丁香酚的分離及其殺多子小瓜蟲活性研究

姚嘉赟，徐 洋，袁雪梅，藺凌云，尹文林,潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉

( 浙江省淡水水產研究所，農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養重點實驗室，浙江 湖州，313001 )

丁香酚的分離及其殺多子小瓜蟲活性研究

姚嘉赟，徐 洋，袁雪梅，藺凌云，尹文林,潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉

( 浙江省淡水水產研究所，農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養重點實驗室，浙江 湖州，313001 )

利用不同極性大小的溶劑石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇回流提取丁香制備粗提物，進行殺滅多子小瓜蟲幼蟲和包囊的藥效活性追蹤，確定丁香殺蟲的活性部位為石油醚提取部分，進而利用硅膠柱層析和中壓制備液相等分離技術結合活性追逐試驗追蹤分離丁香石油醚提取物(對多子小瓜蟲幼蟲和包囊的100%致死質量濃度分別為50 mg/L和80 mg/L)，最終分離獲得一種殺蟲活性物質，經質譜、核磁氫譜、核磁碳譜等多種波譜分析技術確定該活性物質為丁香酚。體外殺蟲結果表明，丁香酚對多子小瓜蟲具有較強的殺滅作用，其對幼蟲15 min、1 h、2 h、3 h和4 h的半數致死質量濃度分別為6.21 (5.85～6.65) mg/L、3.50 (3.24～3.84) mg/L、2.90 (2.62～3.22) mg/L、2.33 (2.10～2.50) mg/L 和2.15 (1.98～2.32) mg/L，對幼蟲4 h的100%殺滅的質量濃度為3.5 mg/L，對包囊6 h的100%殺滅質量濃度為3.5 mg/L。結果表明，丁香酚是一種具有較好開發前景的殺多子小瓜蟲藥物。

丁香酚；多子小瓜蟲；活性追蹤；殺蟲活性

多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifilis)，屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、多子小瓜蟲屬，是一種世界性分布的淡水魚類專性寄生蟲，其幾乎能感染所有的淡水魚類，患多子小瓜蟲病的魚死亡率很高，一旦患有多子小瓜蟲病就難以治愈，因此多子小瓜蟲病被稱為魚類的“癌癥”，給我國乃至世界的淡水魚類養殖業造成巨大的經濟損失[1]。

對于多子小瓜蟲病的防治，國內外已做了大量的研究工作，倪達書[2]在20世紀60年代就篩選出用醋酸亞汞治療多子小瓜蟲病，并對醋酸亞汞的治療機理和治療用量都做了闡述。但由于醋酸亞汞的毒性強，早已被禁止在食用魚上使用。同樣，對多子小瓜蟲病療效較好的孔雀石綠，也因為對人體有致癌性和毒性，已被禁止在食用魚上使用[3]。近年來國內對多子小瓜蟲病治療的研究也比較多，如用辣椒和生姜、五倍子、食鹽、生石灰等治療多子小瓜蟲，但這些藥物大多數對掠食體階段有一定效果，而對滋養體階段效果不明顯。國外用于防治多子小瓜蟲病的藥物和方法也較多，甲醛[4]、葉綠酸[5]、溴硝醇[6]、高錳酸鉀[7]和高鐵酸鉀[8]等，但這些藥物和方法都受到一定的限制，對多子小瓜蟲的滋養體和包囊階段效果不明顯。同時，長期使用帶來的環境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為目前食品安全和水產品出口的綠色貿易壁壘問題，因此，尋找對多子小瓜蟲病的治療行之有效、環境友好型藥物是一項迫在眉睫的任務。

天然植物資源作為自然資源的一大寶庫，蘊藏著巨大的潛力，具有結構新穎、功能多樣性的活性物質，因此在有效創制醫藥、獸藥和農藥等新藥及探索具有生物活性的先導化合物等方面越來越受到重視和青睞。同時，具有低毒、低殘留、對非靶標生物毒害較低，對環境無污染等優點，可降低或避免目前化學藥物帶來的“藥物公害”。筆者也一直致力于從天然植物中尋找新型的殺蟲藥物，利用提取分離技術從天然植物博落回和小果博落回中分離到3 種化合物血根堿[9]、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿[10]，對多子小瓜蟲具有較強的殺滅作用。前期篩選中，發現丁香的提取物具有殺多子小瓜蟲的作用，因此本研究利用提取分離技術并結合殺蟲活性追蹤法分離丁香中的殺蟲活性成分，并對其結構進行鑒定，為開發新的殺蟲藥物奠定基礎，并為尋求新的殺蟲母體藥源，研究殺蟲活性成分并進行仿生合成提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

