喀斯特山區大眼鱖線粒體COⅠ基因序列分析

郭健康，安 苗，周其椿，曹恒源，李 珊，陳薛偉杰

( 1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州水產科學研究所，貴州 貴陽 550025 )

喀斯特山區大眼鱖線粒體COⅠ基因序列分析

郭健康1，安 苗1，周其椿2，曹恒源1，李 珊1，陳薛偉杰1

( 1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州水產科學研究所，貴州 貴陽 550025 )

為了解喀斯特山區大眼鱖3個地理群體內和群體間的遺傳變異特點，采用PCR技術對169尾個體的線粒體DNA COⅠ基因進行擴增、測序，獲得的序列長度為1512 bp。分析顯示,堿基A、T、C、G的平均含量分別為24.9%、28.6%、28.7%、17.8%，其中A+T(53.5%)含量高于G+C(46.5%)含量。169個樣本共檢測到5個多態位點，并定義了5種單倍型。對喀斯特山區大眼鱖群體COⅠ基因與洞庭湖大眼鱖COⅠ基因序列進行序列差異分析，結果顯示，兩者之間存在10個變異位點，集中在1268～1456 nt?？λ固厣絽^3個群體間4種堿基在密碼子3個位點上的使用頻率無差別，與洞庭湖大眼鱖相比，密碼子第1位上的4種堿基含量差別不大，密碼子第2位上T含量(40.9%)高于后者(39.9%)，而A和C含量則低于后者；與洞庭湖翹嘴鱖比較差別很小，但與斑鱖、暗鱖、長身鱖和波紋鱖4種鱖魚比較，在密碼子第1位和第3位存在不同差異，特別是暗鱖和波紋鱖密碼子第3位中A含量(30.0%)明顯低于喀斯特山區大眼鱖(31.8%)，而波紋鱖G(8.9%)明顯高于后者(7.3%)?？λ固厣絽^大眼鱖平均單倍型多樣性為0.395，平均核苷酸多樣性為0.00029，遺傳多樣性貧乏。

喀斯特山區；大眼鱖；COⅠ基因；密碼子；遺傳多樣性

大眼鱖(Sinipercakneri)屬硬骨魚綱、鱸形目、科、鱖亞科、鱖屬，俗稱桂花魚、白桂等，分布于中國長江及其以南水系，為中國南方特有種[1-2]，是一種名貴的經濟魚類。貴州位于滇東高原到湘西丘陵之間的過渡地帶，地處長江和珠江上游，屬典型的喀斯特山地，自西向東的苗嶺山脈將其境內的水系分隔成珠江和長江兩大流域，區內河流眾多，生境多樣，鱖亞科魚的種類及分布也豐富，近年來由于截流筑壩、過度捕撈、環境污染，資源銳減，有的種類已很難采到。目前，本區大眼鱖的基礎生物學及群體遺傳學研究仍十分滯后，僅禹真等[3-4]對錦江河特有魚類國家級水產種質資源保護區內大眼鱖的形態特征、肌肉營養、漁獲物組成和資源狀況有過報道。

細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COⅠ)是線粒體中13個蛋白編碼基因之一，COⅠ不僅擁有足夠變異而易于被通用引物擴增, 而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失。目前mtDNA COⅠ基因既作為DNA條碼識別生物物種的有效性[5]，也廣泛用于水生生物群體遺傳多樣性及其遺傳結構的研究[6-11]。本文運用PCR擴增技術對分屬長江流域和珠江流域的大眼鱖3個地理群體的169尾樣本mtDNA COⅠ基因進行測序分析，探討喀斯特山區大眼鱖COⅠ基因序列特點和群體遺傳多樣性，為國家級水產種質資源保護區經濟魚類的種質資源評價奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生大眼鱖采自3個水產種質資源保護區，共計169尾。其中烏江黃顙魚國家級水產種質資源保護區沿河縣城河段45尾，錦江河特有魚類國家級水產種質資源保護區銅仁段30尾，北盤江九盤段特有魚類省級水產種質資源保護區關嶺段96尾。對活魚樣本進行常規生物學測定并解剖，取背部肌肉3～5 g浸泡于無水乙醇中，-20 ℃保存備用。利用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取基因組DNA，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗其完整性，用紫外分光光度計(Thermo NanoDrop 2000C)測定其吸光值。

