豬瘟膠體金免疫快速檢測技術研究進展

■文/濱州貝爾凱瑞生物技術有限公司 梅建國 莊金秋

山東省濱州畜牧獸醫研究院 張 穎 馬 力 李 峰

豬瘟膠體金免疫快速檢測技術研究進展

■文/濱州貝爾凱瑞生物技術有限公司 梅建國 莊金秋

山東省濱州畜牧獸醫研究院 張 穎 馬 力 李 峰

豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種嚴重危害養豬業的毀滅性傳染病。膠體金免疫技術是一種新型免疫學檢測技術，具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強、無需特殊儀器等優點，在豬瘟的快速診斷中得到了廣泛應用，顯示出了良好的應用前景。本文概述了膠體金免疫技術在豬瘟抗原及抗體快速檢測上的應用研究進展，以期為豬瘟的有效防控提供參考。

豬瘟；豬瘟病毒；膠體金免疫技術；檢測

豬瘟 (Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種嚴重危害養豬業的毀滅性傳染病。加強CSFV檢測技術的研究對預防和控制本病具有重要的現實意義。膠體金免疫技術是在膠體金標記技術、免疫檢測技術基礎上發展起來的一種新型免疫學檢測技術，目前在動物醫學檢測方面主要有斑點免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay，DIGFA)和膠體金免疫層析技術(Gold immunochromatography assay，GICA)。這兩種檢測方法均具有操作簡便、快速、無污染、不需要特殊儀器、特異性強、敏感性高、結果判斷直觀等優點[1]。膠體金免疫技術在豬瘟疫病快速診斷、大批量檢測、大面積普查等領域得到了廣泛應用，受到了基層獸醫人員的青睞，具有巨大的發展潛力和廣闊的應用前景[2]。本文概述了膠體金免疫技術在豬瘟抗原及抗體快速檢測上的應用研究進展，以期為豬瘟的有效防控提供參考。

1 膠體金免疫技術原理

膠體金免疫技術是繼20世紀80年代三大標記技術(熒光素、放射性同位素和酶)后發展起來的一種新型標記技術。該技術以膠體金為標記物，利用抗原抗體的特異性反應，對抗原(或抗體)物質進行定性、半定量乃至定量研究的一種新型體外快速免疫學檢測技術[3]。

2 基于膠體金免疫技術的豬瘟檢測方法

2.1 豬瘟抗原檢測

陳龍賓等[4](2007)采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金，選擇15nm膠體金標記兔抗CSFV多克隆抗體，對膠體金標記抗體采用低溫超速離心法進行純化，在硝酸纖維素膜的不同位置分別包被羊抗兔IgG(質控線)和兔抗CSFV多抗IgG(檢測線)，研制出可檢測CSFV的免疫層析試紙條。應用該法及直接豬瘟熒光抗體試驗、RT-PCR試驗同時對豬瘟可疑病料進行檢測，陽性檢出率分別為36.4%、45.5%和72.7%，雖然陽性檢出率較后兩者低，但該法操作簡便、耗時短，可用于豬瘟的流行病學調查，更易于在基層推廣和應用。張長弓等[5](2007)應用膠體金標記技術與免疫層析技術相結合，在玻璃纖維膜、硝酸纖維膜的檢測線(T)和對照線(C)上分別噴上膠體金與CSFV單克隆抗體(Ab2)的偶聯物、Ab2和羊抗鼠IgG多克隆抗體，制成檢測CSFV的膠體金快速檢測試紙。用該試紙檢測豬瘟弱毒活疫苗和豬瘟脾淋弱毒苗均顯陽性，而對豬源性的其他病毒、細菌抗原均顯陰性。楊明等[6](2010)采用檸檬酸鈉還原法制備膠體顆粒，用膠體金標記CSFV特異性單克隆抗體，將純化的CSFV抗體和羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維膜上作為檢測線和質控線，研制檢測CSFV的快速診斷試紙條。用該試紙條檢測了70份臨床待檢樣品，與病毒分離鑒定的的符合率為92.8%。付連軍等[7](2011)采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金，選擇15nm膠體金標記兔抗CSFV純化后的多抗，組裝免疫層析試紙條，用試紙條和熒光抗體試驗同時對8份豬瘟可疑病料進行檢測，陽性符合率為83%。張露露[8](2012)釆用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記純化的抗CSFV E0單克隆抗體E01作為捕捉抗體，將純化的抗CSFV E0單克隆抗體E02和羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質控線，制備了雙抗夾心法CSFV膠體金免疫層析試紙條，可檢測出純化的CSFV，并有明顯顯色。

