結合珠蛋白基因多態性與未足月胎膜早破的臨床研究

馬少平，孔麗娜

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 婦產科，安徽 蕪湖 241001)

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·臨床醫學·

結合珠蛋白基因多態性與未足月胎膜早破的臨床研究

馬少平，孔麗娜

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 婦產科，安徽 蕪湖 241001)

目的：探討結合珠蛋白(haptoglobin，Hp)基因多態性與未足月胎膜早破的關系，為未足月胎膜早破的遺傳病因學提供理論依據。方法：應用序列特異性引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP)進行基因分型檢測，分析Hp基因型Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型在正常足月分娩孕婦組(對照組)和未足月胎膜早破孕婦組(研究組)的分布。結果：等位基因Hp1和Hp2在正常孕婦和未足月胎膜早破患者的分布頻率分別為39.06%、60.94%和28.0%、72.0%，兩組等位基因頻率和基因型頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)。結論：在中國漢族人群中，結合珠蛋白基因多態性與未足月胎膜早破發生無相關性，其基因型分布不是中國漢族孕婦未足月胎膜早破發病原因。

胎膜早破;結合珠蛋白;基因;多態性

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.014

胎膜早破(尤其是未足月胎膜早破)對母兒有較大危害。據報道胎膜早破導致的新生兒病死率和發病率分別為18%～20%和21.4%。未足月胎膜早破對母兒的影響與破膜時孕周和分娩時孕周相關，孕周越小，危害越大。結合珠蛋白(haptoglobin，Hp)，又稱觸珠蛋白，是一種α2唾液酸糖蛋白。Hp有三種主要的基因型：Hp1-1，Hp2-2和雜合子Hp2-1。Jin-Kyung等[1]對34例足月胎膜早破的韓國孕婦及187例正常足月孕婦進行研究，認為Hp1等位基因是胎膜早破的易感基因。目前認為足月胎膜早破與未足月胎膜早破的發病機制可能有所不同，Hp基因多態性與未足月胎膜早破的關系暫無相關報道。本研究旨在探索Hp基因多態性與未足月胎膜早破的關系，從分子生物學水平上探討未足月胎膜早破的病因，為早預測、早預防胎膜早破提供臨床診治依據，從而降低母兒發病率及病死率。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取2014年 3月 1 日～8 月 31 日在弋磯山醫院住院的25例未足月胎膜早破孕婦作為研究組,頭位、無其他產科合并癥，無內外科合并癥，無宮頸機能不全，無宮頸環扎、羊膜腔穿刺術史，胎膜破裂前無外傷及性交等誘因。選取同期的32例正常足月待產孕婦作為對照組。對照組孕婦無產科合并癥，無內外科合并癥。所有對照組孕婦均隨訪至分娩，未發生胎膜早破及其他合并癥。

1.2 主要設備和試劑 TC9600-G-230V多功能梯度PCR儀(美國Labnet)TG16。胎膜早破診斷標準參照謝幸主編的第八版《婦產科學》[2]：孕周明確，有明確陰道流液史，窺陰器檢查可見液體自宮頸流出，或后穹窿處有積液，陰道液酸堿度檢查pH值>6.5。微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，引物合成參照文獻，上游引物A：5′-GCTGTCACTGCTGCGTAAAG-3′；下游引物B：5′-GGTCAGTCTTTGGTTGGGTAG-3′：上游引物C：5′-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3′；下游引物D：5′-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3′；由生工生物工程(上海)股份有限公司合成特異性引物，PCR擴增試劑盒由Promega(北京)生物技術有限公司提供；DNA提取試劑盒及DNA Markers由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取和檢測 嚴格依照試劑盒說明書進行操作提取，應用核酸蛋白測定儀檢測所提取DNA樣本。

