玉夏膠囊對自發性高血壓大鼠心肌損傷的保護作用

沈媛媛，盧毅寧，胡坤媚，胡浩然，郝 偉，楊解人

(皖南醫學院 國家級中藥藥理三級實驗室，安徽 蕪湖 241002)

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·基礎醫學·

玉夏膠囊對自發性高血壓大鼠心肌損傷的保護作用

沈媛媛，盧毅寧，胡坤媚，胡浩然，郝 偉，楊解人

(皖南醫學院 國家級中藥藥理三級實驗室，安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察玉夏膠囊對自發性高血壓大鼠(SHR)心肌iNOS、NADPH氧化酶亞單位p22phox和p47phox表達的影響，探討玉夏膠囊對SHR心肌損傷的保護作用機制。方法：14周齡雄性SHR 28只,隨機分為SHR模型組[0.5% 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5 mL/kg]、玉夏膠囊高、中、低(0.6、0.3、0.15 g/kg)劑量組，每組7只。另設WKY(0.5% CMC-Na 5 mL/kg)正常對照組7只。各組每日灌胃1次，連續10周，于給藥前和末次給藥后尾袖法測定血壓；比色法測定心肌組織SOD、MDA、T-AOC及H2O2的含量；硝酸還原酶法測定心肌組織NO含量；免疫組化法表達心肌誘導型一氧化氮合酶(iNOS)陽性細胞；Western Blot表達心肌組織iNOS、p22phox及p47phox蛋白。結果：玉夏膠囊隨著劑量的增加，能顯著降低SHR的血壓(P<0.05或P<0.01)，減少SHR心肌組織MDA、H2O2及NO的含量(P<0.05或P<0.01)，提高SOD和T-AOC的含量(P<0.05或P<0.01)，抑制心肌iNOS陽性細胞表達，下調心肌iNOS、p22phox和p47phox蛋白(P<0.05或P<0.01)。結論：玉夏膠囊具有抗SHR心肌氧化應激的作用，其機制可能與下調心肌iNOS及p22phox、p47phox所介導的氧化應激損傷有關。

玉夏膠囊；自發性高血壓大鼠；氧化應激；iNOS；p22phox；p47phox

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.003

高血壓是心腦血管疾病主要的危險因素，其中高血壓性心臟病是高血壓最常見并發癥[1]。近年來研究表明，高血壓心臟病進程中常伴有氧化應激(oxidative stress)，后者在高血壓的病程發展中起著重要作用[2]。研究表明高血壓病理狀態下一氧化氮合酶(iNOS)和NADPH氧化酶這兩種酶的表達和活性都被不同程度的誘導增強，導致機體氧化應激損傷[3-5]。玉夏膠囊主要成分含夏枯草、玉米須、萊菔子及防己等。文獻報道，玉夏膠囊對不同證型的高血壓病患者均有顯著的降壓效果[6-8]。動物實驗發現玉夏膠囊對腎性高血壓大鼠具有降壓作用[5]。但關于玉夏膠囊對自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌損傷的保護作用未見報道。故本研究選用SHR為對象，觀察玉夏膠囊對SHR心肌氧化應激損傷的保護作用，并通過研究iNOS及NADPH 氧化酶亞單位p22phox、p47phox的蛋白表達來探討其可能機制，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 動物 SPF級14周齡雄性SHR 28只，Wistar- Kyoto ( WKY) 大鼠 7 只，體質量260～320 g，許可證號：SCXK(京)2015-0001，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠單籠飼養，自然光照，自由進食(飼料購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場)飲水，室溫23～25℃，相對濕度60%～65%。