丁香(Eugeniacaryophyllata)購自安徽中藥材市場。

1.1.2 試驗用魚

金魚(Carassiusauratus)，體長(7.4±1.8) cm，嚴重感染多子小瓜蟲，購自湖州市花鳥魚蟲市場，草魚(Ctenopharynodonidellus)體質量(13.8±2.7) cm，來自浙北水產新品種繁育技術開發有限公司。

1.2 儀器與試劑

R-210/215型旋轉蒸發儀(瑞士Buchi)，Olympus-BX51顯微鏡(日本)，石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等化學試劑均為分析純，上?；瘜W試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 多子小瓜蟲的活體傳代

將感染有多子小瓜蟲的金魚與草魚混養于80 cm×60 cm×60 cm的階梯式PP循環養殖水槽，水溫控制為(22±1) ℃，溶解氧>5 mg/L，水體經砂層過濾。每3日換水50%，感染約7 d，魚體表面即可出現密集的小白點，可用于多子小瓜蟲的收集以及幼蟲的培養，同時要注意及時加入未感染的草魚，未使用的病魚應及時撈出以免免疫力提高而影響蟲體傳代。

1.2.2 蟲體的收集與培養

將嚴重感染多子小瓜蟲的草魚放置于玻璃缸中，并于玻璃缸底部放置5～10個塑料培養皿，待成熟蟲體黏附于培養皿底部后，收集蟲體。一部分蟲體用于多子小瓜蟲幼蟲(掠食體)的培養，一部分用于包囊的收集。

1.2.3 體外殺多子小瓜蟲幼蟲(掠食體)試驗

藥液的配制：各提取物及活性單體經旋轉干燥后，精確稱取10 mg，溶解于二甲基亞砜并放置于冰箱保存備用。待進行藥效試驗時取出，并利用曝氣的自然水稀釋至所需質量濃度后進行體外殺蟲試驗。

試驗在24孔細胞培養板上進行，于每個細胞孔中加入約2 mL不同質量濃度的藥液和約100個多子小瓜蟲幼蟲，于用藥后15 min、1 h、2 h、3 h、4 h鏡檢觀察一次，4 h后統計各孔的多子小瓜蟲死亡率。試驗設置二甲基亞砜對照組和充分曝氣自然水對照組，每組試驗重復3次。

多子小瓜蟲幼蟲死亡判斷標準：蟲體纖毛不運動，胞質不流動，胞膜破裂，細胞核破碎。

1.2.4 體外殺多子小瓜蟲包囊的試驗

試驗在24孔細胞培養板上進行，于每個細胞孔中均加入不同質量濃度的藥液和30個多子小瓜蟲包囊，于用藥后6 h，吸出藥液，加入充分曝氣的自然水。于22 ℃下培養24 h后先鏡檢觀察各孔的包囊存活及蟲體孵化情況，之后將有幼蟲孵化的細胞孔利用移液槍混勻，并吸取10 μL液體用1%甲醛固定后計數，進而計算各孔的包囊孵化蟲數。每孔取5次樣品，去平均值，試驗設置3個重復。

包囊孵化蟲數=每孔孵化蟲體數/包囊個數

多子小瓜蟲包囊死亡判斷標準：包囊破裂、未分裂或包囊未孵出幼蟲。

1.2.5 丁香殺蟲活性部位的確定

稱取丁香粉末50 g，利用不同極性溶劑(石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇)分別進行提取，溶劑的使用量500 mL，每次提取2 h，并合并提取液，經減壓濃縮后用于體外殺蟲試驗，并根據藥效結果確定丁香的殺蟲活性部位。

