3 151例珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結果分析*

張黎仙，林 堃

1.福建省莆田市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，福建莆田 351100；2.莆田學院附屬醫院產前診斷中心，福建莆田 351100

珠蛋白生成障礙性貧血又稱為地中海貧血，主要是遺傳性α珠蛋白基因缺陷或者β珠蛋白基因缺陷導致珠蛋白鏈缺如或合成不足所引起的溶血性貧血或病理狀態，所有類型的珠蛋白生成障礙性貧血都是常染色體隱性遺傳，并且可能發生不同的異常等位基因雜合的情況。重型α珠蛋白生成障礙性貧血可導致妊娠高血壓綜合征、死胎、產后大出血等，重型β珠蛋白生成障礙性貧血可導致死胎、新生兒死亡或出生后進行性貧血[1]。珠蛋白生成障礙性貧血在我國主要高發于南方地區，尤其是在廣東、廣西、海南、福建發病率較高[2-3]。因此，為了深入了解莆田市珠蛋白生成障礙性貧血基因變異情況，本研究對3 151例疑似珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結果進行分析，進一步探索莆田市珠蛋白生成障礙性貧血的診斷方案。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2021年10月在莆田學院附屬醫院進行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測的3 151例疑似珠蛋白生成障礙性貧血者作為研究對象，其中男647例、女2 504例，年齡1個月至74歲。納入標準：(1)夫婦雙方只要有一方平均紅細胞體積(MCV)<80 fL和(或)平均血紅蛋白含量(MCH)<27 pg，視為初篩陽性，雙方需進行血紅蛋白(Hb)電泳檢測；夫婦雙方MCV、MCH或Hb電泳結果陽性時，雙方行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(屬于珠蛋白生成障礙性貧血防控試點項目)。(2)篩查血紅蛋白電泳陽性，臨床上懷疑珠蛋白生成障礙性貧血的患者。(3)小細胞低色素性貧血，排除缺鐵性貧血，臨床上又高度懷疑珠蛋白生成障礙性貧血的患者。本研究經莆田學院附屬醫院倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬對本研究均知情同意。

1.2儀器與試劑 血常規檢測系統采用深圳邁瑞全自動血液分析儀BC5800及其配套試劑；血紅蛋白電泳采用法國Sebia全自動毛細管電泳儀CAPILLARYS2及其配套試劑；PCR基因擴增儀采用美國伯樂T100，試劑采用潮州凱普公司提供檢測的試劑盒對標本進行基因診斷。

1.3方法

1.3.1基因提取 抽取研究對象EDTA-K2抗凝外周血2 mL，采用廣東潮州凱普公司提供的基因提取試劑盒提取DNA。

1.3.2珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷 使用廣東潮州凱普公司提供的珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷試劑盒，采用跨越斷點PCR法(Gap-PCR)檢測3種缺失型α珠蛋白生成障礙性貧血基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3種突變型α珠蛋白生成障礙性貧血基因(CS、QS、WS)和17種β珠蛋白生成障礙性貧血基因(CD41-42/N、IVS-Ⅱ-654/N、-28/N、CD71-72/N、CD17/N、CD26/N或BE/N、CD43/N、-29/N、-30/N、CD31/N、-32/N、CD14-15/N、IVS-Ⅰ-1/N、IVS-Ⅰ-5/N、CAP+40-43/N、CD27/28/N、Int/N)。

1.3.3珠蛋白生成障礙性貧血基因測序 經上述α及β珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測未發現致病性突變的，而臨床上高度懷疑珠蛋白生成障礙性貧血的患者，進行相應α或β基因序列測定，檢測中國型Gγ+(Aγδβ)0和東南亞型HPFH基因缺失等，通過高通量測序檢測珠蛋白生成障礙性貧血基因序列，分析是否存在檢測范圍外的突變和缺失。

1.4統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行數據分析。計數資料以例數或百分率表示。

2 結 果

2.1基因檢測結果 3 151例疑似珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者，確診1 517例，檢出率為48.14%。其中 α珠蛋白生成障礙性貧血948例(62.49%)，β珠蛋白生成障礙性貧血553例(36.45%)，αβ復合珠蛋白生成障礙性貧血16例(1.05%)。