1.2 藥物、試劑與儀器 玉夏膠囊(安徽省蕪湖市中醫醫院制劑室提供，0.3 g/粒)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)及BCA蛋白檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)；即用型SABC和DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗大鼠iNOS抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、兔抗大鼠p22phox和p47phox抗體(美國Sant Cruz 公司)；小鼠抗大鼠GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(江蘇碧云天生物技術研究所)；LunimataTM Crescendo 發光液(美國Millipore 公司)。ALC-NIBP無創血壓測定分析系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)，DNM-9602型酶標儀(北京普朗新技術有限公司)，Eppendorf 離心機(德國Eppendorf公司)，電泳系統、轉膜系統(北京市六一儀器廠)，化學發光成像系統(美國Bio-Rad 公司)，石蠟切片機(德國Leica公司)，BX-41型奧林巴斯顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 分組及給藥 玉夏膠囊成人量1.2 g/日，按人體質量為60 kg計算，折算大鼠等效量是0.15 g/日，按2倍遞增依次為0.3 g/kg、0.6 g/kg。將SHR 28只適應性喂養1周后隨機分為SHR模型組(0.5% CMC-Na 5 mL/kg)，玉夏膠囊高、中、低(0.6、0.3、0.15 g/kg)劑量組，每組7只。另設WKY正常對照組(0.5% CMC-Na 5 mL/kg)7只。按上述設定劑量于每日下午3時給藥，連續10周。

1.4 血壓測定和標本采集 分別于給藥前及末次給藥后尾袖法測大鼠尾動脈舒張壓(DBP/mmHg)。1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取心臟，分離左心室，取部分左心室制備10%組織勻漿，用于測定SOD、MDA、T-AOC、H2O2和NO的含量；另取部分左心室4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規石蠟包埋，用于免疫組化測定。剩余左心室放置-80℃冰箱保存，用于Western blot。

1.5 生化指標測定 BCA法測定心肌蛋白濃度；比色法、ABTS法、二甲酚橙比色法分別檢測心肌SOD、MDA、T-AOC和H2O2含量；硝酸還原酶法測定心肌NO含量。具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.6 免疫組化法表達心肌組織iNOS陽性細胞 取心肌石蠟切片(厚度5 μm/片)，常規脫蠟至水，抗原修復，封閉，iNOS一抗(1∶100)4℃過夜，二抗(1∶200)，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察胞質內iNOS陽性細胞表達(陽性表達呈黃至棕黃色顆粒)。大鼠染色切片在相同條件下隨機選取6個區域拍攝，采用 Image-pro plus 6.0 圖像分析軟件半定量分析，測定平均積分光密度值 (AIOD)，AIOD越大表示iNOS表達愈高，反之則表達愈低。

1.7 Western blot 表達心肌組織iNOS、NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox蛋白 低溫提取心肌蛋白。每孔上樣40 μg蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，轉膜，封閉，分別加入GADPH (1∶1000)、 iNOS (1∶400)、p22phox(1∶200)和p47phox(1∶200)一抗4℃過夜，加入相應二抗 (1∶2000)，室溫孵育2 h，加發光液，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統進行拍攝，用Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件測定集成光密度值。

2 結果

2.1 玉夏膠囊對SHR尾動脈舒張壓的影響 給藥前各組大鼠舒張壓明顯高于WKY組(P<0.01)；給藥10周后，與WKY組比，SHR組舒張壓顯著升高，玉夏膠囊各給藥組舒張壓較SHR組明顯降低(P<0.01)，且玉夏膠囊高劑量組降壓效果最為明顯，提示玉夏膠囊具有一定的降壓作用(見表1)。

組別劑量/(g/kg)血壓/mmHg給藥前給藥10周后WKY-96±10.6797±11.20SHR-151±11.15**175±13.05**+玉夏0.6152±12.56**126±14.49##+玉夏0.3156±9.20**134±15.98##+玉夏0.15153±15.17**148±14.67##F值31.9929.57P值0.000.00

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR。

2.2 玉夏膠囊對SHR心肌組織SOD、MDA、T-AOC和H2O2含量的影響 與WKY組比，SHR組心肌組織勻漿MDA和H2O2含量顯著升高(P<0.01)，SOD和T-AOC含量明顯降低(P<0.01)；與SHR組比，玉夏膠囊各劑量組MDA和H2O2含量明顯下降(P<0.05或P<0.01)，SOD和T-AOC含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，提示玉夏膠囊具有一定的抗氧化作用(見圖1)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR；FSOD=20.99，FMDA=24.11，FT-AOC=45.84，FH2O2=68.40。