1.2 引物設計與PCR 擴增

參照翹嘴鱖(S.chuatsi)(登錄號為：JF972568.1)、斑鱖(S.scherzeri)(登錄號為：AP014527.1)和中國少鱗鱖(Coreopercawhiteheadi)(登錄號為：NC023957.1)等鱖亞科魚類COⅠ基因序列設計引物，COF:5′-GGGGTTAGCCTACTTCTTT-3′；COR:5′-TGGTACTGACCTTTCTCGT-3′，引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

PCR反應體系為20 μL：模板DNA 2 μL；2×Taq PCR Master Mix(北京天根)10 μL；上下游引物分別1 μL；剩余體積用雙蒸水補齊。PCR擴增反應在AB公司梯度PCR儀(型號：Veriti)上完成；擴增條件：94 ℃預變性3 min； 94 ℃變性40 s，55.1 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min， 35個循壞；最后再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 PCR產物的測定

根據目的片段擴增結果，切膠回收純化，將所有PCR產物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司雙向測序。

1.4 數據的處理

利用DNAstar 5.0軟件包中的Seqman做正反向鏈的拼接，手動校正并去掉兩端引物及部分序列；運用Mega 5.0統計堿基組成、變異位點、氨基酸含量，計算遺傳距離、建立系統進化樹；采用DNASP 5.0軟件統計單倍型多樣度，計算單倍型多樣度、核苷酸多樣度、群體間遺傳分化指數(Fst)，基因流(Nm)由Nm≈(1-Fst)/(4Fst)計算。

2 結果與分析

2.1 喀斯特山區大眼鱖mtDNA COⅠ基因擴增及序列差異

用CO5F/CO5R 引物對169尾大眼鱖DNA樣品進行PCR 擴增, 所有樣品均擴增出約1700 bp條帶(圖1)。

圖1 喀斯特山區3個大眼鱖群體COⅠ基因PCR擴增結果

注：M.2000 bp分子標記；1、2.沿河群體；3、4.銅仁群體；5～7.關嶺群體；8.空白對照.

經拼接、校對和比對后，獲得169條自5′端開始的1512 bp序列，分屬5種單倍型，并提交GenBank，其登錄號為KU049654～KU049658，同時自GenBank中下載鱖屬6種鱖魚的10條同源序列作對比分析(表1)。

表1 本研究所用樣本信息

注：Hap1～Hap5，喀斯特山區大眼鱖群體單倍型；DTD，洞庭湖大眼鱖單倍型；QZG，翹嘴鱖單倍型；BG1～BG5，斑鱖單倍型；CTG，長體鱖單倍型；ANG，暗鱖單倍型；BWG，波紋鱖單倍型. 下同.

Mega 5.0軟件分析顯示：喀斯特山區3個大眼鱖群體中，沿河群體存在4個變異位點(3個轉換位點和1個顛換位點)，而其他2個種群未檢測到變異位點。169個樣本共檢測到5個變異位點(圖2)，未檢測到插入或缺失位點。這些變異除在513 nt處發生了1個堿基替換外，其余變異位點均發生在880 nt以后(變異比率為0.3%)。與洞庭湖大眼鱖比較有10個變異位點，主要集中在1268～1456 nt，變異比率為0.6%。與洞庭湖翹嘴鱖相比差異小，僅有2個變異位點。與斑鱖、暗鱖、長體鱖和波紋鱖4個種間相比變異則較大，共有153個變異位點，含101個信息位點和52個單一變異位點，主要發生在213～1509 nt，變異比率為9.7%?？梢?，喀斯特山區大眼鱖的COⅠ基因在種內和與翹嘴鱖間，在近5′端654 bp左右變異較小，而與同屬中其他魚類間的變異較大。

