miRNA-186靶向Twist-1促胃癌侵襲、遷移的機制研究

徐繼 何徐軍 葉再元 喻曉芬

●論 著

miRNA-186靶向Twist-1促胃癌侵襲、遷移的機制研究

徐繼 何徐軍 葉再元 喻曉芬

目的 檢測miRNA-186在胃癌中的表達情況，觀察miRNA-186表達改變對人胃癌細胞株侵襲、遷移能力的影響并分析可能的分子機制。方法 RT-PCR法檢測40例胃癌患者胃癌及配對的正常胃黏膜組織中miRNA-186的表達水平，同時檢測miRNA-186在胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞中的表達水平。在胃癌細胞中分別轉染miRNA-186模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）以上調、下調miRNA-186的表達，應用Transwell試驗觀察其對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響。應用生物信息學軟件預測miRNA-186可能的靶基因，并經雙熒光素酶試驗及Western blot試驗驗證靶基因，分析其促轉移的分子機制。結果 胃癌組織相較于正常胃黏膜組織、胃癌細胞株相較于正常胃黏膜上皮細胞株的miRNA-186表達水平均降低（均P＜0.05）。在胃癌細胞中，分別上調、下調miRNA-186的表達水平，能夠抑制、促進胃癌細胞的侵襲、遷移能力。miRNA-186與Twist-1之間存在反向調控的關系，Twist-1是miRNA-186的靶基因。同時發現，下調miRNA-186的表達時，Twist-1和N-cadherin表達上調，E-cadherin表達下調，而當上調miRNA-186的表達時，Twist-1和N-cadherin表達下調，E-cadherin表達上調。結論 在胃癌組織中miRNA-186的表達水平降低，可能通過靶向調控Twist-1的表達，改變E-cadherin和N-cadherin的表達水平，導致胃癌細胞上皮間質轉化，進而促進胃癌細胞的侵襲、遷移。

胃癌 miRNA-186 Twist-1 侵襲 遷移

胃癌是發病率居全球第4位、病死率居我國第2位的惡性腫瘤[1]。由于胃癌患者就診時多已處于疾病晚期（Ⅲ或Ⅳ期），淋巴結轉移率高達50%～75%，同時常有遠處轉移，術后5年生存率不足40%[2-3]。因此，深入研究有關胃癌發生、發展的分子機制有重要的臨床意義。微小RNA（miRNA）是一段長度在22nt左右的非編碼RNA核苷酸序列，其通過結合靶基因的3’UTR區影響mRNA轉錄，抑制蛋白質翻譯而發揮作用[4]。研究表明，多種miRNA的異常表達與胃癌細胞的增殖、侵襲、遷移密切相關，如miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-141等[5-9]。miRNA-186是新近發現的與腫瘤發生相關的miRNA，如膀胱癌、腸癌、非小細胞型肺癌和胰腺癌等[10-13]，其與胃癌的相關研究報道少見。本研究采用RT-PCR法分析miRNA-186在胃癌中的表達情況；在胃癌細胞中上調和下調miRNA-186表達，利用Transwell試驗分析其對細胞侵襲、遷移能力的影響；應用生物信息學軟件預測相關靶基因,雙熒光素酶試驗和Western blot試驗進一步分析miRNA-186影響胃癌侵襲、轉移的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌細胞株BGC-823、MKN-45、MKN-28、7901、BGC-803、AGS和正常胃黏膜上皮細胞株GES-1均購自上海中國科學院細胞庫；1640培養基購自美國Hyclon公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；細胞侵襲試劑盒（ECM554）和細胞遷移試劑盒（3422）購自美國Millipore公司；PCR引物由華大基因公司合成；Lipofectamine 3000試劑盒購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑盒、Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit、Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBRRKit購自日本TaKaRa公司；miRNA-186 inhibitor and mimic購自美國Qiagen公司；Twist-1 3’-UTR報告載體pYr-MirTarget-Twist-1-3U及熒光素酶報告系統購自長沙贏潤生物技術有限公司；Twist-1、GAPDH、E-cadherin、N-cadherin抗體購自美國Abcam公司；PVDF膜、超敏化學發光（ECL）試劑盒等常規試劑均購自于杭州捷程生物技術有限公司。

