果蠅天然免疫與寄生蜂毒液蛋白對其調控研究進展

楊 磊，方 琦，黃 佳，葉恭銀

（浙江大學昆蟲科學研究所農業部農業昆蟲學重點實驗室，浙江杭州 310058）

果蠅天然免疫與寄生蜂毒液蛋白對其調控研究進展

楊 磊，方 琦，黃 佳，葉恭銀*

（浙江大學昆蟲科學研究所農業部農業昆蟲學重點實驗室，浙江杭州 310058）

寄生蜂與寄主昆蟲間互作一直是昆蟲免疫學與寄生學的研究重點。模式昆蟲果蠅主要依賴其天然免疫系統來成功抵御外來生物入侵。寄生蜂寄生果蠅后，可激活寄主的免疫系統，包括細胞免疫和體液免疫。果蠅細胞免疫包括血細胞的增殖、分化、遷移與黏附并最終形成包囊。體液免疫則涉及免疫信號通路的激活和抗菌肽的產生。此外，黑化反應和活性氧的產生在果蠅體液免疫中也發揮重要作用。通過長期協同進化，寄生蜂亦已形成用以攻克果蠅天然免疫防御系統的策略。相關研究主要集中于果蠅幼蟲內寄生蜂，而有關其蛹期和外寄生蜂的相關研究則尚無報道。果蠅幼蟲寄生蜂調控寄主天然免疫因子主要包括毒液、類病毒顆粒和畸形細胞等，其中有關毒液蛋白組分及功能組成的研究已較深入。對果蠅寄生蜂毒液蛋白組分進行鑒定與功能研究將有助于深入揭示寄生蜂與寄主間互作機理，并為發展新型害蟲綠色防控技術提供依據。

果蠅；寄生蜂；免疫反應；毒液蛋白

昆蟲和其他無脊椎動物缺乏獲得性免疫反應，但在長期抵御病原物入侵的過程中進化出多重天然免疫系統［1］。果蠅作為農業上的重要害蟲，被廣泛用于各方面的研究，其中包括天然免疫反應。果蠅的天然免疫反應分為細胞免疫（cellular innate immunity response）和體液免疫（humoral innate immunity response），二者協同作用以抵御外來生物入侵［1-2］（圖1）。其中細胞免疫包括血細胞的延展（spreading）、吞噬（phagocytosis）、包囊（encapsulation）等，而體液免疫則涉及血淋巴黑化（melanization）、抗菌肽（antimicrobial peptides）合成等［3］。

寄生蜂作為膜翅目昆蟲中的一大類群，在害蟲生物防治中發揮著重要作用。寄生蜂與寄主昆蟲間互作一直是昆蟲免疫學與寄生學的研究重點。寄生蜂產卵于寄主體內（內寄生蜂，endoparasitoid）或體表（外寄生蜂，ectoparasitoid）及其后代于寄主體內或體表成功發育的過程中，其雌成蜂、胚胎或幼蟲可攜帶或分泌多種寄生活性因子，包括多分DNA病毒（polydnavirus，PDV）、毒液（venom）、類病毒顆粒（virus like particles，VLPs）、畸形細胞（teratocyte）等［4］。其中寄生蜂毒液在抑制寄主天然免疫反應過程中發揮著極其重要的作用。近年來，有關不同寄主昆蟲的寄生蜂毒液蛋白鑒定與功能分析雖已取得較大進展，但有關模式昆蟲果蠅寄生蜂的毒液蛋白在該領域的研究尚處起步階段。果蠅作為重要的模式昆蟲及水果害蟲，深入研究其與寄生蜂間的相互作用，尤其以寄生蜂毒液與寄主果蠅天然免疫反應間的相互作用為研究重點，將有助于闡明寄生蜂與寄主昆蟲間互作的生理與分子機理。本文結合相關領域的國內外研究進展，就果蠅天然免疫與寄生蜂毒液蛋白對其調控的進展作一簡單綜述，這將為利用寄生性天敵對植物害蟲進行生物防治提供理論依據與支撐。