圖2 鱖屬魚類線粒體COⅠ基因序列變異位點

堿基組成上，喀斯特山區3個大眼鱖群體間的A、T、C和G堿基平均含量相差不大，堿基C的含量最高，G含量最低，A+T含量都高于C+G含量且G的含量顯著低于其他堿基的含量，表現出明顯的反G 偏向(表2)；與洞庭湖大眼鱖及其他4種鱖魚差別較小?？梢钥闯?，喀斯特山區大眼鱖的COⅠ基因與鱖屬魚類在堿基組成上相似。

密碼子的使用上，喀斯特山區3個大眼鱖群體間在第1位、第2位和第3位點上無差別。相比較于洞庭湖群體，其密碼子第1位的T(20.6%)和G(30.7%)含量略高于后者(T為20.2%，G為30.0%)，而A(25.5%)和C(32.2%)的含量則略低于后者(A為26.2%，C為32.6%)；在密碼子第2位上，喀斯特山區群體的T(40.9%)含量高于洞庭湖群體的T(39.9%)含量，而A(17.5%)和C(26.4%)含量低于后者(A為18.1%，C為26.8%)。與翹嘴鱖比較差別較小，但與斑鱖、暗鱖、長體鱖和波紋鱖4種鱖魚比較，除密碼子第2位上各堿基的使用率無差異外，密碼子第1位和第3位上存在不同差異，特別是暗鱖和波紋鱖密碼子第3位上A(30.0%)含量明顯低于喀斯特山區大眼鱖A(31.8%)，而波紋鱖G(8.9%)含量明顯高于喀斯特山區大眼鱖G(7.3%)的含量?？梢娫诿艽a子的使用率上，喀斯特山區大眼鱖群體的COⅠ基因在種群內差別較??；而不同種群間，在密碼子第1位點和第2位點上差別較大。

1512 bp的核苷酸序列共編碼504個氨基酸，喀斯特山區大眼鱖群體的5個變異位點均為同義突變且都發生在密碼子第3位上，3個群體的氨基酸含量一致，其中亮氨酸含量最高(12.30%)，半胱氨酸最低(0.20%)。相比于洞庭湖群體，密碼子第1位(轉換/顛換比為4)和密碼子第2位(轉換/顛換比為2/3)存在堿基變異，使10個氨基酸發生了變異，其亮氨酸和半胱氨酸含量略低(亮氨酸11.71%，半胱氨酸0.20%)。與翹嘴鱖、斑鱖、暗鱖、長體鱖、波紋鱖相比較，檢測到3處氨基酸被替代。結果表明，喀斯特山區大眼鱖群體的COⅠ基因的堿基變異特點，與同屬中其他鱖類的堿基變異主要表現為同義突變特點類似。

注：WYH：沿河群體；JTD：銅仁群體；BGD：關嶺群體；GZD：喀斯特山區3個大眼鱖群體；DTD：洞庭湖大眼鱖；QZG：洞庭湖翹嘴鱖；BG：斑鱖；ANG：暗鱖；CTG：長體鱖；BWG：波紋鱖.

2.2 喀斯特山區大眼鱖群體的遺傳距離及系統關系

喀斯特山區3個大眼鱖群體間，沿河與關嶺群體間遺傳距離為0.000，它們與銅仁群體間的遺傳距離均為0.001；喀斯特山區3個大眼鱖群體內，沿河群體內遺傳距離為0.000～0.002，關嶺群體內和銅仁群體內遺傳距離均為0.000?？λ固厣絽^大眼鱖5個單倍型間的遺傳距離為0.001～0.002；與洞庭湖大眼鱖群體之間的遺傳為0.007～0.008；與翹嘴鱖的遺傳距離為0.002～0.003；與斑鱖之間的遺傳距離為0.056～0.067；與長體鱖、暗鱖和波紋鱖之間的遺傳距離為0.053～0.067；與中國少鱗鱖遺傳距較遠，為0.089～0.091；與日本少鱗鱖(C.kawamebari)和朝鮮少鱗鱖(C.herzi)之間的遺傳距離最遠，為0.184～0.190。由此表明，喀斯特山區大眼鱖的COⅠ基因在種群內遺傳距離小于1%，而與其他種群間較遠且在10倍以上。

表3 鱖亞科魚類單倍型之間的遺傳距離

注：Hap1～Hap5：喀斯特山區大眼鱖群體單倍型；DTD：洞庭湖大眼鱖單倍型；QZG：翹嘴鱖單倍型；BG1～GB5：斑鱖單倍型；CTG：長體鱖單倍型；BWG：波紋鱖單倍型；ANG：暗鱖單倍型；ZGS：中國少鱗鱖單倍型；RBS：日本少鱗鱖單倍型；CXS：朝鮮少鱗鱖單倍型.