1.3.2 PCR擴增 PCR反應體系 包括模板DNA3 μL，2.5U/L Tap DNA Polymerase 2 μL，10×Tap buffer(含Mg2+) 2.5 μL，10 μm上下游引物各0.5 μL，超純dNTP Mixture(2.5 mmol/L each) 2 μL，加入DEPC水補至25 μL體系。引物A和B及引物C和D擴增體系相同。反應條件：引物A和B擴增時，95℃預變性5 min，95℃變性1 min，69℃退火2 min，72℃延伸2 min，共35個循環，末次循環后72℃充分延伸10 min，冷卻至4℃。引物C和D擴增時，95℃預變性5 min，95℃變性1min，69℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環，末次循環后72℃充分延伸10 min，冷卻至4℃。

1.3.3 PCR產物Hp基因型的鑒定 取PCR擴增產物5 μL，與2 μL 6×DNA電泳Loading Buffer混合均勻后，依次點樣于1.5%瓊脂糖凝膠加樣孔中，并點樣相匹配的DNA Marker。電壓80 V，電泳40 min。應用Tanon2500全自動數碼凝膠圖像分析系統，在紫外燈下檢測并攝像，通過觀察電泳圖，進行Hp基因型分型。

1.4 統計學方法 按Hardy-Weinberg平衡法確定樣本代表性，基因計數法計算出相對等位基因頻率，等位基因頻率和基因型頻率分布差異采用 χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般臨床資料比較 對照組與研究組之間的年齡、孕次、未生育人數比例、入院體溫等差異無統計學意義(P>0.05)，未足月組孕婦無明顯絨毛膜羊膜炎的表現，對照組與研究組白細胞數P=0.023，P<0.05差異有統計學意義。見表1。

表1 兩組一般臨床資料比較

項目對照組(n=32)研究組(n=25)年齡/歲28.47±3.9626.88±2.83孕次1.72±1.171.56±1.04未生育人數/n(%)28(87.5)25(100)體溫/℃36.6±0.336.8±0.3白細胞數/(×109/L)9.33±2.2111.09±3.18

2.2 對照組孕婦Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分別為21.88%、34.37%及43.75%，與我國Hp基因型分布接近。研究組孕婦Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分別為16.00%、24.00%及60.00%。研究組孕婦Hp2-2型比例較對照組高，Hp1-1型較對照組低，但差異無統計學意義(χ2=1.121，P>0.05)。對照組孕婦Hp1和Hp2等位基因頻率分別為0.3906和0.6094；研究組孕婦Hp1和Hp2等位基因頻率分別為0.2800和0.7200，對照組與研究組差別無統計學意義(χ2=1.526，P>0.05)。見表2、3。

表2 兩組Hp基因型比較 n(%)

表3 兩組Hp等位基因頻率比較 n(頻率)

3 討論

胎膜早破是妊娠期常見并發癥，且發病率逐年升高，Liu J等2010年報道胎膜早破發生率近20%，且認為發展中國家發病率較發達國家高[3]。胎膜早破使新生兒發病率及病死率均增高，我們需要了解胎膜早破的具體發生機制及相關高危因素，從根源上減少胎膜早破的發生。研究已證實，胎膜早破和胎膜上膠原破壞及程序性細胞凋亡相關，胎膜早破的高危因素有孕婦生殖道感染、吸煙、子宮張力過大、胎膜及蛻膜上各種調節因子的作用[4-5]。近年來研究發現氧化應激系統破壞絨毛膜羊膜的結締組織導致胎膜早破的發生[6]。

Hp是一種具有抗氧化作用的α2唾液糖蛋白，是一種急性期蛋白，在機體抗感染、修復損傷組織以及維持內環境穩定的過程中具有重要作用。Hp有Hp1和Hp2兩種等位基因，主要構成三種基因型，Hp等位基因頻率分布及三種基因型的分布具有種族和地理差異性，調查顯示Hp1等位基因頻率在東南亞人種中較低，而在非洲及南美洲頻率較高[7]。趙會全等[8]在1988年對我國多個民族的Hp基因型及等位基因頻率進行統計，其中漢族人中，Hp2-2型最多，占55%左右；其次為Hp2-1型，約占35%；Hp1-1型最少，約10%左右。Hp不同基因型結構不同，其功能亦存在一定差異性。