1 果蠅天然免疫反應

1.1細胞免疫

果蠅細胞免疫主要發生于果蠅血腔內，由其血細胞介導完成，其血細胞主要類型包括：漿血細胞（plasmatocytes）、薄層細胞（lamellocytes）和晶細胞（crystal cell）3種［5］，這與其他類型昆蟲如鱗翅目昆蟲等存在顯著差異。不同類型的3種血細胞行使不同的生物學功能，并在果蠅細胞免疫反應中扮演不同角色。其中，漿血細胞主要起吞噬作用，薄層細胞可對大顆粒外源物進行包囊，而晶細胞則與黑化作用相關［3］。當寄生蜂產卵于果蠅幼蟲體內，果蠅血細胞可迅速對其進行非我識別并激活細胞免疫反應［6］。果蠅細胞免疫反應的激活主要涉及3個部分。首先，寄生蜂的卵誘導漿血細胞增殖和薄層細胞分化；其次，漿血細胞向卵遷移并在卵表面延展；最后，薄層細胞對卵進行包囊［7］。

圖1 果蠅天然免疫反應

1.2體液免疫

除細胞免疫外，果蠅還具有多重體液免疫系統，并在其天然免疫過程中發揮重要作用。果蠅體液免疫反應主要涉及抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）的誘導、表達合成與分泌，由蛋白水解酶所介導的黑化級聯反應，活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（NO）所介導的信號通路與效應分子合成及釋放等過程［8-10］。寄生蜂寄生果蠅后，會迅速激活果蠅體內的Toll信號通路和免疫缺陷（IMD）信號通路，從而上調效應分子抗菌肽基因的表達［11］。寄生蜂寄生果蠅后，能誘導果蠅體內合成并分泌的抗菌肽主要包括：Diptericin、Drosomycin、Cecropin、Metchnikowin、Defensin等［12］。此外，在果蠅體液免疫反應中扮演重要角色的血淋巴黑化反應亦會被寄生蜂卵所激活。當進入果蠅血腔的寄生蜂卵被包囊后，晶細胞釋放酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO），激活黑化級聯反應并產生黑色素沉積于卵表面，最終導致卵死亡［9］。最近有研究表明，果蠅腸道所產生的ROS和NO在抵御果蠅寄生蜂入侵過程中也發揮著重要作用［10］。

2 果蠅寄生蜂毒液蛋白調控寄主天然免疫反應

果蠅作為重要的模式昆蟲及農業上重要的水果害蟲，可被多種膜翅目寄生蜂寄生。目前有關果蠅寄生蜂的研究主要集中于有限的幾個種類中，主要包括膜翅目環腹蜂科Leptopilina屬和Ganaspis屬以及繭蜂科Asobara屬［13-14］。寄生蜂在成功寄生果蠅的過程中，其雌成蜂、胚胎或幼蟲可攜帶或分泌多種活性因子，包括有PDVs、毒液、VLPs、畸形細胞等多種寄主免疫抑制因子［4］。無論是外寄生蜂或是內寄生蜂，其毒液蛋白在抑制寄主天然免疫反應過程中均發揮了重要作用［15］。

2.1毒液蛋白鑒定

寄生蜂毒液是一種由多重組分構成的混合活性物質，主要由蛋白、肽及生物小分子等組成。毒液蛋白中的各組分大多由雌成蜂毒腺表達，而后其表達產物被轉運至毒囊中進行貯存，在寄生過程中，雌成蜂會將其毒囊中的毒液蛋白伴隨產卵過程而同時注入寄主果蠅體內。由于受限于果蠅寄生蜂雌蜂個體較小，毒囊組織更是微小，且每頭雌成蜂毒囊所含毒液極其微量，長期以來如何分離純化并鑒定獲得寄生蜂毒液蛋白組分一直是該研究領域的技術難點，這也使寄生蜂毒液蛋白的相關研究明顯落后于其他大型動物甚至其他社會性膜翅目昆蟲的毒液蛋白研究。近年來，基因組學、轉錄組學與蛋白質組學及高通量測序及生物大分子質譜鑒定技術的迅猛發展，為微型動物尤其是寄生蜂毒液蛋白的分離與鑒定提供了可能與技術支持［16］。目前已完成雌成蜂毒液蛋白分離與鑒定的果蠅寄生蜂的種類主要包括果蠅幼蟲內寄生蜂L.heterotoma、L.boulardi和Ganaspis sp.等13種。其中，從L.heterotoma毒液中共鑒定獲得176種毒液蛋白，其中得到注釋的毒液蛋白有90種，共分為12大類，未得到注釋的毒液蛋白共86種；從L.boulardi毒液中共鑒定獲得129種毒液蛋白，其中得到注釋的毒液蛋白有69種，共分為5大類，未得到注釋的毒液蛋白共60種；從Ganaspis sp.1毒液中共鑒定獲得166種毒液蛋白，其中得到注釋的毒液蛋白有98種，共分為19大類，未得到注釋的毒液蛋白共68種［14-16］。相較于果蠅幼蟲寄生蜂，其蛹期寄生蜂的毒液蛋白組分的分離與鑒定尚未見報道，研究相對滯后，該研究領域尚待昆蟲學家們進一步開拓。