2.3 玉夏膠囊對SHR心肌組織NO含量的影響 與WKY組比，SHR組心肌組織NO含量明顯上升(P<0.01)；與SHR組比，玉夏膠囊各劑量組均有不同程度的下降(P<0.01)，提示玉夏膠囊可以降低SHR心肌NO含量(見圖2)。

2.4 玉夏膠囊對SHR心肌iNOS陽性細胞表達的影響 免疫組化結果顯示，SHR組心肌iNOS陽性細胞表達顯著高于WKY組(P<0.01)；與SHR組比，玉夏膠囊各劑量組隨著劑量增加心肌iNOS陽性細胞的表達顯著降低(P<0.01)，提示玉夏膠囊能降低SHR心肌iNOS陽性細胞的表達(見圖3)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR，F=48.23。

圖2 玉夏膠囊對SHR心肌組織NO含量的影響

圖3 玉夏膠囊對SHR心肌 iNOS陽性細胞表達的影響

A：WKY組；B：SHR組；C：玉夏0.6 g/kg組；D：玉夏0.3 g/kg組；E：玉夏0.15 g/kg組；*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P<0.01vs. SHR。

2.5 玉夏膠囊對SHR心肌iNOS蛋白表達的影響 Western blot檢測發現，SHR組心肌iNOS蛋白的表達水平顯著高于WKY組(P<0.01)；與SHR組比，玉夏膠囊高、中劑量組能顯著下調SHR心肌iNOS蛋白的表達(P<0.01)，提示玉夏膠囊可下調SHR心肌iNOS蛋白表達(見圖4)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR。

圖4 玉夏膠囊對SHR心肌iNOS蛋白表達的影響

2.6 玉夏膠囊對SHR心肌p22phox和p47phox蛋白表達的影響 與WKY組比，SHR組心肌p22phox和p47phox蛋白表達明顯上調(P<0.01)；與SHR組比，玉夏膠囊各劑量組p22phox和p47phox蛋白表達均有不同程度的下調(P<0.05或P<0.01)，提示玉夏膠囊具有下調SHR心肌p22phox和p47phox蛋白的作用(見圖5)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR。

3 討論

SHR是一種與人類原發性高血壓相似的遺傳高血壓模型。研究表明，長期高血壓可導致左心室肥厚和心肌纖維化等心肌損傷[9]。文獻報道，心肌損傷的各個環節都有氧化應激的參與[2]。氧化應激是活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)或自由基(O2-、H2O2和OH-)在細胞內或細胞外產生對細胞有毒性的一種應激狀態[10]。MDA含量可間接反映機體脂質過氧化程度，H2O2是活性氧代謝的副產物，SOD是生物體內一種重要的抗氧化物酶，T-AOC是機體包括酶促和非酶促體系的抗氧化能力衡量指標。本研究發現26周SHR心肌氧自由基(MDA、H2O2)明顯升高，而抗氧化能力(SOD、T-AOC)明顯減弱，提示SHR心肌存在明顯氧化應激狀態。當給予玉夏膠囊治療10周后，SHR心肌組織SOD活性和T-AOC能力明顯提高，MDA和H2O2含量顯著降低，說明玉夏膠囊對SHR心肌的氧化應激損傷具有一定保護作用，其保護作用可能與玉夏膠囊組方中萊菔子和防己增加大鼠心肌組織SOD活性，降低MDA含量，清除氧自由基，提高總抗氧化能力，改善氧化應激有關[11-12]。但玉夏膠囊是通過何種機制來改善SHR心肌氧化應激損傷？為此本研究從iNOS-NO通路及NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox途徑，探討玉夏膠囊抗SHR心肌氧化應激損傷的可能機制。