40例胃癌組織及配對的正常胃黏膜組織標本取自2010年1月至10月在浙江省人民醫院行手術切除治療的胃癌患者（年齡38～73歲），冷藏于－80°C冰箱，保存于浙江省胃腸病學重點實驗室生物樣本庫?；颊呶赴㏕NM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期12例。本研究得到浙江省人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胃癌細胞株BGC-823、MKN-45、MKN-28、7901、BGC-803、AGS和正常胃黏膜上皮細胞株GES-1常規培養于含10%胎牛血清的1640培養基（含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml），置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2 mRNA提取、cDNA合成、RT-PCR檢測miRNA-186表達水平 按照Trziol試劑盒使用說明書提取組織標本和各細胞株的mRNA；采用Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit進行miRNA cDNA的合成；采用Mir-XTMmiRNA RT-PCR SYBRRKit檢測miRNA-186的表達水平。miRNA-186及RNU6b引物分別為5’-GCCCAAAGGTGAATTTTTTG-3’、5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；以95℃5 min、95℃10 s、60℃20 s、72℃20 s共40個循環進行RT-PCR檢測反應，并分析其熔化曲線。組織標本及各細胞株的miRNA-186相對表達水平采用2－ΔΔCt法進行計算。

1.2.3 細胞轉染miRNA-186抑制物（inhibitor）和模擬物（mimic） 分別以每孔5×105個細胞的密度將胃癌MKN-28細胞（低表達miRNA-186）和7901細胞（高表達miRNA-186）鋪于6孔板中；常規培養24h后待其貼壁，利用Lipofectamine 3000試劑盒將MKN-28細胞和7901細胞分別轉染miRNA-186 inhibitor和 mimic及相應的陰性對照，所有轉染步驟均按照試劑盒說明書執行，轉染24h后收集細胞用于后續研究。

1.2.4 Transwell試驗檢測細胞侵襲、遷移能力 分別利用預先鋪有或者沒有ECMatrix基質膠的膜孔徑為8μm的侵襲、遷移試劑盒分別進行細胞侵襲、遷移試驗。分別將上述轉染了miRNA-186 inhibitor、mimic及相應陰性對照的胃癌7901及MKN-28細胞用無血清1640培養基調整至適當細胞濃度，分別鋪于侵襲、遷移試劑盒的上室（均為每孔10×104個細胞），下室分別加入含30%胎牛血清的1640培養基；培養24h和48h后取出小室，95%乙醇固定10min，用棉簽小心拭除上室未穿過微孔膜的細胞，常規HE染色，顯微鏡下觀察各組穿過微孔膜的胃癌細胞，分析上調和下調miRNA-186表達對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響。

1.2.5 miRNA-186靶基因預測及雙熒光素酶試驗 利用生物信息學軟件（miRBase Targets、TargetScan Release 5.0、PicTar databases）預測Twist-1是miRNA-186的一個靶基因。分別將Twist-1 3’-UTR區miRNA-186的結合位點序列（WT序列，野生型序列）及突變型序列（MUT序列，去除了miRNA-186結合位點的Twist-1 3’-UTR序列）插入到pYr-MirTarget-Twist-1-3U的報告載體中。雙熒光素酶檢測詳細操作步驟參見Promega公司的官方Protocol，簡要如下：將人293細胞按每孔2×103個細胞分別鋪于96孔板中，分為NC組（共轉染pYr-MirTarget報告質粒、miRNA-186 mimics）、WT組（共轉染pYr-MirTarget-Twist-1-3U報告質粒、miRNA-186 mimics）、MUT組（共轉染pYr-MirTarget-Twist-1-MUT-3U報告質粒、miRNA-186 mimics）；每組設3個復孔，48h后利用多功能酶標儀進行雙熒光素酶檢測，按照說明書配制PLB細胞裂解液、LARⅡ檢測液、Stop&Glo檢測液；在96孔中加入20μl細胞裂解液，然后加入100μl的LARⅡ溶液，混合后放入發光檢測儀檢測第1次發光值（海腎熒光值）；接著加入Stop&Glo檢測液，終止第1次發光，同時開始第2次發光，混合后放入發光檢測儀檢測第2次發光值（螢火蟲熒光值）；將第2次發光值除以第1次發光值，得到海腎/螢火蟲的雙熒光素酶檢測值。

1.2.5 Western blot法檢測蛋白表達水平 分別收集上述轉染了miRNA-186 inhibitor、mimic及相應對照的胃癌7901及MKN-28細胞，利用RIPA裂解液在冰上裂解細胞60min，4℃15 000r/min離心30min，小心吸取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白，10% SDS-PAGE膠電泳，將蛋白轉印至0.45μm的PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，分別加Twist-1（1∶1 000稀釋）、GAPDH（1∶3 000稀釋）、E-cadherin（1∶2 000稀釋）和N-cadherin（1∶1 000稀釋）一抗4℃振蕩孵育過夜，TBST洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1h，TBST洗滌3次，膜上加入ECL試劑，利用化學發光凝膠成像系統（ChemiDoc MP，Bio-rad）檢測Western blot條帶信號。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗或配對t檢驗。