2.2 毒液蛋白多樣性

現有研究結果表明，已成功分離鑒定的寄生蜂毒液蛋白組分，一般可歸類分為麻痹毒素、抗菌活性物質、酶類、酶抑制劑、未知組分等5大類［17］。不同科、屬，甚至種間的寄生蜂毒液蛋白組成之間存在一定的保守性與特異性［18］。截至目前，已經有超過17種寄生蜂的毒液蛋白組分得到分離鑒定，其中包含上述3種果蠅幼蟲內寄生蜂，即L. heterotoma、L.boulardi和Ganaspis sp.1［18］。此3種寄生蜂毒液蛋白的主要組成如表1所示［14-16］。SDS-PAGE結果表明，同為Leptopilina屬的L. heterotoma和L.boulardi雌成蜂毒液蛋白的組成間存在一定的相似性與差異性。此外，果蠅寄生蜂L.boulardi的不同地理種群的個體間毒液蛋白組成亦存在顯著差異性［18］。上述研究表明，果蠅寄生蜂可能因其營不同寄生策略，而在長期抵御寄主天然免疫反應過程中，通過協同進化而衍生出不同的毒液蛋白組分，用以滿足自身成功寄生所需。

表1 采用轉錄組與蛋白組學相結合的方法成功鑒定出的果蠅寄生蜂毒液蛋白組分

2.3 毒液蛋白功能

2.3.1 寄生蜂毒液蛋白調控果蠅細胞免疫反應

果蠅寄生蜂在長期抵御寄主細胞免疫反應的過程中進化出兩種應對策略，即免疫逃避和免疫抑制［19］。Ganaspis sp.1在寄生果蠅幼蟲后12 h內，可將卵黏附于其脂肪體或腸道組織；在寄生后12～24 h內，其卵可完全被寄主脂肪體或腸道組織所覆蓋，而使寄生蜂卵避免與寄主血細胞進行接觸，以此逃避寄主血細胞介導的包囊反應［14］。此外，現有多項研究表明，多種果蠅寄生蜂毒液蛋白可通過不同途徑抑制寄主的細胞免疫反應。例如，L.boulardi毒液蛋白中的Ras同源鳥苷三磷酸酶激活蛋白（ras homologous GTPase activating protein，RhoGAP）可通過抑制果蠅血細胞Rho家族的鳥苷三磷酸酶（Rho GTPases）活性，調節果蠅血細胞肌動蛋白細胞骨架、囊泡轉運和增殖、改變薄層細胞形態進而降低其黏附能力［20-21］。另外，家蠅蛹期外寄生蜂麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis毒液中的鈣網蛋白（calreticulin，CRT）能抑制寄主血細胞的延展反應，從而抑制寄主血細胞包囊反應［22］。毒液蛋白鑒定與分析結果表明，L. heterotoma和L.boulardi毒液蛋白中亦存在CRT組分，其與N.vitripennis的CRT無論在氨基酸序列及結構域上均具有高度的相似性，推測L.boulardi的CRT蛋白亦具有抑制果蠅血細胞包囊反應的功能［16］。L.boulardi毒液蛋白組分P4還可改變薄層細胞的細胞形態，進而抑制果蠅血細胞包囊作用［20］。L.victoriae毒液則可通過抑制果蠅薄層細胞表面蛋白的糖基化，進而改變其生物學特性［23］。果蠅寄生蜂L.heterotoma、A.citri和A.japonica毒液可引起寄主果蠅血細胞死亡或阻斷其分化，使血細胞數量下降，進而影響寄主細胞免疫反應［24］。此外，被Ganaspis sp.1寄生后的果蠅幼蟲漿血細胞無法向卵遷移并延展，但其血細胞形態無顯著變化，因此推測Ganaspis sp.1毒液可能通過抑制漿血細胞激活從而抑制包囊反應［14］。進一步研究結果表明，Ganaspis sp.1毒液蛋白中存在的內質網鈣腺苷三磷酸酶（sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA）組分能抑制寄主果蠅漿血細胞Ca2+內流，使Ca2+信號通路發生紊亂，以此來抑制漿血細胞激活［14］。