將自GenBank中下載9種鱖魚COⅠ同源序列(序列號見圖3)，與本文5種大眼鱖單倍型一起，以花鱸(Lateolabraxjaponicus)(GenBank:AP006789)為外群，構建鄰接法分子系統發育樹(圖3)和最大似然法分子系統發育樹(圖4)，鄰接法樹和最大似然法樹拓撲結構圖基本一致。由系統進化樹可以看出，鱖亞科魚類分為兩大分支，中國少鱗鱖、日本少鱗鱖和朝鮮少鱗鱖聚為一支，長體鱖和另5種鱖魚單倍型與本文大眼鱖5種單倍型簇聚成一支。

圖3 基于COⅠ基因片段鱖亞科魚類的鄰接法系統發生樹樹枝處的數字為Bootstrap值，重復次數為1000次；Hap1～Hap5，喀斯特山區大眼鱖群體單倍型.下同.

2.3 喀斯特山區大眼鱖群體的遺傳多樣性和遺傳分化

通過DNA SP 計算得到喀斯特山區3個群體的遺傳多樣性參數(表4)，結果顯示，沿河群體的多樣性參數多態位點數、單倍型數、單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數和平均核苷酸差異數均遠遠高于其他2個群體，其遺傳變異最大，遺傳多樣性最豐富。

表4 喀斯特山區3個大眼鱖群體的遺傳多樣性參數

喀斯特山區大眼鱖3個群體的遺傳分化指數和基因流見表5。由表5可知，銅仁群體與關嶺群體之間的遺傳分化指數最大為1，沿河群體與關嶺群體之間的遺傳分化指數最小，為0.13398；銅仁群體與沿河群體、關嶺群體之間的基因流小于1，沿河群體與關嶺群體之間的基因流大于1。

圖4 基于COⅠ基因片段鱖亞科魚類的最大似然法系統發生樹

種群1種群2群體間遺傳距離遺傳分化指數基因分化系數基因流銅仁群體沿河群體0.0010.793370.608300.10588銅仁群體關嶺群體0.0011.000001.000000.00000沿河群體關嶺群體0.0000.133980.109893.94393

3 討 論

3.1 喀斯特山區大眼鱖COⅠ基因片段變異及特征分析

COⅠ基因在同一種群內COⅠ基因5′端654 bp左右的片段相對保守，在3′端變異較大[12-13]。本研究初步分析并比較了喀斯特山區3個大眼鱖群體的COⅠ基因片段的差異，結果顯示，169尾大眼鱖COⅠ基因片段中，除在513 nt處發生了堿基替換外，其他的變異位點均發生在880 nt以后。Hap5為30尾銅仁群體獨有單倍型，其在933 nt處存在C→T替換，通過檢索GenBank發現，該位點的堿基種類與同屬中斑鱖和暗鱖一致，而這三種鱖類形態差異很大，因此該位點可以作為銅仁大眼鱖的分子標記。

本研究中，大眼鱖COⅠ基因的堿基C含量最高，通過檢索GenBank中鱖亞科魚類的同源序列發現，與其同屬的翹嘴鱖、斑鱖、波紋鱖和暗鱖堿基含量特點一致，而少鱗鱖屬的中國少鱗鱖、朝鮮少鱗鱖、日本少鱗鱖T的含量最高。從原核生物到真核生物，其基因組中廣泛存在堿基使用偏向性的現象。研究發現喀斯特山區大眼鱖G的含量最低(17.8%)，AT 含量明顯高于GC 含量，與洞庭湖大眼鱖堿基組成一致，也與其他魚類COⅠ基因同源序列的堿基特點一致[14-16]，可見COⅠ基因對堿基的使用有明顯的偏向。Fedorov等認為[17]，這一現象的產生可能與基因的表達水平、翻譯起始效應、堿基組分、基因長度以及密碼子反密碼子間結合能力的大小有關。蛋白編碼基因在第3位密碼子堿基上受到的功能限制較小，所以密碼子第3位堿基能夠更清晰地表明COⅠ基因核苷酸組成的不均一性。本研究中，喀斯特山區大眼鱖3個群體在密碼子第3位各堿基的含量無差別，與翹嘴鱖比較，3個密碼子位點上對各堿基的使用率差別很小，但與斑鱖、暗鱖和長身鱖比較，除密碼子第2位上各堿基的使用率無差異外，密碼子第1位和第3位上存在不同差異?？梢?，親緣關系越近，各密碼子上的堿基組成越相似。