2 結果

2.1 miRNA-186在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達水平 見圖1。

圖1 miRNA-186在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達水平（a：在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達水平比較；b：在不同胃癌細胞株與正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的表達水平比較）

由圖1可見，miRNA-186在胃癌組織中的表達水平明顯低于在正常胃黏膜組織中的表達水平 [（0.0013± 0.0002）vs（0.0066±0.0008），P＜0.05]；miRNA-186在胃癌細胞株BGC-803、MKN-45、7901、MKN-28、BGC-823、AGS中的表達水平均低于在正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的表達水平（均P＜0.05），且不同胃癌細胞株間兩兩比較，miRNA-186在胃癌細胞株7901中相對高表達（均P＜0.05），而在胃癌細胞株MKN-28中相對低表達（均P＜0.05）。

2.2 miRNA-186對胃癌7901、MKN-28細胞侵襲、遷移能力的影響 見圖2。

由圖2可見，與陰性對照相比，胃癌7901細胞轉染miRNA-186 inhibitor后侵襲、遷移能力均顯著增強，即每視野穿膜細胞數均顯著增加（均P＜0.05）；胃癌MKN-28細胞轉染miRNA-186 mimics后侵襲、遷移能力均顯著減弱，即每視野穿膜細胞數均顯著減少（均P＜0.05）。

2.3 miRNA-186靶基因預測與驗證 見圖3。

由圖3可見，生物信息學軟件預測到在Twist-1的3’-UTR區有1個miRNA-186的結合位點。Western blot結果顯示胃癌細胞中上調miRNA-186的表達能夠顯著抑制Twist-1的表達（P＜0.05），當抑制miRNA-186的表達時可上調的Twist-1（P＜0.05）。雙熒光素酶試驗結果顯示WT組中的熒光素酶活性明顯低于NC組（P＜0.05）；而MUT組的熒光素酶活值與NC組比較無統計學差異（P＞0.05）。

同時Western blot結果顯示，在胃癌7901細胞中，轉染miRNA-186 inhibitor下調miRNA-186表達后，上皮類標志物E-cadherin表達顯著下調（P＜0.05），而間質類標志物N-cadherin顯著上調（P＜0.05）。與此相反，在胃癌MKN-28細胞中上調miRNA-186的表達，N-cadherin的表達下調（P＜0.05），E-cadherin的表達上調（P＜0.05）。

圖2 miRNA-186對胃癌7901、MKN-28細胞侵襲、遷移能力的影響（a：7901細胞；b：MKN-28細胞）

圖3 miRNA-186靶基因預測與驗證（a：miRNA-186靶基因結合位點及野生型，突變型載體構建示意圖；b：雙熒光素酶試驗結果；c：Western blot結果）

3 討論

新近研究顯示,miRNA-186在多種腫瘤組織中表達降低，如肺癌、前列腺癌、膀胱癌和腸癌等[10-12,14]。在肺癌中，miRNA-186的表達降低，通過影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移能力促進肺癌的進展和獲得差的預后[12]。在膀胱癌細胞中外源性上調其表達后，miRNA-186通過靶向調控PPM1B基因，將阻滯于細胞G1～S期，從而抑制細胞的增殖[10]。雖然，miRNA-186在大多數腫瘤中低表達，呈現出抑癌基因的功能，但Goeppert等[15]和Myatt等[16]的研究結果顯示，在肝癌和子宮內膜癌中，miRNA-186分別通過抑制抑癌基因AKAP12和FOXO1的表達促進腫瘤的進展，呈現出癌基因的活性。本研究結果顯示，與在正常胃黏膜組織中相比，miRNA-186在胃癌組織中的表達顯著降低；下調miRNA-186的表達能夠顯著增強胃癌細胞的侵襲、遷移能力，而上調其表達能夠抑制胃癌細胞的侵襲、遷移能力。這提示miRNA-186在胃癌中呈現抑癌基因的功能。通過生物信息數據庫檢索發現Twist-1可能為miRNA-186的1個靶基因。

Twist-1是1個包含堿性螺旋-環-螺旋結構域和氨基酸基序的轉錄因子，與肌肉、軟骨、成骨等細胞的分化有關，其主要功能是調節原腸胚形成和中胚葉發育，提示其在胚胎發育和分化過程中發揮極其重要的作用。此外，Twist-1在調節程序性細胞死亡、炎癥過程、形態發生及細胞遷移中同樣具有重要意義[17-18]。近年來，大量的研究結果顯示表明，Twist-1除了在上述過程中的發揮重要作用外，還參與到腫瘤的起始與擴增、腫瘤微環境調控、干細胞樣細胞的形成、上皮間質轉化等[19]。目前，Twist-1與腫瘤關系的研究主要集中在其潛在的具有調節癌細胞轉移能力和炎癥調節作用這兩個方面。Pham等[20]發現，Twist-1是抑制細胞免疫和體液免疫的關鍵因子，它能夠通過影響轉錄因子T-bet、Runx3和STAT4的活性從而降低Th1細胞產生IFN-γ。與此同時，該研究還發現Twist-1能夠通過抑制IL-6 mRNA的轉錄，從而抑制STAT3活化及IL-6反應性，進而抑制濾泡輔助性T細胞和輔助性T細胞17的發育,從而造成腫瘤細胞的免疫逃逸。

