林麝糞便基因組DNA的提取及PCR擴增

康 強，周 鑫，羅 燕，田 青，程建國，趙 位

(1 四川農業大學 a 森林資源保護與利用實驗室，b 微生物學實驗室，c 動物醫學院，四川 都江堰 611830；2 四川養麝研究所，四川 都江堰 611830)

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林麝糞便基因組DNA的提取及PCR擴增

康 強1a，周 鑫1b,1c，羅 燕1b，田 青1b,1c，程建國2，趙 位1b,1c

(1 四川農業大學 a 森林資源保護與利用實驗室，b 微生物學實驗室，c 動物醫學院，四川 都江堰 611830；2 四川養麝研究所，四川 都江堰 611830)

【目的】 探索從林麝糞便中提取基因組DNA并進行物種鑒定的可行性，為林麝野外調查工作以及分子糞便學在林麝保護中的應用提供科學依據?！痉椒ā?采集林麝糞便，采用改良的CTAB抽提基因組DNA；按常規PCR法對mtDNA D-loop區和Cytb基因進行擴增測序后，用DNAMAN 6.0軟件進行系統發育分析；在不同溫度存放不同時間，研究林麝糞便基因組DNA的提取與mtDNA D-loop區和Cytb基因PCR擴增的時效性?！窘Y果】 以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增均能特異性地擴增出mtDNA D-loop區和Cytb基因。系統發育分析結果表明：所擴增產物為林麝的mtDNA D-loop區和Cytb基因。時效性分析結果顯示：常溫和4℃條件下保存96 h以內的林麝糞便所提取的基因組DNA能有效擴增出mtDNA D-loop區和Cytb基因?！窘Y論】 自然條件下林麝糞便中林麝自身體細胞DNA保存時間較長，通過在野外采集林麝糞便提取基因組DNA并進行物種鑒定是可行的。

林麝；糞便；線粒體DNA；D-loop區；Cytb基因

林麝(Moschusberezovskii)是我國一級保護動物，已被列入CITES附錄Ⅰ中[1]。林麝是典型的林棲動物，多棲居在海拔2 000～3 800 m的針闊混交林和陰暗針葉林內，其嗅覺和聽覺都比較發達，但性情膽怯常在黃昏后或拂曉時分進行活動[2]。因此，在對野外林麝的行為生態學和分子進化遺傳學等研究中，通過直接捕獲動物獲取用于分子生物學相關研究的材料較為困難。近年來，在對野生動物進行保護研究時，人們常采用不觸及或不傷害動物體本身，通過收集其掉落的毛發和排放的糞便等非損傷性取樣方法進行采樣[3]。而在所有的非損傷性取樣中，收集糞樣對動物是干擾最小且最容易收集的。隨著分子糞便學的發展，利用糞樣來提取基因組DNA，具有巨大的潛在應用價值[4]。

目前糞便基因組DNA提取的方法主要有酚-氯仿抽提法、Chelex-100 煮沸法、硫氰酸胍裂解法、淀粉吸附法以及商業試劑盒法等[5-6]。但因各種動物食性的差異及糞便所在野外環境的不同等因素影響，不同動物糞便基因組DNA的提取常選取不同的程序[7]。2003年，鐘華等[8]采用預處理-酚/氯仿抽提法對大熊貓糞便DNA提取方法進行了改進，使所提DNA的PCR擴增變得更加容易。2004年，張保衛等[9]采用自創改進方案從大熊貓和小熊貓糞便中提取到高質量的DNA，能有效進行相關基因擴增。2008年，劉宇慶等[10]根據狗獾的食性特征結合多種糞便DNA提取方法優化了狗獾糞便DNA提取方案。近年來，國內外在對林麝進行遺傳學分析或系統發育分析時，已采取多種方式進行基因組DNA的提取。2011年，馮慧等[11]對20世紀50年代左右林麝熟制標本皮張DNA進行了提取，通過對Cytb基因的擴增分析證實，盡管DNA提取物中DNA含量較少，但其線粒體DNA保存較好，能夠擴增出特異性條帶。2012年，白康等[12]通過PCR儀法對采集的林麝毛發樣本進行基因組DNA提取，得到的DNA濃度高、純度好，PCR產物條帶清晰、位置正確。目前，采用糞便為材料提取林麝基因組DNA的報道較少。

