骨髓間充質干細胞治療實驗性自身免疫性重癥肌無力的作用機制探討

翁益云 滕銀燕 楊德壕 李佳 張旭

骨髓間充質干細胞治療實驗性自身免疫性重癥肌無力的作用機制探討

翁益云 滕銀燕 楊德壕 李佳 張旭

目的 探討骨髓間充質干細胞（BMSCs）治療實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）的作用機制。方法 將Lewis大鼠隨機分為移植組、模型組和正常對照組，每組各10只。移植組、模型組大鼠腹腔注射單克隆抗體35（mAb35）建立EAMG模型，正常對照組大鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。分離培養BMSCs并作鑒定后，調整密度至1.5x106/600μl PBS，移植組尾靜脈注射細胞懸液600μl，模型組和正常對照組均予600μl PBS。采用雙盲法、免疫熒光檢測、ELISA和real-time RT-PCR分別測定3組大鼠Lennon臨床評分、腓腸肌乙酰膽堿受體（AChR）數量變化、血清乙酰膽堿受體抗體（AChR-Ab）含量和腓腸肌AChR、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）mRNA表達。結果 移植組Lennon臨床評分、血清AChR-Ab含量、腓腸肌AChR mRNA表達均低于模型組（P＜0.05）。正常對照組大鼠神經肌肉接頭處可見明顯紅色熒光，移植組可見斷斷續續、較為微弱的熒光，模型組未見紅色熒光。模型組大鼠腓腸肌MMP-9 mRNA表達量明顯高于移植組（P＜0.05）。結論 BMSCs能緩解EAMG大鼠的臨床癥狀，抑制MMP-9 mRNA表達可能是其作用機制。

實驗性自身免疫性重癥肌無力 骨髓間充質干細胞 基質金屬蛋白酶9

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種由乙酰 膽堿受體抗體（AChR-Ab）介導、細胞免疫依賴及補體參與的自身免疫性疾病。臨床上多采用免疫抑制劑治療MG，其療效尚可，但不良反應大、易耐藥，因此尋找其他能有效抑制患者免疫功能紊亂的方法是MG研究的熱點?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類金屬依賴的水解酶家族，可通過水解細胞外基質而在組織重塑過程中發揮作用[1-2]，其中MMP-9水平是典型代表，亦可由MMP-2或MMP-3來激活[3]。發生自身免疫性疾病時，人體血清MMP-9水平會升高[4-7]，且與病情密切相關[8]，也包括MG[9]。目前相關文獻報道證實在吉蘭巴雷綜合征、多發性硬化的動物模型上可通過抑制MMP-1、MMP-9來緩解病情[10-11]。骨髓間充質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是來源于中胚層的一種成體干細胞，可以分泌多種免疫相關的細胞因子并參與機體免疫調節，劉江恒等[12]研究表明移植BMSCs可以改善實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）的臨床表現，但具體機制目前尚未明確；故本文建立靜脈輸注BMSCs治療EAMG模型，檢測Lennon臨床評分、腓腸肌乙酰膽堿受體（AChR）數量變化、血清AChR-Ab含量和腓腸肌AChR、MMP-9 mRNA表達，以探討BMSCs的治療作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 實驗動物：清潔級純系雌性Lewis大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），6～8周齡，體重（125.2±10.9）g，健康清潔級環境下飼養。主要試劑：TIB-175雜交瘤細胞（美國ATCC公司）；DMEM/F12、胎牛血清（美國GIBCO公司）；Anti-Mouse/Rat CD 90.1（Thy-1.1）FITC、Anti-Rat CD45 APC（OX1）、Anti-Mouse/Rat CD29 PE、Mouse IgG2a K Isotype Control FITC、Mouse IgG1 K Isotype Control APC、Armenian Hamster IgG Isotype Control PE（美國EBioscience公司）；四甲基羅丹明標記的α-銀環蛇毒（美國Sigma公司）；兔抗神經元特異性烯醇化酶（NSE）、兔抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP），（武漢博士德生物工程有限公司）；real-time RT-PCR系統（美國Formentas公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；引物（美國Invitrogen公司合成）；SYBR GREEN（美國Biorad公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養及鑒定 BMSCs培養采用全骨髓培養法。無菌條件下分離Lewis大鼠股骨、脛骨并暴露骨髓腔，用DMEM/F12培養液（含1%青鏈霉素）反復沖洗骨髓腔，用沖出的骨髓制成單細胞懸液，離心沉淀用含10%血清、1%青鏈霉素的DMEM/F12培養液重懸后于37℃、5%CO2飽和濕度下常規培養。24h半換液，48h半換液，72h全換液，以后換液1次/3d，細胞生長至90%，用胰酶消化傳代，體外大量擴增備用。采集經體外培養至第3代的BMSCs，高倍顯微鏡下觀察BMSCs的形態。用誘導液（DMEM/F12、5mmol/Lβ-MEM）誘導BMSCs，采用免疫組化法測定神經元特異性烯醇化酶（NSE）的表達，細胞經4%多聚甲醛固定15min，0.3%Triton-X通透，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶后，以山羊血清封閉15min，滴加兔抗大鼠NSE（1∶100）、兔抗大鼠GFAP（1∶100）4℃孵育過夜（陰性對照用PBS代替一抗），加入生物素標記的山羊抗兔IgG孵15～20min，鏈親合素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）染色，PBS洗3次，DAB溶液顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用Anti-Mouse/Rat CD 90.1（Thy-1.1）FITC、Anti-RatCD45APC（OX1）、Anti-Mouse/Rat CD29 PE抗體標記，使用流式細胞儀檢測BMSCs表面標志抗原的表達率。

