固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中吡咯素的研究

劉慧琳,穆 琳,陳曉默,王 靜

(北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京工商大學,北京 100048)

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固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中吡咯素的研究

劉慧琳,穆 琳,陳曉默,王 靜*

(北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京工商大學,北京 100048)

采用固相萃取結合高效液相色譜技術檢測食品中的吡咯素。食品原料采用OasisTMHLB固相萃取柱進行預富集,并用HPLC法進行檢測。結果表明,吡咯素在5×10-7～2×10-3mol/L濃度范圍內呈現良好的線性關系,相關系數R2=0.9999,RSD為0.78%～7.51%,最低檢出限為5×10-7mol/L(S/N=3)。本方法操作簡單,靈敏度高,可應用于食品中痕量吡咯素的檢測。

高效液相色譜,固相萃取,吡咯素,檢測

晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)是指蛋白質中賴氨酸的氨基部分與還原糖的羰基部分在非酶條件下發生美拉德反應,生成穩定的美拉德產物[1],主要包括吠喃糠酰咪唑(FFI)、羧甲基賴氨酸(CML)、吡咯素(Pyrraline)、戊糖素等[2]。研究發現,人體每日攝入AGEs約25～75 mg[3],其中大部分是羧甲基賴氨酸(CML)和吡咯素(Pyrraline),它們被人體消化、吸收,并參與體內的循環代謝,使慢性病的患病風險大大提高,危害性很大。由免疫學檢測可知,糖尿病患者血清中的吡咯素含量顯著高于正常組,動脈粥樣硬化患者的腎小球基底膜以及胞外基質均出現了不同程度的吡咯素積聚的現象[4],進而發展為腎小球硬化,最終引發腎衰竭。吡咯素作為定量檢測晚期糖基化終產物的重要指標及衡量美拉德反應程度的重要參數之一[5],不僅在控制食品加工工藝和保障食品安全方面發揮重要作用[6],對糖尿病腎病、糖尿病血管并發癥、糖尿病神經病變、糖尿病心血管病變、白內障等疾病的診斷和研究具有重要的臨床意義[7]。

目前,吡咯素的檢測方法主要有反相高效液相色譜法[8-10]、光電二極管陣列檢測法等[11-12]。因食品基質較為復雜,若直接利用反向高效液相色譜檢測會縮短色譜柱的使用壽命;而離子交換色譜雖然耐酸堿,應用范圍較廣,易于再生、使用壽命長,但由于其機械強度較差、易溶脹且易被有機物污染,因此需要對實際樣品的預處理方法進行改進。固相萃取技術作為預處理方法,不僅起到了預富集和除雜的作用,還有效地簡化了檢測步驟并縮短了檢測時間,設備簡單,價格不高,分離速度可控,而且操作方便。此外,固相萃取與高效液相色譜聯用技術具有分辨率高,重復性好等優勢。

本文利用固相萃取技術作為預處理方法,結合高效液相色譜技術對實際樣品中的吡咯素進行了分析研究。通過優化固相萃取柱的種類、洗脫液的組成、液相色譜檢測的流速以及樣品的酸水解條件,從而對牛奶、奶粉、咖啡、醬油等常見食品中的吡咯素進行準確的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吡咯素標準品(Pyrraline,純度為99.04%) 多倫多研究化學品公司;硼氫化鈉、硼酸鈉緩沖液、三氯乙酸、丙酮、鹽酸、乙酸、甲醇、氨水、三氟乙酸 均為分析純；乙腈 色譜純；高純水 ≥18 MΩ·cm-1;高鈣牛奶、純牛奶、全脂奶粉1、全脂奶粉2、絲滑拿鐵咖啡、原味咖啡、生抽醬油、老抽醬油 購自當地超市。

島津LC-20A HPLC儀、Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱 島津(中國)有限公司;高速冷凍離心機 西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;OasisTMHLB固相萃取柱(3 cc,60 mg) 沃特世科技(上海)有限公司;MCX固相萃取柱(60 mg,3 mL)、C18固相萃取柱(60 mg,3 mL)、PCX固相萃取柱(60 mg,3 mL) 天津博納艾杰爾科技有限公司;UGC-24M氮吹儀 北京優晟聯合科技有限公司;KQ-700GVDV型三頻恒溫數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件 根據Portero-Otin法[9],色譜柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:水(0.1% TFA),流動相B:乙腈-水(1∶1,v/v),梯度洗脫程序:在1、10、30、35、40、45 min時流動相B的含量分別為0%、15%、20%、100%、0%,分析時間:45 min;流速:0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min;進樣量:5 μL;柱溫:室溫;紫外-可見光檢測器,檢測波長:298 nm。

1.2.2 配制標準溶液 稱取5 mg吡咯素標準品用高純水定容至10 mL,配制成摩爾濃度為2×10-3mol/L的標準儲備液,再依次稀釋成2×10-3、1×10-3、5×10-4、2×10-4、1×10-4、5×10-5、2×10-5、1×10-5、5×10-6、2×10-6、1×10-6、5×10-7mol/L一系列標準溶液,4 ℃冰箱存放。