COⅠ 基因是蛋白質編碼基因之一，對于蛋白質編碼區域而言，因蛋白質功能上的需要和三聯體密碼子結構的限制，缺失/插入很少發生或發生后很容易被選擇淘汰[18]。本研究沒有發現堿基的插入/缺失，變異為堿基替換，喀斯特山區大眼鱖群體轉換/顛換比為4，堿基變化均發生在第3位密碼子上的同義突變，與COⅠ基因遺傳密碼的特性保持一致。洞庭湖大眼鱖COⅠ基因與喀斯特山區大眼鱖群體差異較大，洞庭湖大眼鱖的堿基變異來源于第1位(轉換/顛換比為4)和第2位密碼子(轉換/顛換比為2/3)，使10個氨基酸發生了變化，這種差異可能與生存環境有關。

3.2 喀斯特山區大眼鱖遺傳距離及鱖亞科魚類的系統關系

Hebert等[13]經過對13 320個動物物種的分析認為，物種內COⅠ序列的遺傳距離一般小于0.01，最大不超過0.02，而遺傳距離大于0.01，就認為群體的變異大[19]?？λ固厣絽^3個大眼鱖群體COⅠ基因在群體內的遺傳距離為0.000～0.002，群體間的遺傳距離為0.000～0.001，小于0.01；5個單倍型與洞庭湖大眼間的遺傳距離為0.007～0.008，也小于0.01。說明這些大眼鱖群體的遺傳變異小。

鱖亞科魚類的系統關系一直存在爭議，本研究所建的系統進化樹與劉煥章等[20]研究的鱖亞科分成鱖屬和少鱗鱖屬的聚類一致，長體鱖沒有單獨生成一枝，而是與鱖屬魚類聚在一起；本文的5種單倍型與大眼鱖和翹嘴鱖以99%的置信度聚在一起，表明大眼鱖與翹嘴鱖親緣關系密切，而且遺傳距離(0.001～0.008)并未到達種的分化標準，這與趙金良等[21-23]認為翹嘴鱖和大眼鱖是近緣姐妹種的結果一致。

3.3 喀斯特山區大眼鱖群體的遺傳多樣性及遺傳分化

單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數是評價物種遺傳多樣性的2個重要指標，值越大遺傳多樣性越豐富?？λ固厣絽^3個大眼鱖群體中，沿河群體遺傳多樣性較其他2個群體高，其原因可能是由于烏江流域面積廣闊且又與長江連通，大眼鱖能進行廣泛的基因交流，雖然沿河段下游彭水電站現今阻礙了沿河群體與下游的其他大眼鱖群體的基因交流，但彭水電站投入使用時間不足10年，所以該大眼鱖群體保存了較高的遺傳多樣性水平；銅仁群體單倍型單一，其可能是通過少數個體近親繁殖而來；北盤江關嶺段位于光照大壩上游，大眼鱖資源豐富但遺傳多樣性水平低，這可能是由于大壩的建成，為其創造一個適宜的生活環境使其大量繁殖。3個群體總體上單倍型多樣性指數(0.395)低于其他魚類[如太湖新銀魚(Neosalanxtaihuensis)為0.576、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)為0.690、棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)群體為0.785][15,24-25]，表現為低單倍型多樣性(0.395)，低核苷酸多樣(0.00029)，這種狀況表明其可能最近出現過種群瓶頸效應或奠基者效應[26]。