1.2.6 殺蟲活性追逐試驗

稱取5 kg丁香粉，用石油醚回流連續提取3次，合并提取液，經旋轉蒸發后濕法上硅膠柱層析，依次用石油醚、石油醚∶乙酸乙酯、乙酸乙酯進行梯度洗脫，每200 mL洗脫液作為一個餾分，共收集476個餾分，經TLC合并為5個組分(FrA:1～78; FrB: 79～156; FrC: 157～268; FrD:269～378; FrE:379～476)。對這6個組分進行體外殺蟲(掠食體和包囊)試驗，其中FrC對多子小瓜蟲掠食體和包囊的殺滅效果最強，故而利用中壓制備系統(Flash)對FrC以石油醚∶乙酸乙酯=1∶2為洗脫劑進行進一步分離純化，分離獲得一種具有殺蟲活性的單體化合物，對其進行波譜分析鑒定。

1.2.7 數據處理與分析

用SPSS 16.0處理藥效數據，以平均數±標準差表示,采用方差分析進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 丁香殺蟲活性部位的確定

丁香不同極性溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇)提取液對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用見表1。由表1可知，各提取液在所測的質量濃度范圍內對多子小瓜蟲幼蟲均具有一定的殺滅作用，且隨著溶劑極性的增大其殺蟲效果逐漸降低。而殺蟲效果最好的為石油醚提取物，其質量濃度為50.0 mg/L時,在4 h即可殺滅100%幼蟲，而甲醇的殺蟲效果最差，其質量濃度為80 mg/L時殺滅率為30.0%。各提取物對多子小瓜蟲的殺滅活性的順序則依次是石油醚>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>甲醇提取物。

丁香不同極性溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇)提取液對多子小瓜蟲包囊的殺滅作用見表2。由表2可知，各提取液對多子小瓜蟲的包囊均具有殺滅或抑制作用，且隨著溶劑極性的增大其殺蟲效果逐漸降低。而殺蟲效果最好的為石油醚提取物，其質量濃度為80.0 mg/L時可100%殺滅包囊，而甲醇提取物的效果最差，其質量濃度為80.0 mg/L時包囊的死亡率為30%。各提取物對多子小瓜蟲的殺滅活性的順序則依次是石油醚>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>甲醇提取物。

通過上述試驗，確定丁香殺多子小瓜蟲的活性部位為丁香的石油醚提取部位，對該部位進行進一步的分離。

圖1 丁香4種不同極性溶劑提取物對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用(4 h)注：PE-E：石油醚提取物；CL-E：氯仿提取物；EA-E：乙酸乙酯提取物；ME-E：甲醇提取物.

質量濃度/mg·L-1死亡率/%孵化蟲數/個·包囊-1質量濃度/mg·L-1死亡率/%孵化蟲數/個·包囊-100.0±0.0a656.7±45.2a00.0±0.0a656.7±45.2a石油醚提取物20.026.7±3.3b684.3±55.7a氯仿提取物20.00.0±0.0a666.2±63.2a40.056.7±6.7c617.1±33.5a40.013.3±6.7b638.6±39.3a60.083.3±3.3d205.3±38.5b60.033.3±3.3d543.6±35.0b80.0100±0.00e0.00±0.00c80.043.3±6.7e341.5±22.8c乙酸乙酯提取物20.013.3±3.3b661.1±55.5a甲醇提取物20.00.0±0.0a651.3±33.7a40.026.7±3.3c633.4±41.0a40.00.0±0.0a628.7±46.3a60.040.0±6.7d611.5±28.0a60.010.0±0.0b615.3±45.7a80.060.0±6.7e436.3±24.5a80.030.0±2.2c433.3±35.3b

注：字母表示與對照組差異顯著(P<0.05).