心肌細胞內主要存在iNOS。生理狀態下心肌細胞內iNOS含量極少，病理狀態下在細胞因子(如TGF-β1、TNF-α)等刺激后，可誘導ROS聚集，心肌細胞內iNOS表達增加，產生大量NO[3]。NO是參與體內信號傳導的氣體信號分子，與超氧離子(O2-)反應生成亞硝基，造成氧化應激損傷[13-14]。故本實驗采用硝酸還原酶法測定心肌NO含量，免疫組化法和Western Blot法分別檢測心肌組織iNOS陽性細胞和蛋白。結果發現SHR心肌組織中NO含量增高，iNOS陽性細胞和蛋白表達明顯上調，說明SHR心肌iNOS蛋白大量表達，過量NO產生，從而引起心肌氧化應激損傷。通過玉夏膠囊治療10周后，SHR心肌組織內NO的含量明顯下降，iNOS陽性細胞和蛋白表達明顯下調，提示玉夏膠囊減少NO產生，下調iNOS蛋白表達，改善SHR心肌氧化應激損傷。

NADPH氧化酶存在于吞噬細胞以及非吞噬細胞，主要有位于胞膜的p22phox和gp91phox以及胞質中的p47phox、p67phox等亞單位,是心血管組織中ROS的主要來源[14]。NADPH氧化酶過度激活，促使ROS大量生成，導致氧化應激損傷，參與高血壓及其并發癥的形成[4-5]。本研究發現SHR心肌p22phox、p47phox蛋白表達均升高，給予玉夏膠囊治療后，SHR心肌p22phox、p47phox蛋白表達顯著下降，說明玉夏膠囊通過下調心肌NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox通路，改善心肌氧化應激損傷。

綜上所述，玉夏膠囊對SHR心肌氧化應激損傷具有保護作用，其機制可能通過降低心肌自由基含量，提高抗氧化能力，抑制心肌iNOS-NO以及 NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox所介導的通路密切相關，確切機制有待于進一步研究。

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Protective effect of Yuxia capsule on myocardium injury in spontaneously hypertensive rats

SHEN Yuanyuan,LU Yining,HU Kunmei,HU Haoran,HAO Wei,YANG Jieren

National Grade Three Laboratory for Traditional Chinese Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To investigate the mechanisms of Yuxia capsule in protecting the myocardium injury in spontaneously hypertensive rats(SHR) through observing the effect of this agent on the expression of iNOS,NADPH oxidase subunits p22phoxand p47phox.Methods:Twenty-eight male SHRs,aged 14-week,were randomized into SHR model group (0.5% CMC-Na,5 mL/kg)，high dosage group( Yuxia capsule,0.6 g/kg),middle dosage group(0.3 g/kg) and low dosage group(0.15 g/kg)(n=7 for each group).Another 7 Wistar-kyoto( WKY) rats were included as normal control group (0.5% CMC-Na,5 mL/kg).Rats in each group intragastrically administrated with Yuxia capsule once a day for consecutive 10 weeks,measured for the blood pressure by tail cuff before and final administration.The changes of rat myocardium MDA,H2O2,SOD,T-AOC and NO levels in myocardium homogenate and expression of myocardium iNOS positive cells were determined by immunohistochemistry and the expression of iNOS,p22phoxand p47phoxprotein was detected by Western blotting.Results:Increased dose of Yuxia capsule had significantly decreased the blood pressure (P<0.05 orP<0.01) and reduced the levels of MDA,H2O2and NO,yet enhanced the levels of SOD and T-AOC in myocardium (P<0.05 orP<0.01) as well as inhibited expression of iNOS,p22phoxand p47phoxprotein and iNOS positive cells in the myocardium (P<0.05 orP<0.01).Conclusion:Yuxia capsule could decrease the expression of iNOS,p22phoxand p47phoxprotein to reduce oxidative stress at myocardium in SHR,suggesting that this agent has protective effect on myocardium damage in SHRs.

Yuxia capsule；spontaneously hypertensive rats；oxidative stress；iNOS；p22phox；p47phox

1002-0217(2016)06-0519-05

2016-05-30

沈媛媛(1989-)，女，2014級碩士研究生，(電話)18255363538，(電子信箱)471007201@qq.com； 楊解人，女，教授，碩士生導師，(電子信箱)jryang1955@sina.com，通信作者.

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