1.2.2 實驗動物分組及模型制備 將Lewis大鼠隨機分為正常對照組、模型組和移植組，每組10只。模型組、移植組大鼠給予腹腔注射濃縮的微克隆抗體35（mAb35）上清液，正常對照組給予腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。模型誘導成功后5h，移植組大鼠尾靜脈注射1.5×106BMSCs細胞懸液600μl（注射前1d細胞培養液換成無青鏈霉素培養液），模型組、正常對照組大鼠分別尾靜脈注射600μl PBS。

1.2.3 Lennon臨床評分[13]自移植日起，采用雙盲法對3組大鼠每8h作體重測量和Lennon臨床評分1次，共5次（48h）。0分：無臨床癥狀，正常肌力；1分：抓握后肌力減弱，叫聲低，易疲勞；2分：頭部下垂，弓背姿勢，前爪屈曲，步態蹣跚，后肢不完全癱瘓；3級：后肢癱瘓無法站立，哭叫無聲，瀕死狀態；4分：死亡。癥狀介于上述分值中間者分別評為0.5、1.5、2.5和3.5分。

1.2.4 血清AChR-Ab含量的測定 實驗結束時取3組大鼠心臟血，離心后取血清，采用ELISA試劑盒檢測血清AChR-Ab含量。

1.2.5 腓腸肌AChR數量的測定 取3組大鼠腓腸肌，-20℃行5μm冷凍切片，室溫干燥30min，丙酮酸4℃固定10min，PBS洗3次×5min，H2O2滅活內源性過氧化物酶15min，PBS洗3×5min，血清封閉20min，四甲基羅丹明標記的α-銀環蛇毒10mg/L 37℃孵育1h，PBS 3次×10min，防淬滅劑封片，采用免疫熒光檢測腓腸肌AChR數量變化。

1.2.6 腓腸肌AChR和MMP-9 mRNA表達的檢測 取100mg腓腸肌，用Trizol一步法提取總RNA，使用紫外分光光度儀定量測定，并使用Applied Biosystems 7500 real time RT-PCR系統進行分析，反應條件和引物見表1。設正常對照組AChR和MMP-9 mRNA表達量為1，計算模型組、移植組AChR和MMP-9 mRNA表達量。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