基因流和遺傳分化系數通常用來判斷群體間遺傳分化程度。若基因流大于1，表明種群間存在一定的基因交流；若基因流大于4，表明種群之間是一隨機交配的群體；若基因流小于1，預示著有隔離的產生[27]。本研究中，沿河群體和關嶺群體之間的基因流大于1，表明兩者之間存在一定的基因交流，而北盤江與烏江是相互隔離的水體，理論上不應該有基因交流，造成這種基因交流原因，可能是2個群體曾經可能生活在一個水體中，后來由于地質變遷等因素使其彼此隔離。銅仁群體與其他兩個群體的基因流均小于1，說明銅仁群體與其他兩個群體有隔離，缺乏基因交流，造成這種隔離的原因，可能與生存環境有關。按照群體遺傳學的標準[28]，沿河群體和關嶺群體間低度分化(0.15>遺傳分化系數>0.05) ，而銅仁群體與其他兩個群體間的遺傳分化程度高 (遺傳分化系數>0.25) 。

3.4 喀斯特山區大眼鱖資源的保護

遺傳多樣性豐富度直接反映出了物種的進化潛力，遺傳多樣性越豐富，物種對環境的適應能力也就越大，生存和進化的潛力也就越大[29]。本研究中，沿河群體的遺傳多樣性明顯高于銅仁群體和關嶺群體，因此應優先對沿河群體進行保護，防止稀有等位基因丟失。對于遺傳多樣性貧乏的銅仁群體和關嶺群體，應盡快采取有效措施(如人工引種、放流等)來擴大其遺傳變異和數量。

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SequenceAnalysisofCytochromeCOxidaseSubunitⅠ (COⅠ)ofMitochondrialDNAGeneofBigeyeMandarinfishSinipercakneriinKarstMountain

GUO Jiankang1, AN Miao1, ZHOU Qichun2, CAO Hengyuan1, LI Shan1, CHEN Xueweijie1

( 1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2.Gui Zhou Fisheries Research Institute, Guiyang 550025, China )

The partial mitochondrial COⅠ sequences of 169 individuals of bigeye mandarinfishSinipercaknerifrom three populations in Karst Mountain were amplified by PCR technique to analyze their sequence variation and the 1512 bp nucleotide sequences were obtained．The amplification showed that the average contents of A, T, G and C were 24.9%,28.6%,28.7% and 17.8%, respectively, the average content of AT(53.5%) being higher than that of GC(46.5%). Five variable sites were detected and five different haplotypes were defined in 169 samples of the populations, and the 10 variable loci were detected between the populations ofS.kneriin Karst Mountain andS.kneriin Dongting lake, most of which were occurred from 1268 nt to 1456 nt. There were no difference about codon usage among the three populations in Karst Mountain. Comparing toS.kneriin Dongting lake, there were no significant differences in the first positions of codon usage, higher content of T(40.9%) than the latter (39.9%) in the second codon positions, whereas the content of A and C was lower than the latter in the third codon positions. The codon usage was small discriminatory between bigeye mandarinfish in Karst Mountain and mandarinfishS.chuatsiin Dongting lake. Comparison ofS.scherzeri,S.obscura,S.rouleiandS.undulatarevealed different discriminatory at the first codon positions and third codon positions, especially significantly lower content of A(30.0%) inS.obscuraandS.undulataat the codon first positions than that(31.8%) inS.akneriin Karst mountain, whereas G content (8.9%) ofS.undulatawas significantly higher than the latter (7.3%). The total haplotype diversity (Hd) was 0.395 and nucleotide diversity(Pi) was 0.00029, therefore, indicating a low genetic diversity level in the populations ofS.kneriin Karst Mountain.

Karst Mountain;Sinipercakneri; COⅠ gene; codon; genetic diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.008

Q959.4

A

1003-1111(2016)06-0649-09

2015-11-25；

2016-03-14.

郭健康(1987—)，男，碩士研究生；研究方向：水產動物增養殖學.E-mail:gzguojk@126.com.通訊作者：安苗(1970—)，男，副教授，碩士；研究方向：水生動物增養殖與魚類種質資源.E-mail：gzuam@163.com.