2.2α珠蛋白生成障礙性貧血基因型分析 對檢出的948例α珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因型進行具體分類，結果發現共檢出14種基因組合類型，其中占比較高的基因型為--SEA/αα(75.21%)、-α3.7/αα(13.92%)；檢出α珠蛋白生成障礙性貧血純合子3例，基因型分別為-α3.7/-α3.7、ααQS/ααQS、-α4.2/-α4.2；雙重α雜合子共檢出5種基因型，其中-α3.7/--SEA占有相對較高的比例(2.11%)。另外，通過基因測序在莆田市首次檢出2例--THAI/αα罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型。各種基因突變型及構成比見表1。

表1 α珠蛋白生成障礙性貧血基因型及構成比

2.3β珠蛋白生成障礙性貧血基因型分析 對檢出的553例β珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因型進行具體分類，結果發現共檢出14種基因組合類型，其中占比較高的基因型為βIVS-Ⅱ-654/βN(48.28%)、βCD41-42/βN(27.31%)。檢出多種少見組合類型，如βIVS-Ⅱ-654/βCD17、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/β-28。各基因型及構成比見表2。

表2 β珠蛋白生成障礙性貧血基因型及構成比

2.4αβ復合珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測結果 檢出αβ復合珠蛋白生成障礙性貧血16例，包括8種類型，其中占比較高的基因型為-α3.7/αα+βCD41-42/βN及--SEA/αα+βIVS-Ⅱ-654/βN。各基因型及構成比見表3。

表3 αβ復合珠蛋白生成障礙性貧血基因型及構成比

3 討 論

成人主要血紅蛋白含兩條α珠蛋白鏈和兩條β珠蛋白鏈，具有攜氧功能，健康人自父母雙方各繼承2個α珠蛋白基因和1個β珠蛋白基因，合成正常量的α和β珠蛋白鏈，若自父母繼承了異常的珠蛋白基因，則造成α鏈或β鏈合成障礙從而導致珠蛋白生成障礙性貧血。根據缺乏的珠蛋白種類不同，分為α珠蛋白生成障礙性貧血和β珠蛋白生成障礙性貧血。α珠蛋白生成障礙性貧血可分為靜止型(1個α基因異常)、輕型(2個α基因異常)、中間型(3個α基因異常即HbH病)以及重型(4個α基因異常，即Hb Bart′s胎兒水腫綜合征)；β珠蛋白生成障礙性貧血也可分為輕型、中間型和重型。珠蛋白生成障礙性貧血是我國南方地區圍生兒死亡的主要原因之一，重型α珠蛋白生成障礙性貧血圍生兒多胎死腹中或產后幾小時死亡；重型β珠蛋白生成障礙性貧血患者常伴有嚴重的貧血癥狀，整個生命周期都需要依賴定期輸血和去鐵治療維持生命，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔和精神壓力[4]。福建省是我國珠蛋白生成障礙性貧血高發省份之一，目前關于福建省珠蛋白生成障礙性貧血的研究資料相對較少。2013年徐兩蒲等[5]報道，福建人群珠蛋白生成障礙性貧血攜帶率高達4.41%。隨著東南沿海地區與兩廣地區交流互通，人口流動增加，珠蛋白生成障礙性貧血基因變異類型趨向復雜化，為了完善、更新福建莆田地區珠蛋白生成障礙性貧血的流行病學資料，促進優生優育，本研究對在莆田學院附屬醫院進行珠蛋白生成障礙性貧血檢測的人群做一個基因變異類型頻率分析。