Jin-Kyung等[1]對34名韓國足月胎膜早破患者進行研究，結果顯示Hp1-1基因型者，發生PROM的風險增高，其推測在未足月胎膜早破患者可能也存在這種關系，但未進行相關實驗。本研究對正常足月分娩及未足月胎膜早破進行了分析。結果顯示對照組Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分別為21.88%、34.37%及43.75%，與我國漢族人群Hp基因型分布接近。研究組Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分別為16.00%、24.00%及60.00%。研究組Hp2-2型比例較對照組高，Hp1-1型較對照組低，但差異無統計學意義。對照組Hp1、 Hp2等位基因頻率為39.06%、60.94%，研究組Hp1、 Hp2等位基因頻率為28%、72%，未足月組Hp2等位基因頻率雖高于對照組，但差別無統計學意義。說明Hp基因多態性不是中國漢族人群發生未足月胎膜早破的高危因素。本研究就結合珠蛋白基因多態性與胎膜早破的關系進行研究，但結果與Jin-Kyung等實驗結果并不一致。推測Hp基因多態性與未足月胎膜早破的發病機制可能存在種族差別，需進一步研究證實。

氧化應激在胎膜早破的發生中起到重要的作用，結合珠蛋白有明顯的抗氧化作用，Hp的抗炎作用是基因型依賴性的，Hp1-1及Hp2-2各自分別主導Th2細胞反應和Th1細胞反應[9]，Hp1-1型抗氧化活性高于Hp2-2型[7]。當循環中的紅細胞被破壞后釋放出游離血紅蛋白(Hb)，Hp可與游離Hb結合形成穩定的Hp-Hb復合物，Hp-Hb復合物具有氧化還原活性，可終止氧化損傷。循環中的Hp-Hb復合物與單核巨噬細胞表面特異性受體CD163結合后，被單核巨噬細胞吞噬清除[7]。研究顯示，Hp-Hb復合物與CD163受體結合可提高炎癥抑制因子白介素10的表達[10]。Hp-Hb復合物對CD163的親和力也是基因型依賴性的，而Hp2-2基因型對CD163有較高親和力[11]。推測Hp1等位基因可能為胎膜早破的保護性基因，Hp2-2基因型發生胎膜早破的風險大于其他基因型。本研究雖然結果顯示在未足月胎膜早破組中Hp2-2基因型所占比例大于正常對照組，但差異亦無統計學意義，可能和本研究中樣本較少有關。

本研究僅對中國安徽地區漢族孕婦做出相關分析，但其是否可能參與其他種族或其他地區未足月胎膜早破的發生仍需進一步研究，全面評價Hp基因多態性與未足月胎膜早破之間的關系尚需更多更全面的研究。

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Clinical study of haptoglobin polymorphism with preterm premature rupture of membranes

MA Shaoping，KONG Li′na

Department of Gynecology & Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To investigate the association of allelic polymorphism of haptoglobin(Hp)with preterm premature rupture of membrane(PPROM) for genetic evidence leading to PPROM.Methods:PCR techniques with sequence specific primers(SSP) was used to detect genotype Hp1-1,Hp2-1and Hp2-2 in human Hp gene and their distribution in normal pregnancy and PPROM.Results:The frequencies of Hp1 and HP2 alleles were 39.06% and 60.94% for the normal pregnancies,and 28% and 72% for the test group,respectively.There was no significant difference in the genotype distribution(P>0.05)and allelic frequencies (P>0.05) between groups.Conclusion：The findings showed no association of haptoglobin polymorphism with PPROM,suggesting that this gene distribution may not be the risk factor of pregnant women in Han population complicated with PPROM.

premature rupture of membrane;haptoglobin;gene;polymorphism

1002-0217(2016)06-0559-03

2016-03-22

馬少平(1978-)，女，主治醫師，(電話)15395362963，(電子信箱)35092714@qq.com.

R 714.433

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