上皮間質轉化是指上皮型癌細胞轉化成具有遷移能力的間質型癌細胞的過程，在此過程中，最具有特征性的變化就是腫瘤細胞上皮極性和分化標記物（如E-cadherin）的缺失、間質標記物（如N-cadherin）的獲得。腫瘤細胞獲得間質表型后，具有從原位遷出的能力，使其與基質細胞相互作用，浸潤鄰近組織，侵入淋巴系統或血液循環并定植于其他部位，形成轉移灶。Twist-1是腫瘤上皮間質轉化過程中的關鍵誘導因子，Yang等[21]發現，Twist-1可以直接與E-cadherin啟動子區的E盒片段進行結合，從而抑制其表達。與此同時，鈣粘蛋白家族另一成員N-cadherin也被證實是Twist1的直接靶標[22]，雖然 Twist-1對其作用方式與前者類似，但效果卻是相反的。本研究發現Twist-1 3’UTR區存在與miRNA-186相結合的結合位點，利用構建野生型和突變型雙熒光素酶報告載體和Western blot試驗，結果發現miRNA-186能夠直接靶向負調控Twist-1的表達。進一步分析發現，在胃癌細胞中，下調miRNA-186的表達，能夠促進胃癌細胞的上皮間質轉換，即E-cadherin表達下調和N-cadherin表達的上調。

綜上所述，miRNA-186在胃癌組織中表達水平降低，進而顯著促進胃癌細胞的侵襲、遷移能力。此促進作用可能與miRNA-186靶向負調控Twist-1表達，下調E-cadherin和上調N-cadherin表達，進而促進腫瘤細胞的上皮間質轉變有關。本研究可能有助于臨床對miRNA-186促胃癌轉移的作用機制的了解，研發新的胃癌治療靶點。

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miRNA-186 promotes invasion and migration of gastric cancer cells by targeting Twist-1

XU Ji,HE Xujun,YE Zaiyuan,et al.Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China

Objective To investigate the effects of miRNA-186 on invasion and migration of gastric cancer cells and its possible mechanism. Methods The expression of miRNA-186 in gastric cancer tissue and gastric cancer cell line was detected by qPCR method.A mimic or an inhibitor of miRNA-186 was transfected into the gastric cancer MKN-28 and 7901 cells, respectively and the migration and invasion capacity of transfected cells were investigated using Transwell assays.The target genes of miRNA-186 and corresponding molecules were predicted according to miRBase Targets,TargetScan Release 5.0 and PicTar databases,and indentified by dual luciferase reporter assay and Western-blot assay. Results Among 40 gastric cancer tissue samples and 6 gastric cancer cell lines,the miRNA-186 expression levels were significant decreased compared with normal gastric tissue or cell lines.Transwell assay results indicated that inhibitor the expression of miRNA-186 in 7901 cells by transfecting the miRNA-186 inhibitors,the migration and invasion capacity of the cells was significantly increased,but that in MKN-28 cells transfected with miRNA-186 mimics was significantly decreases.Target gene prediction database and dual luciferase reporter assay indentified that Twist-1 was the target gene of miRNA-186.Western blot showed that the Twist-1 expression level was significantly increased,the cancer epithelial-mesenchymal transformation (EMT)markers E-cadherin was decreased,and the N-cadherin was increased when the expression of miRNA-186 was decreased in transfected 7901 cells.The contrast results were observed when the expression of miRNA-186 was increase in transfected MKN-28 cells. Conclusion MiRNA-186 is down-regulated in gastric cancer tissues,it may promote migration and invasion of gastric cancer cells by targeting Twist-1 and inducing EMT.

Gastric cancermiRNA-186 Twist-1 Invasion Migration

2016-07-20）

（本文編輯：李媚）

浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2015C33153）；浙江省醫藥衛生科學研究基金項目（2013KYBO17）

325035 溫州醫科大學（徐繼、葉再元，徐繼系在職研究生，現在浙江省人民醫院胃腸胰外科工作）；浙江省胃腸病重點實驗室（何徐軍）；浙江省人民醫院手術室（喻曉芬）

葉再元，E-mail:xuji120@163.com