表1 轉錄因子的引物及PCR反應條件

2 結果

2.1 BMSCs的形態學特征 初始分離的骨髓細胞形態呈圓形，大小不一；24h半換液后可見少數貼壁細胞；48h半換液后，貼壁細胞明顯增多，主要呈圓形、多角形、短梭形、紡錘形等，見圖1a（插頁）；3d全量換液后，細胞形態以梭形、多角形為主，細胞增殖加快并構成較多成纖維樣細胞集落，其他雜質細胞逐漸減少；8～10d后細胞可達90%融合。傳代細胞一般24h內貼壁，增殖迅速，3～4d可融合至90%；3代后細胞形態較為一致，多呈長梭形、生長均勻，細胞間界線不清、排列規則，有一定的方向性，呈流線型，見圖1b（插頁）。誘導后細胞形態發生變化，胞體收縮成球形或錐形，折光性增強，有較多長突起，類似于神經元細胞，見圖1c（插頁）；免疫組化染色顯示誘導細胞NSE表達陽性，未誘導細胞不表達，見圖1d（插頁）。

2.2 BMSCs表面標志抗原的表達率 流式細胞儀檢測結果顯示大鼠BMSCs表面高表達CD90、CD29，表達率分別為99.04%和98.53%，見圖2b（插頁）；CD45表達率僅為0.01%，見圖2d（插頁），詳見圖2。

2.3 大鼠Lennon臨床評分 正常對照組無任何臨床表現，Lennon臨床評分為0分；實驗結束時模型組Lennon臨床評分為（2.69±0.96）分，高于移植組的（1.08± 0.66）分，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 血清AChR-Ab含量 正常對照組、模型組和移植組AChR-Ab含量分別為（364.8±15.8）、（1 431±102.9）和（430.85±28.8）ng/ml。模型組相較于移植組、正常對照組，血清AChR-Ab含量明顯升高（P＜0.05）；移植組血清AChR-Ab含量略高于正常對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 腓腸肌AChR數量變化 正常對照組大鼠神經肌肉接頭（NMJ）處可見明顯紅色熒光，顯示與α-銀環蛇毒特異結合的AChR，見圖3a（插頁）；輸注mAb35的模型組未見紅色熒光，說明輸注的抗體結合了大量的AChR，見圖3b（插頁）；移植組可見斷斷續續、較為微弱的熒光，說明移植組大鼠NMJ處仍保留部分AChR，見圖3c（插頁）。

2.6 腓腸肌AChR mRNA表達 模型組大鼠腓腸肌AChR mRNA表達量為1.640±0.242，高于移植組的1.056±0.118，但差異無統計學意義（P＜0.05）。

2.7 腓腸肌MMP-9 mRNA表達 模型組大鼠腓腸肌MMP-9 mRNA表達量為4.220±0.650，明顯高于移植組的0.820±0.085，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

MG是由AChR-Ab介導的自身免疫性疾病，免疫異常致NMJ傳遞功能障礙而引起骨骼肌的病態疲勞。自身免疫性疾病患者需長期接受免疫抑制劑或細胞毒性藥物治療，但該類藥物不良反應較大且不能根治疾病，具有一定的局限性。多年來國內外學者一直致力于尋求一種安全有效的治療方法。BMSCs具有自我更新、多項分化的潛能，可在體外保持多能特性的前提下快速擴增，而輸注體內不會發生同種異體排斥，可以定位于損傷部位并抑制各種炎癥、免疫反應，臨床上將其作為疾病治療的種子細胞[14]，目前已應用于移植物抗宿主病、多發性硬化等多種人類疾病的治療。有研究表明BMSCs能改善EAMG[12]，本文旨擬通過靜脈移植BMSCs來探討其治療EAMG的作用機制。