2.2 殺蟲活性成分的結構鑒定

對丁香石油醚提取物進行進一步的提取分離后獲得一種對多子小瓜蟲幼蟲和包囊均具有較好殺滅作用的單體化合物，該化合物為黃色液體，有芳香氣味，溶于乙醇、乙醚、氯仿，極微溶于水。對該化合物進行波譜分析：EI-MS m/z:165[M++1];1H-NMR (CDCl3 )δ 6.76 (1H, d,J = 8.0 Hz,H-6) ,6.74 (1H, dd,J= 8.02.0 Hz,H-5) ,6.70(1H, d,J= 2.0 Hz,H-3),5.92(1H,ddt,J= 16.0,10.0, 0.7, 0 Hz, H-8), 5.05(2H, m, H-9a,9b), 3.80 (3H,s,2-OCH),3.28 (2H,d,J=7.0 Hz,H-7);13C-NMR(CDCl3)δ 147.9(C-1), 148.9(C-2), 111.9(C-3), 133.1(C-4), 120.65(C-5), 112.3(C-6), 39.8(C-7), 137.4(C-8), 115.8(C-9), 56.2(2-OCH3)。上述圖譜數據與文獻[11]基本一致，故鑒定該化合物丁香酚。

2.3 丁香酚對多子小瓜蟲的殺滅作用

丁香酚對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用見圖2。由圖2可知，丁香酚對多子小瓜蟲具有較強的殺滅作用，隨著質量濃度的增加其殺滅作用逐漸增強。其15 min、1 h、2 h、3 h 和 4 h的半數致死質量濃度(95% 置信區間) 分別為6.21 (5.85～6.65) mg/L、3.50 (3.24～3.84) mg/L、2.90 (2.62～3.22) mg/L、2.33 (2.10～2.50) mg/L 和 2.15 (1.98～2.32) mg/L，其質量濃度為3.5 mg/L時，對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅率為100%。

圖2 丁香酚對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用4 h

丁香酚對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用見表2。由表2可知，丁香酚作用多子小瓜蟲包囊后，可顯著抑制包囊的分裂，其質量濃度為16.0 mg/L時，包囊未分裂，沒有幼蟲孵化，提示其可100%殺滅包囊。而8.0 mg/L和12.0 mg/L質量濃度組均有幼蟲浮出，但其蟲體孵化數分別為(435.1±12.6)個/包囊和(222.5±26.5)個/包囊，均顯著低于對照組(598.5±38.0)個/包囊。

包囊抑制試驗結果還顯示，丁香酚對多子小瓜蟲的包囊的結構具有極大的破壞作用。16.0 mg/L試驗組經6 h作用后，多子小瓜蟲的包囊結構完全破壞，胞質外流，細胞核不可見。而對照組包囊結構完好，且分裂完全(圖3)。

表2 丁香酚對多子小瓜蟲包囊的成活和孵化影響(6 h)

圖3 丁香酚作用多子小瓜蟲包囊后的顯微結構a：丁香酚作用6 h后；b：正常分裂包囊.40×.

3 討 論

3.1 丁香的殺小瓜蟲活性部位

天然植物因其源于自然，具有易降解、不易產生耐藥性、生物安全性高且結構多樣性的優點而越來越受新藥研究者的重視，并逐漸成為研究的熱點。中藥活性部位篩選，多根據化合物結構“相似相溶”的原理，采用極性由弱漸強的不同溶劑進行系統提取[12]，進而在相同條件下進行部位活性比較試驗來判斷活性部位。本研究通過石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等4種溶劑對丁香進行系統提取，發現其殺多子小瓜蟲的高效活性成分主要存在于石油醚提取物中，同時本研究也主要針對石油醚提取部位進行追蹤分離純化，并分離得到一種單體化合物，經波譜分析鑒定為丁香酚，其對多子小瓜蟲幼蟲的100%殺滅的質量濃度為3.5 mg/L，其殺蟲效果明顯優于從博落回中分離到的二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿[10]，以及從五倍子中分離到五沒食子酰葡萄糖[13]，說明丁香酚具有較強的殺蟲活性和較廣的應用的前景。同時，天然植物化學成分比較復雜，有些成分具有較高的活性成分，但是其在植物中的含量極低，故而可能在初篩中體現不出活性優勢，因而本研究中乙酸乙酯提取物和氯仿提取物也表現一定的殺蟲活性，可能存在的更好殺蟲活性成分。