本研究結合多種糞便基因組DNA提取方法[13-16]，對林麝糞便基因組DNA提取方案進行優化，通過對線粒體的保守區域Cytb基因[17]以及進化最快的D-loop區[18-19]進行PCR擴增,驗證該方法的可靠性；另外，通過設置溫度差異性處理和時間間隔變量，再進行mtDNA D-loop區和Cytb基因的擴增，探索了不同溫度與時間下糞樣擴增mtDNA D-loop區和Cytb基因的變化情況，對林麝野外調查工作以及分子糞便學在物種鑒定和林麝保護中的應用具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 林麝糞樣 林麝糞便樣品采自四川養麝研究所白沙養麝場和馬爾康養麝場，各10份，糞樣的采集在林麝便后數分鐘內進行。林麝新鮮糞樣用無菌自封袋采集，做好標記后迅速放入有冰袋的冰盒中帶回實驗室，4 ℃保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、10×TaqDNA Reaction Buffer、dNTPs、DNA Marker (DL2000)、Gold View、普通產物純化試劑盒(DP204)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209)等，均購自天根生物有限公司。

1.2 林麝糞樣mtDNA D-loop區和Cytb基因擴增引物

根據 NCBI上提供的林麝Cytb基因全堿基序列，用primer premier 5.0 軟件設計Cytb基因引物；mtDNA D-loop區PCR擴增引物參見文獻[20]。2對引物均由上海生工生物技術有限公司合成，其相關信息見表1。

表 1 mtDNA D-loop區和Cyt b基因的PCR引物序列

1.3 林麝糞樣基因組DNA的提取

林麝糞便基因組DNA的提取按如下方法進行。(1)取林麝糞便6～7粒(約600 mg)于5 mL離心管中，用鑷子將其夾碎，加入2 mL 0.9%的生理鹽水，間歇振蕩1 min至樣本混勻，12 000 r/min 離心2 min，棄上清液。

(2)向沉淀中加入2 mL十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解緩沖液(CTAB 55 mmol/L， NaCl 1.4 mol/L，pH 8.0的Tris-HCl 100 mmol/L，pH 8.0的EDTA 20 mmol/L)振蕩混勻30 s，置65 ℃水浴2 h。

(3)將上述裂解液渦旋15 s，12 000 r/min 離心4 min，轉移上清液1.5 mL至新的5 mL離心管，等體積加入飽和酚-氯仿-異戊醇(V(飽和酚)∶V(氯仿) ∶V(異戊醇)=25∶24∶1)間歇振蕩10 min，12 000 r/min 離心10 min。取上清液至新的5 mL離心管重復該步驟1次。

(4)取上清液按10∶1∶20的體積比分別加入上清液、3 mol/L NaAc和冰預冷無水乙醇，溫和地上下翻轉數次，混勻后置-20 ℃冰箱1 h。

(5)將(4)的提取液12 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入1 mL 體積分數70%的乙醇溶液，用移液器輕輕吹打混勻，12 000 r/min 離心2 min，棄上清，室溫放置數分鐘至沉淀干燥。加入200 μL TE 緩慢混勻溶解沉淀，最后用普通產物純化試劑盒進行純化，得到的林麝糞便基因組DNA置-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 林麝糞樣mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR擴增與測序分析

以提取的林麝糞便基因組DNA為模板，以F1/R1與F2/R2為引物分別進行mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR擴增。PCR擴增采用50 μL反應體系：10×TaqDNA Reaction Buffer 5.0 μL，上、下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，2.0 UTaqDNA聚合酶，基因組DNA 1 μL，最后加ddH2O補足至50 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30次循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠(電壓80 V)電泳檢測，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209)回收目的片段后送生工(上海測序部)測序。

林麝糞樣mtDNA D-loop區和Cytb基因PCR擴增測序結果用Blast在NCBI上進行比對分析，用DNAMAN 6.0軟件進行系統發育樹的構建。其中選取林麝(Moschusberezovskii)、安徽麝(Moschusanhuiensis)、馬鹿(Cervuselaphus)、梅花鹿(Cervusnippon)、馴鹿(Rangifertarandus)、牛(Bostaurus)相關序列進行mtDNA D-loop區系統發育樹構建；選取赤麂(Muntiacusmuntjak)、馬鹿(Cervuselaphus)、大角鹿(Megalocerosgiganteus)、馬麝(Moschuschrysogaster)、安徽麝(Moschusanhuiensis)、林麝(Moschusberezovskii)、黑麝(Moschusfuscus)、喜馬拉雅麝(Moschusleucogaster)、山羊(Caprahircus)、捻角山羊(Caprafalconeri)、長頸羚(Litocraniuswalleri)、東高加索羱羊(Capracylindricornis)、大角驢羚(Kobusmegaceros)、黑驢羚(Kobuslechesmithemani)相關序列進行Cytb基因系統發育樹構建。