目前認為BMSCs無特異性表面抗原，故尚無特異性抗體直接免疫鑒定，大多研究通過細胞形態、流式細胞儀的檢測和誘導分化來佐證[15]。整合素家族CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105是BMSCs的重要標志物[16]，且BMSCs不表達造血細胞表面抗原，如CD45、CD34等。因此，本實驗選取BMSCs表達陽性的指標CD29、陰性指標CD45和表示未分化狀態的CD90作為鑒定指標，結果表明所提取的BMSCs細胞形態一致，多呈長梭形；流式細胞檢測結果顯示培養的細胞高表達CD90、CD29，低表達CD45，且在β-巰基乙醇誘導下可分化為神經元樣細胞；以上結果表明本研究提取的是純度較高的的BMSCs。將培養成功的BMSCs靜脈輸注EAMG大鼠后，移植組大鼠Lennon臨床評分、血清AChR-Ab含量均明顯低于模型組；免疫熒光檢測結果可見AChR數量較模型組增多。real time RT-PCR結果顯示模型組AChR mRNA表達升高，移植組下降，與Sheng等[17]EAMG模型組大鼠骨骼肌中AChR mRNA表達量增加、病情嚴重大鼠的表達更高的結果一致，提示靜脈輸注BMSCs可降低AChR-Ab含量，一定程度上起到保護AChR的作用，從而改善EAMG臨床表現。Helgeland等[9]發現MG患者血清MMP-9水平明顯上升，上調的MMP-9可能參與炎癥細胞的浸潤、基膜破壞和自身免疫致病機制。本文通過檢測腓腸肌MMP-9 mRNA表達情況，發現模型組MMP-9 mRNA表達明顯高于正常對照組，與前期研究結果一致[18]；而移植組MMP-9 mRNA表達有所下降，說明輸注BMSCs后可以減少EAMG大鼠促炎蛋白MMP-9 mRNA的表達，與Lee等[19]在人骨髓間充質干細胞（hMSCs）移植治療心肌梗死小鼠的研究結果一致，原因可能與BMSCs對MMP-9的抑制作用有關。

綜上所述，尾靜脈注射BMSCs可以有效改善EAMG大鼠的臨床癥狀，下調血清AChR-Ab含量是一種可行的干預方法，作用機制可能與抑制MMP-9表達、減輕EAMG大鼠體內炎癥反應有關。

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Treatment of experimental autoimmune myasthenia gravis with bone marrow stromal stem cells in rats

WENG Yiyun,TENG Yinyan,YANG Dehao,et al.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effects of bone marrow stromal stem cells(BMSCs)in treatment of experimental autoimmune myasthenia gravis(EAMG)in rats. Methods Thirty Lewis rats were divided randomly into the transplantation group, the model control group and the normal control group with 10 rats in each group.EAMG model was induced by intraperitoneal injection of mAb-35 in transplantation group and model control group.BMSCs were isolated,cultured and identified from healthy Lewis rats.Rats in transplantation group were injected with 1.5×106BMSCs diluted in 600ml PBS,and the same volume of PBS was injected in the model control and the normal control group.The symptoms of rats were observed,the titers of plasma AChR-Ab were detected by ELISA,the AChR changes in gastrocnemius were examined by immunofluorescence technique,and the expressions of AChR and MMP-9 mRNA were detected by real-time RT-PCR in all groups. Results The clinical score,the titers of AChR-Ab,and the expression of AChR mRNA in the transplantation group were significantly lower than those in the model control group.There were no significant differences in above variates between transplantation and the normal control group.The immunofluorescence assay showed EAMG group had no red fluorescence,while the transplantation group had intermittently weak fluorescence.The expression of MMP-9 mRNA was higher in the model control group.However,there was no significant difference between transplantation group and normal control group. Conclusion BMSCs can ameliorate clinical manifestations in EAMG rats,which may be associated with inhibition of MMP-9 expression.

Experimental autoimmune myasthenia gravis Bone marrow stromal cells Matrix metalloproteinase 9

2015-12-17）

（本文編輯：陳丹）

浙江省自然科學基金項目（LY13H090010）

325000 溫州醫科大學附屬第一醫院神經內科（翁益云、楊德壕、李佳、張旭），超聲影像科（滕銀燕）

張旭，E-mail：drzhangxu@live.cn