1.2.3 固相萃取 根據Yoshihara法[15],并進一步優化實驗條件,將MCX柱、PCX柱、C18柱、HLB柱預活化(依次通過3 mL甲醇、3 mL水),取1 mL樣液上樣,然后用2 mL水洗滌,最后目標物分別通過3 mL乙腈(1 mL/L TFA)、乙腈(2 mL/L TFA)、乙腈(10 mL/L TFA)、甲醇、甲醇(5%氨水)、甲醇(10%氨水)、甲醇(20%氨水)進行洗脫,而后氮吹干燥,并復溶于流動相中,通過0.22 μm濾膜過濾后按照1.2.1方法進行HPLC檢測。

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 結合型吡咯素 稱取2 mg蛋白質當量樣品,加入硼酸鈉緩沖液(0.5 mol/L,pH9.2,500 μL)混合后至緩沖液濃度為0.2 mol/L。加入硼氫化鈉溶液(0.5 mol/L,0.1 mol/L NaOH配制,17.5 μL)后至硼氫化鈉溶液濃度為0.1 mol/L后,樣品在4 ℃下還原10 h后,加入60% TCA至TCA最終濃度為20%,7000×g離心10 min,蛋白質沉降后用丙酮洗滌2次,并分別加入1 mL 的1、3、6 mol/L HCl、1、3、6 mol/L HAc,在110 ℃條件下水解24 h,然后氮吹干燥,將干燥的蛋白質水解物復溶于1 mL高純水中[13-14]。

1.2.4.2 游離型吡咯素 稱取2 mg蛋白質當量的樣品,加入無水甲醇至甲醇最終濃度為75%,7000×g離心10 min后,將上清液通過固相萃取柱。

1.3 數據處理

所有數據取平行實驗的平均值(n=3),采用SPSS16.0,Excel軟件進行ANOVA方差分析。

2 結果與分析

2.1 流速的選擇

實驗研究了在梯度洗脫條件下,不同的流速對洗脫效果的影響。結果如圖1所示,隨著流速的增加,吡咯素的出峰時間提前,流速為1.200 mL/min 時的出峰時間最早,為21.332 min,其次是流速為1.000 mL/min,其出峰時間為21.690 min。出峰時間早可以節約流動相,并節省時間,但流速過大可能會損壞色譜柱,縮短泵和色譜柱的使用壽命,因此最佳流速設定為1.000 mL/min(n=3)，此時的色譜圖見圖2。

圖1 不同流速對出峰時間的影響Fig.1 Effects of different rates on the peak time

圖2 流速為1.000 mL/min時的色譜圖Fig.2 The spectrum of pyrraline underthe rate of 1.000 mL/min

2.2 線性方程、相關系數、檢出限

在最佳分離條件下,分別以不同濃度的標準溶液進樣,以峰面積對摩爾濃度繪制標準曲線,如圖3所示,回歸方程為y=4.55×109x-4140.41,相關系數為R2=0.9999,表明在5×10-7～2×10-3mol/L濃度范圍內吡咯素標準品的濃度和峰面積呈現良好的線性關系。此檢測條件下的檢出限為5×10-7mol/L(S/N=3),相對標準偏差0.78%～7.51%。

圖3 吡咯素標準曲線Fig.3 The standard curve of pyrraline

2.3 固相萃取洗脫液的優化

通過實驗,比較了7種洗脫液對吡咯素的洗脫效果,結果發現,不同的洗脫液對吡咯素有不同的洗脫能力,回收率范圍在38.6%～96.3%,見圖4。其中,甲醇-氨水的洗脫效果較好,均在94%以上,而乙腈-TFA組的回收率均<90%,可能是HLB固相萃取柱是由N-乙烯吡咯烷酮和親脂性的二乙烯基苯聚合而成,氨水中和了吡咯素結合的質子,使其變為中性,從而破壞了吡咯素與吸附劑間的庫侖力,而甲醇破壞了吡咯素與吸附劑上疏水基團之間的非極性相互作用,使吡咯素易被洗脫,因此,本實驗選擇甲醇(5%氨水)作為洗脫液,其回收率最高,為96.3%(n=3)。

圖4 洗脫液對吡咯素回收率的影響Fig.4 Influence of elution on the recoveries of pyrraline注:A.乙腈(1‰ TFA);B.乙腈(2‰ TFA);C.乙腈(1% TFA);D.甲醇;E.甲醇(5%氨水);F.甲醇(10%氨水);G.甲醇(20%氨水)。