3.2 丁香酚殺蟲作用及機理

丁香酚即4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，又稱子丁香酚，廣泛存在于丁香酚、肉桂葉油、樟腦油等芳香油中[14]。在水產養殖中丁香酚主要作為麻醉劑，在魚類親魚采卵、活魚運輸過程中應用[15-16]。而在醫藥上，具有抑菌、麻醉、解熱、抗氧化、抗腫瘤、促進透皮吸收、驅蚊等多種藥理活性[17-19]，本研究發現丁香酚具有較強的殺多子小瓜蟲的作用，這是首次發現該化合物具有殺水產動物寄生蟲功能。張杰等[20]在研究丁香酚對灰葡萄孢(Botrytiscinerea)孢子細胞膜透性中發現，在短時間(15 min)內丁香酚即可破壞菌絲細胞膜的通透性，使菌絲細胞膜對K+的選擇通透性增加，隨著處理時間延長，細胞破裂，進而可能導致蛋白質及其他大分子物質的外流情況。Gill等[21]發現丁香酚能抑制李斯特菌(Listeriamonocytogenges)和沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)的三磷酸腺苷酶活性，進而影響其能量代謝。Usta等[22]研究表明，丁香酚可抑制小鼠肝臟細胞膜上Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性，進而影響K+運輸，打破膜內外濃度平衡，進而導致內外物質交換失衡細胞損傷。而本研究丁香酚對包囊的研究結果也顯示，其可導致多子小瓜蟲包囊的破裂，其作用機理也可能是改變了包膜上通透性或某些物質的運輸進而導致包膜破裂，但其具體的作用位點、作用模式和作用機制還需進一步研究。

筆者從丁香中提取到一種對多子小瓜蟲具有較好殺滅作用的活性物質丁香酚，從植物中提取丁香酚的提取率高，成本低，且該化合物結構比較簡單較易合成。因此，丁香酚有望成為一種高效、低毒、環保型的綠色水產動物殺蟲劑，具有廣闊的開發利用前景。

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IsolationofActiveCompoundsfromEugeniacaryophyllataagainstIchthyophthiriusmultifiliisinVitro

YAO Jiayun, XU Yang, YUAN Xuemei, LIN Lingyun, YIN Wenlin, PAN Xiaoyi, HAO Guijie, SHEN Jinyu

( Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Ministry of Agriculture， Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province，Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001, China )

Ichthyophthiriusmultifiliisis a holotrichous protozoan that invades the gills and skin surfaces of fish and can cause morbidity and high mortality in most species of freshwater fish worldwide. The present study was undertaken to investigate the antiparasitic activity of crude extracts and pure compounds fromEugeniacaryophyllata. The driedE.caryophyllatawas extracted successively in a separating funnel with petroleum ether, ethyl acetate, chloroform and methanol, in which only the petroleum ether extract showed promising activity (100% effectiveness againstI.multifiliistheronts and encysted tomonts at the concentration of 50.0 mg/L and 80.0 mg/L respectively) and therefore, was fractionated on silica gel column chromatography in a bioactivity-guided isolation affording a compound showing potent activity. The structure of the compound was elucidated as clove oil by hydrogen and carbon-13nuclear magnetic resonance spectrum and electron ionization mass spectrometry. The in vitro tests revealed that clove oil was found to be 100% effective against encysted tomonts at the concentration of 16.0 mg/L. The results showed that clove oil has potent anti-parasitic efficacy with the 15 min-, 1 h-, 2 h-, 3 h- and 4 h-LC50(95% Confidence Intervals) of 6.21 (5.85—6.65) mg/L, 3.50 (3.24—3.84) mg/L, 2.90 (2.62—3.22) mg/L, 2.33 (2.10—2.50) mg/L and 2.15 (1.98—2.32) mg/L against theronts ofI.multifiliis, respectively. The findings provide important information for the potential application of clove oil in the therapy of serious infection caused byI.multifiliis.

clove oil;Ichthyophthiriusmultifilis; active site; bioactivity-guided isolation

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.011

S941.5

A

1003-1111(2016)06-0669-06

2015-12-28；

2016-03-08.

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(31302211)；浙江省公益技術應用研究項目 ( 2014C32055 ).

姚嘉赟(1980—)，男，副研究員，碩士；研究方向：水產動物疾病防治. E-mail:yaojiayun@126.com. 通訊作者：沈錦玉(1963—)，女，研究員，碩士；研究方向：水產動物病害防治. E-mail:sjinyu@126.com.