1.5 林麝糞樣mtDNA D-loop區和Cytb基因PCR擴增的時效性

先將20份林麝糞便分別編號為1～20,然后將其各分出一半分別對應編號為1′～20′。接著將樣品1～20置于4 ℃保存，樣品1′～20′置于室溫保存(10～20 ℃，平均相對濕度70%)。在保存期間每隔12 h分別隨機取樣進行基因組DNA提取以及mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR擴增，觀察電泳結果。

2 結果與分析

2.1 林麝糞便mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR擴增

以提取的林麝糞便基因組DNA為模板進行mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR擴增，凝膠電泳結果顯示兩者PCR擴增條帶皆與目標條帶預期大小一致(圖1)。PCR產物測序后將測序結果提交至NCBI并進行Blast比對，結果顯示測序序列分別與林麝的mtDNA D-loop區和Cytb基因序列具有很高的同源性(≥99%)，即所擴增基因均為目的基因。

2.2 林麝糞樣mtDNA D-loop區和Cytb基因擴增序列分析

mtDNA D-loop區和Cytb基因各自的系統發育樹構建結果如圖2和圖3所示。從林麝糞樣Cytb基因系統發育樹圖(圖3)可以看出，本研究中測定的Cytb基因序列(FMD1_Cyt_b)在系統發育樹上同時與馬麝、安徽麝和林麝有著很近的進化距離，單從Cytb基因序列無法進行具體的種屬鑒定。但從林麝糞樣mtDNA D-loop區基因系統發育樹圖(圖2)可以看出，所擴增序列與鹿科的馬鹿、梅花鹿等有著明顯的分支，而與麝屬的林麝、安徽麝有著明顯的聚類趨勢，并且與林麝有著很近的進化距離，因此可以特異性地判定所擴增序列為林麝mtDNA D-loop區序列。

M.DNA Marker(DL2000)； 1.林麝糞樣擴增產物

圖 2 林麝糞便mtDNA D-loop區系統發育樹圖

圖 3 林麝糞便Cyt b基因系統發育樹圖

2.3 林麝糞便mtDNA D-loop區和Cytb基因的時效性

林麝糞樣在不同條件(4 ℃和室溫)下保存，每隔12 h分別隨機取2份同一樣品不同溫度處理的糞便樣品進行基因組DNA提取與mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR擴增，電泳結果如圖4和圖5所示。從圖4和圖5可知，林麝糞便在4 ℃及常溫處理條件下，于96 h內都能夠特異擴增出mtDNA D-loop區和Cytb基因序列，說明林麝糞便可以在常溫條件下有效保存較長時間。

M.DNA Marker (DL2000)；1～8.依次為排便后12,24,36,48,60,72,84,96 h 樣品擴增產物 Samples

3 討 論

本研究對林麝糞便樣品提取基因組DNA并進行了mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR擴增，提取的20份林麝糞便基因組DNA都擴增出了這2個基因，說明從林麝糞便中提取基因組DNA并進行分子檢測的成功率較高；同時，時效性研究結果表明，林麝糞便可以在常溫條件下有效保存較長時間，說明分子糞便學在林麝野外采樣調查工作中的應用是可能的。

在利用mtDNA D-loop區與Cytb基因進行系統發育樹構建以鑒定動物種屬關系時，單一的分子鑒定結果有時并不能很好地進行物種鑒定，需要結合多種分子鑒定結果進行物種的精細定位。彭紅元等[21]結合線粒體Cytb、16S rRNA等基因對麝的分子系統進化地位進行了再研究，結果表明在不同基因以及序列長度分析中，不同的物種數目及分析方法對研究結果產生明顯影響。