2.4 固相萃取柱的選擇

由于食品中的吡咯素含量較低,且存在大量干擾物質,故HPLC法很難直接檢測吡咯素,因此有必要將食品組分進行固相萃取預除雜和富集[16],上樣液為1 mL,洗滌液為2 mL水,洗脫液為3 mL甲醇(5%氨水)。結果如圖5所示,HLB固相萃取柱的回收率最高,為75%,可能是由于HLB固相萃取柱的填料是親水-親脂聚合物,在較寬的pH范圍內具有較好的萃取效果[17],其次是PCX柱,為69.39%,而C18柱的凈化效果最低,為13.99%,且當C18柱中的液體流干時會嚴重降低洗脫效果[17],故后續實驗選擇HLB柱檢測實際樣品(n=3)。

圖5 固相萃取柱對吡咯素回收率的影響Fig.5 Influence of SPE columns on the recoveries of pyrraline

2.5 酸水解的優化

由表1可知,隨著酸濃度增加,檢測到吡咯素含量增加,即蛋白質的水解程度增加,這是由于酸濃度增加,即溶液中氫離子濃度增加,蛋白質酰胺鍵被切斷的可能性增大,因此檢測到的吡咯素含量增加[18],當用6 mol/L HCl進行水解時,吡咯素含量最高,故后續實驗選擇6 mol/L HCl水解實際樣品(n=3)。

表1 不同條件下酸水解后食品中的結合型吡咯素含量

2.6 實際樣品檢測

2.6.1 結合型吡咯素 利用HLB固相萃取柱和高效液相色譜儀,按照1.2.4.1的方法對8種樣品中的結合型吡咯素進行了檢測,由圖6可知,出峰時間為21.654 min的峰為吡咯素。由表2可知,6種樣品中檢測到了結合型吡咯素,不同樣品中的吡咯素含量有較大的差異,其中全脂奶粉中的蛋白質含量較高,其與還原糖發生美拉德反應生成的結合型吡咯素含量較高,分別達到了141.90 μg/g奶粉、131.73 μg/g奶粉,而牛奶中結合型吡咯素含量較少,分別為11.53 mL/L牛奶、12.49 mL/L牛奶,不同的加熱溫度、加熱時間使得產品生產加工過程中美拉德反應的程度不同,因而晚期糖基化終末產物的生成量不同,致使吡咯素的含量有較大差異(n=3)。

圖6 全脂奶粉2的色譜圖Fig.6 The spectrum of whole milk powder 2

表2 固相萃取結合HPLC法測定食品中的結合型吡咯素含量

2.6.2 游離型吡咯素 利用HLB固相萃取柱和高效液相色譜儀,按照1.2.4.2的方法對8種樣品中的游離型吡咯素進行了檢測,結果見表3。由表3可知,奶粉和牛奶中未檢測到吡咯素,而咖啡和醬油中均含有吡咯素,是因為奶粉和牛奶中含有較多的蛋白質,與還原糖發生美拉德反應,生成的結合型吡咯素含量較高,而游離氨基酸較少,故未檢測到游離型吡咯素;而醬油加工過程中豆粕酸解產生了游離氨基酸[19-20],以及咖啡豆中的風味前體物質氨基酸,在高溫烘焙過程中參與了美拉德反應[21],與還原糖反應形成了晚期糖基化終末產物所致,其中絲滑拿鐵咖啡中游離型吡咯素含量最高,其次是老抽醬油(n=3)。

表3 固相萃取結合HPLC法測定食品中的游離型吡咯素含量

3 結論

食品基質非常復雜,其中的痕量吡咯素難以準確定量,本研究優化了固相萃取的分離條件和高效液相色譜的分離條件,建立了固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中的痕量吡咯素,在5×10-7～2×10-3mol/L濃度范圍內呈現良好的線性關系,檢出限為5×10-7mol/L(S/N=3),相對標準偏差為0.78%～7.51%。該方法可對吡咯素進行預富集、凈化和除雜,有效地縮短了檢測時間,操作簡便,靈敏度高,重復性好,可作為快速檢測食品中痕量吡咯素的方法,并為監管部門提供吡咯素的檢測依據,有一定的應用價值。

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Determination of trace pyrraline in food samples using solid- phase extraction and high performance liquid chromatography

LIU Hui-lin,MU Lin,CHEN Xiao-mo,WANG Jing*

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China)

A solid phase extraction-high performance liquid chromatography for determination of pyrraline in food was established. Pyrraline was extracted from food material by a HLB-SPE column and analyzed by high performance liquid chromatography. Results showed that a good linear range from 5×10-7to 2×10-3mol/L with correlation coefficient of 0.9999 was obtained. The relative standard deviation were 0.78%～7.51%.The limit of detection was 5×10-7mol/L(S/N=3). The discussed method was simple and accurate and could be applied to the detection of trace pyrraline in food.

high performance liquid chromatography;solid phase extraction;pyrraline;detection

2016-05-06

劉慧琳(1987-)，女，博士，講師，研究方向：食品安全檢測，E-mail：liuhuilin@btbu.edu.cn。

*通訊作者:王靜(1976-)，女，博士，教授，研究方向：食品營養與安全，E-mail：wangjing@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學基金(31501559,31571940)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)22-0090-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.009