本研究共檢出15種α珠蛋白生成障礙性貧血突變基因型，占比最高的基因型為--SEA/αα，其次為-α3.7/αα。這與本課題組2016年的研究成果相符[6]，但是新發現基因類型多了7種，體現了本地區突變類型復雜多樣性的特點。莆田市α珠蛋白生成障礙性貧血與本省其他市相比主要基因型相似[7-9]，與廣東[10]、廣西[11]、云南[12]、湖北武漢[13]等地的主要基因型也一致，但是與揭秋玲等[14]報道的海南省α珠蛋白生成障礙性貧血主要以-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα為主不同，差異稍大。由此可見，大部分南方地區α珠蛋白生成障礙性貧血基因型都是以--SEA/αα缺失型為主。同時，本次研究還發現，ααCS/αα在莆田市有較高的檢出率，提示CS位點可能是莆田市α珠蛋白生成障礙性貧血的主要基因突變點。本研究共檢出β珠蛋白生成障礙性貧血突變基因型14種，主要基因突變類型最常見的是βIVS-Ⅱ-654/βN，其次為βCD41-42/βN，分別占 β珠蛋白生成障礙性貧血基因型的48.28%、27.31%，另外檢出多種少見組合類型，如βIVS-Ⅱ-654/βCD17、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/β-28，豐富了莆田市珠蛋白生成障礙性貧血基因突變譜。β珠蛋白生成障礙性貧血主要突變基因型與福建省其他市以往相關報道一致[15-16]，但與其他研究報道的廣東[10]、海南[14]的前3位基因型(βCD41-42/βN、βIVS-Ⅱ-654/βN、β-28/βN)，廣西[11]的前3位基因型(βCD41-42/βN、βCD17/βN、β-28/βN) ，云南[12]的前3位基因型(βCD26/βN、βCD17/βN、βCD41-42/βN)，四川[17]的前3位基因型(βCD17/βN、βCD41-42/βN、βIVS-Ⅱ-654/βCD17)相比差異甚大，進一步佐證了β珠蛋白生成障礙性貧血具有更明顯的區域差異性。αβ復合珠蛋白生成障礙性貧血共檢出16例，共有8種組合類型，以-α3.7/αα+βCD41-42/βN居多。α珠蛋白生成障礙性貧血基因型以--SEA/αα為主，β珠蛋白生成障礙性貧血基因型以βIVS-Ⅱ-654/βN為主，按照遺傳定律αβ復合珠蛋白生成障礙性貧血基因型應以--SEA/αα+βIVS-Ⅱ-654/βN為主，而在本次研究中僅排第2位，這可能與本次分析統計的αβ復合珠蛋白生成障礙性貧血數量不多有關。

現今主流的珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷試劑盒采用已知探針捕獲，導流雜交的原理，僅檢測23種常見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型，即3種常見α珠蛋白生成障礙性貧血缺失型基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3種α突變型基因(αWS、αQS、αCS)以及17種β珠蛋白生成障礙性貧血基因點突變。然而，珠蛋白生成障礙性貧血具有廣泛的遺傳異質性，其基因突變類型繁多，在臨床工作中經常遇到一些高度可疑的珠蛋白生成障礙性貧血患者使用常規方法卻得到未檢出突變的正常結果。呂榮鈺等[18]研究也發現，就算常規基因檢測陰性的人群中仍有1.8%的常規基因和 5.6%的罕見基因突變漏檢。莆田市珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷范圍囿于常規檢測的23種，莆田市高發的罕見珠蛋白生成障礙性貧血類型是否存在未知新發突變目前尚不可知。隨著高通量技術(NGS)的發展以及生物信息學與大數據科學的交叉應用，在NGS平臺進行珠蛋白生成障礙性貧血基因序列分析成為可能。近年來研究也證實了NGS不僅可用于珠蛋白生成障礙性貧血基因篩查，還能發現較為罕見的新基因型[19]。徐湘民教授團隊在《EBio Medicine》上報道我國南方5省2萬人群的珠蛋白生成障礙性貧血基因聯合篩查結果，結果表明基于NGS的珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測能發現更多的致病或疑似致病變異，其中12.1%的變異為傳統珠蛋白生成障礙性貧血檢測方式無法檢測到[20]。本研究針對可疑假陰性標本進行DNA序列分析，通過測序檢出2例以--THAI/αα罕見基因型，不在常規試劑盒檢測范圍內，為莆田市首次報道。福建省泉州和三明地區也曾檢出過該罕見基因型[21-22]，說明該罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型在福建省內相對多發。因此，當臨床遇到可疑珠蛋白生成障礙性貧血但是常規檢測陰性，應進行罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測，通過DNA序列分析判斷是否為罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變型，或存在新發突變，探索莆田市罕見珠蛋白生成障礙性貧血類型、分布情況及遺傳特點，然后針對高發的罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因設計特異探針，擴大莆田市常規珠蛋白生成障礙性貧血基因的檢測范圍，提升罕見珠蛋白生成障礙性貧血識別能力，為罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變攜帶者提供更完善的診斷方案。

本研究全面探索莆田市珠蛋白生成障礙性貧血突變類型及分布特征，完善珠蛋白生成障礙性貧血基因突變圖譜(含常見珠蛋白生成障礙性貧血基因缺陷、罕見珠蛋白生成障礙性貧血和新發突變)，為珠蛋白生成障礙性貧血診斷提供最新的實驗依據，今后將制訂個性化的珠蛋白生成障礙性貧血篩查診斷方案，降低莆田市珠蛋白生成障礙性貧血的漏篩風險。