糞便基因組DNA的提取方法有多種，常規的有硫氰酸胍裂解法、Chelex-100 煮沸法和酚-氯仿抽提法等[7]。林麝為植食性動物，其糞便中含有大量的植物殘渣、消化液、色素、膽鹽、蛋白等雜質，針對其植食性特點本試驗設計并利用基于CTAB法并結合產物純化回收試劑盒來提取林麝糞便基因組DNA。由于林麝糞便中本身含有大量的腸壁脫落細胞、微生物細胞以及植物細胞等，所以提取的糞便基因組DNA為林麝腸道脫落細胞基因組DNA、腸道微生物基因組DNA以及其他未消化植物殘渣基因組DNA的混合物。從本研究中mtDNA D-loop區和Cytb基因的PCR結果來看，所擴增出的目的條帶單一，大小準確，序列NCBI比對結果吻合，說明背景DNA物質對其PCR效果干擾很小，適合用于林麝物種鑒定。本研究試驗前期在對林麝糞便進行基因組DNA提取時林麝糞便用量較少，結果未能很好地擴增出mtDNA D-loop區和Cytb基因，這可能是由于糞便中消化道脫落細胞含量較少，而且遺傳物質會存在一定的降解；之后增加了林麝糞便用量，所提取基因組DNA的PCR擴增效果得到了較大改善。在野外調查工作中，工作人員通常以動物毛發、糞便形狀、活動痕跡等外觀性狀對動物進行分類，而在野生環境中很多動物尤其是親緣性較近的種其形態特征、生活習性十分相近，僅僅依靠野外觀察往往難以確定一個生態系統中的物種組成以及它們之間的演替關系。林麝生性膽小懦怯，對周圍環境變化十分敏感，傳統的如血液、毛發等采樣方法對林麝應激較大，而糞便采集對林麝的影響較小。同時，該研究證明從林麝糞便中可提取基因組DNA，且能夠通過糞便基因組DNA的遺傳信息特異性分析動物種屬進化關系等。因此分子手段的加入定能使野外調查工作更加準確高效。

4 結 論

本研究采用改良CTAB法對常溫和4 ℃條件下保存96 h內的林麝糞便進行基因組DNA的提取，所提取的基因組DNA能有效擴增出林麝自身基因組mtDNA D-loop區和Cytb基因。該研究表明在自然條件下林麝糞便中林麝自身體細胞DNA有較長的保存時間，通過采集野外林麝糞便進行基因組DNA的提取并進行物種鑒定的方法是可行的。

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Extraction and PCR amplification of genomic DNA of forest musk deer feces

KANG Qiang1a,ZHOU Xin1b,1c,LUO Yan1b,TIAN Qing1b,1c, CHENG Jianguo2,ZHAO Wei1b,1c

(1 aLabofForestResourceProtectionandUtilization,bLabofMicrobiology, cCollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity,Dujiangyan，Sichuan611830，China; 2SichuanInstituteofMuskDeerBreeding,Dujiangyan,Sichuan611830,China)

【Objective】 This study explored the feasibility of genomic DNA extraction and species identification from forest musk deer feces to provide scientific basis for field investigation and application of deer molecular scatology in protection of forest musk deer.【Method】 Genomic DNA of forest musk deer feces was extracted by the modified CTAB extraction method.Cytbgene and mtDNA D-loop region were amplified by PCR.Both sequences were analyzed by DNAMAN 6.0 software.The timeliness of genomic DNA extraction and PCR amplification of mtDNA D-loop region andCytbgene was investigated at different temperatures.【Result】 Genomic DNA of forest musk deer feces could be extracted,and the phylogenetic analysis showed that both mtDNA D-loop region andCytbgene could be amplified.Timeliness analysis showed that mtDNA D-loop region andCytbgene could be specifically amplified within 96 h at both room temperature and 4 ℃.【Conclusion】 The DNA of musk deer in feces can be preserved at a long time under natural conditions.It is feasible to conduct species identification by collecting forest musk deer feces in the wild.

forest musk deer;feces;genomic DNA;D-loop region;Cytbgene

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.001

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.002.html

2015-06-04

四川省林業廳省級自然保護區重點物種科學研究項目；四川農業大學院級專項

康 強(1963-)，男，四川彭州人，副教授，本科，主要從事森林資源管理及保護研究。E-mail：283755855@qq.com

羅 燕(1974-)，女，四川都江堰人，教授，博士，主要從事野生動物保護及病原微生物與分子生物學研究。 E-mail：lycjg@163.com

S865.4+1

A

1671-9387(2016)11-0001-07