[J].中外醫療，2009，28（20）：2.

[3] 孔熙.左氧氟沙星聯合替硝唑治療盆腔炎療效觀察[J].現代中西醫結合雜志，2014，23（14）：1 536.

[4] 黃麗，孫培文，羅雋，等.慢性盆腔炎模型的建立與評價[J].中南藥學，2010，8（6）：469.

[5] 顏永芽，周燕文，石全，等.鹽酸左氧氟沙星片人體藥動學及生物等效性研究[J].中國藥房，2008，19（26）：2 033.

[6] 劉朝暉，廖秦平.盆腔炎性疾病致病微生物及治療方案研究[J].實用婦產科雜志，2010，26（7）：522.

[7] 黃華民.鹽酸左氧氟沙星在盆腔炎治療中的臨床療效及安全性評估[J].中國婦幼保健，2012，27（7）：989.

[8] 中華醫學會婦產科學分會感染性疾病協作組.盆腔炎癥性疾病診治規范：草案[J].中華婦產科雜志，2008，43（7）：556.

Effects of Tinidazole on the Pharmacokinetinetics of Levofloxacin in Plasma and Uterine Tissue of Pelvic Inflammatory Model Rats

HUANG Yan1，KONG Lingxi2，WANG Ning2（1.Dept.of Pharmacy，Chongqing Nanchuan District People’s Hospital，Chongqing 408400，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of tinidazole on the pharmacokinetinetics of levofloxacin（LVFX）in plasma and uterine tissue of pelvic inflammatory model rats.METHODS：Female rats were selected to establish chronic pelvic inflammation model.Those model rats were randomly divided into experimental group（tinidazole 100 mg/kg+lactic acid LVFX suspension 80 mg/kg）and control group（lactic acid LVFX suspension 80 mg/kg），with 48 rats in each group.They were given relevant medicine intragastrically 4th day after modeling.6 rats were respectively sacrificed 0.25，0.5，1，1.5，2，4，8 and 12 h after medication.The plasma and uterine samples were collected.Using ciprofloxacin as internal standard，the concentrations of LVFX in plasma and uterine tissue were detected by HPLC，and the pharmacokinetic parameters were calculated with DAS 2.0 software.RESULTS：Plasma concentration-time curves of LVFX in plasma and uterine tissue of rats in experimental group and control group both fit the two-compartment model.The main pharmacokinetics parameters as follows as cmaxwere（15.17±0.87）vs.（14.94± 0.46）μg/ml for plasma，（14.18±1.20）vs.（11.86±0.84） μg/ml for uterine tissue；tmaxwere（1.42±0.20）vs.（1.5±0.01）h for plasma，（1.25±0.27）vs.（1.17±0.26）h for uterine tissue；t1/2βwere（7.69±2.61）vs.（7.32±2.80）h for plasma，（7.95±5.29）vs.（9.16±3.00）h for uterine tissue；AUC0-12hwere（52.65±6.07）vs.（51.15±3.53）μg·h/ml for plasma，（52.92±5.87）vs.（42.59±3.91）μg·h/ml for uterine tissue；AUC0-∞were（61.27±7.93）vs.（58.86±4.58）μg·h/ml for plasma，（60.64±7.20）vs.（47.41±4.75）μg·h/ml for uterine tissue；CL/F were（1.37±0.26）vs.（1.35±0.10）L/（kg·h）for plasma，（1.32±0.16）vs.（1.67±0.17）L/（kg·h）for uterine tissue.There were statistical significance in cmax，AUC0-12h，AUC0-∞and CL/F of uterine tissue between 2 groups（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Tinidazole can obviously increase the distribution of LVFX in the uterine tissue of pelvic inflammatory model rats，reduce the elimination rate but has no effect on the distribution of LVFX in plasma.

Tinidazole；Levofloxacin；Pelvic inflammation；Pharmacokinetics；Female；Rats

R969.1

A

1001-0408（2016）31-4360-04

2016-06-02

2016-06-27）

（編輯：鄒麗娟）

重慶市衛生計生委醫學科研計劃項目（No.20142188）

＊主管藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。電話：023-64594596。E-mail：379754164@qq.com

#通信作者：主管藥師。研究方向：臨床藥理。電話：023-68898185。E-mail：244702946@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.12