2.3.2 寄生蜂毒液蛋白調控果蠅體液免疫反應

相比于寄生蜂毒液蛋白調控果蠅細胞免疫反應方面的研究，寄生蜂毒液蛋白調控果蠅體液免疫反應的相關研究成果報道較少，主要包括寄生蜂毒液蛋白擾亂寄主抗菌肽合成，抑制寄主血淋巴中酚氧化酶級聯反應等［9］。L.boulardi毒液蛋白中的絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，serpin）組分能顯著抑制果蠅幼蟲血淋巴中的酚氧化酶原激活反應，進一步研究結果表明，其主要通過干擾寄主酚氧化酶原上游信號通路，進而抑制寄主血淋巴的黑化反應［11-28］。此外，該毒液組分還能抑制二元酚真黑色素前體多巴胺（dopamine，DA）和5，6-二羥基吲哚（5，6-dihydroxy-indole，DHI）的氧化，進而影響寄主果蠅體內的黑化反應［9］。另外，當果蠅被L.boulardi寄生后，其體內的Toll和JAK-STAT信號通路中多個基因表達被抑制，同時還降低了寄主免疫通路下游的Drosomycin和Metchnikowin等多種抗菌肽的合成與表達［11］。

3 小總與展望

果蠅寄生蜂是模式昆蟲與重要農業果樹害蟲的重要天敵，以其為研究對象，開展其與寄主間的互作研究，對于利用寄生性天敵防治植物害蟲具有重要的理論與實踐指導意義。近年來，隨著學者對果蠅寄生蜂毒液蛋白的研究逐步深入，其結構組成、組分分子特性、功能組成與組分作用機理逐漸明晰，這極大深化了昆蟲學界對寄生蜂與寄主昆蟲之間互作關系的認識，為其他種類寄生蜂毒液蛋白資源挖掘與利用奠定了很好的基礎。然而，目前有關寄生蜂毒液蛋白調控果蠅天然免疫反應方面的研究仍然存在諸多不足，尚有許多難題亟待深入解決。就不足之處，主要概括為以下幾點：第一，尚缺乏蛹期內寄生蜂及幼蟲或蛹期外寄生蜂與果蠅天然免疫反應間的互作研究，其互作機理更是尚未知曉；第二，目前相關研究多局限于單一毒液蛋白組分對果蠅天然免疫反應的調控作用，而有關多組分如何通過協同互作，進而有效調控寄主生理過程的研究尚不足；第三，果蠅與其寄生蜂的協同進化機制亦尚缺乏深入研究。

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（責任編輯：張 韻）

S186

：A

：0528-9017（2016）12-1951-05

文獻著錄格式：楊磊，方琦，黃佳，等.果蠅天然免疫與寄生蜂毒液蛋白對其調控研究進展［J］.浙江農業科學，2016，57（12）：1951-1955.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161204

2016-09-20

國家自然學科基金面上項目（31272098，31472038）

楊 磊（1993—），男，湖北十堰人，博士研究生在讀，研究方向為農業昆蟲與害蟲防治，E-mail：yanglei@zju.edu.cn。

葉恭銀（1966—），男，浙江建德人，博士，教授，研究方向為害蟲生物防治及昆蟲生理生化與分子生物學，E-mail：chu @zju.edu.cn。