2.2 豬瘟抗體檢測

斑點免疫金滲濾法微量、特異、敏感可靠、檢測時間短、效果直觀，非常適用于豬瘟的早期診斷、普查及疫苗免疫后抗體水平的檢測[9]?？追钡碌萚10](2003)以CSFV包被硝酸纖維素膜，通過膠體金標記金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)直接顯色，陽性者出現紅色斑點，建立了檢測CSFV抗體的斑點免疫金滲濾法。整個試驗過程僅需5min，操作簡單。應用該方法與Dot-ELISA、間接血凝試驗(IHA)同時對200份豬血清樣品進行檢測，與二者的符合率分別達98.4%和98.9%。王榮等[11](2009)在單重斑點免疫金滲濾法的基礎上，將提純的CSFV和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原同時包被在硝酸纖維膜上，利用膠體金標記SPA顯色，建立了能同時檢測CSFV和PRRSV兩種抗體的雙重斑點免疫金滲濾法，特異性高、重復性好，大大提高了檢測效率。陳善真等[12](2014)利用人工篩選合成的CSFV多肽和PRRSV多肽葡聚糖偶聯物作為包被抗原，以多肽-Biotin-鏈霉親和素作為膠體金標記物，羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質控帶，建立了一種同時檢測CSFV和PRRSV抗體的雙抗原夾心膠體金免疫層析方法。與IDEXX ELISA試劑盒平行檢測CSFV抗體總體符合率為86.36%；PRRSV抗體總體符合率為83.33%。本方法的建立可為多肽抗原在畜禽疾病診斷方面的應用奠定基礎。由于CSFV分離、培養、純化較困難，用基因工程技術來體外重組表達CSFV保護性抗原基因的E2蛋白，用該蛋白或其單抗做金標抗原或抗體，可避免純化病毒的麻煩。王麗等[13](2009)利用基因工程方法將CSFV C株Erns和E2基因主要抗原域連接后，在原核表達系統中表達，獲得嵌合蛋白CnC2，將純化后的嵌合蛋白進行膠體金標記，并在硝酸纖維膜上包被抗CnC2單克隆抗體，建立了檢測豬瘟抗體的免疫層析試紙條，敏感性和特異性分別高達97%和100%，非常適合豬瘟抗體滴度的臨床檢測和調查。尹梅[14](2013)將CSFV重組E2蛋白標記膠體金作為捕捉抗原，純化CSFV E2蛋白和兔抗E2多克隆抗體包被在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上，建立了檢測CSFV抗體的雙抗原夾心膠體金免疫層析試紙條方法。應用該試紙條和IDEXX ELISA檢測試劑盒，分別檢測來自江蘇太湖和浦口的共計80份血清樣品，兩種檢測方法的符合率為90.3%，取得了理想的檢測效果。

2.3 豬瘟強、弱毒鑒別檢測

CSFV E2蛋白能刺激動物機體產生中和抗體，在不同毒株間高度保守，是CSFV最重要的保護性抗原，可用于建立豬瘟血清學檢測方法。劉暢等[15](2005)、鄭鳴等[16](2006)、王慧杰等[17](2007)、李華瑋等[18](2012)先后以豬瘟兔化弱毒E2基因表達后的純化蛋白為弱毒抗原，以PK-15細胞培養純化后的豬瘟病毒強毒為強毒抗原進行膠體金標記，運用雙抗原夾心法建立了能區分豬瘟強、弱毒的檢測豬瘟抗體的免疫層析試紙條方法。夏照和[19](2008)采用環磷酰胺免疫抑制法，用純化的桿狀病毒表達的豬瘟疫苗株(HCLV株)E2蛋白作為耐受原，石門株E2蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得抗E2蛋白單克隆抗體。該單克隆抗體可以用于鑒別豬瘟野毒株和豬瘟兔化弱毒疫苗株，為研究豬瘟強毒和弱毒之間的分子差異奠定了基礎。王向鵬等[20](2010)利用CSFV E2蛋白的單克隆抗體為捕捉抗體，建立了快速、簡便的檢測CSFV野毒的膠體金免疫層析方法。其檢出病毒培養物的最低檢測限為103.5TCID50，具有良好的特異性、敏感性和重復性，初步達到了區分檢測CSFV野毒株和弱毒株的目的。彭伍平等[21](2007)利用桿狀病毒表達了CSFV石門株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白，以石門株E2蛋白為免疫原免疫小鼠，制備了一株抗CSFV石門株E2蛋白的單抗(McAb)6E10，該單抗與兔化弱毒疫苗株不反應。王向鵬[22](2010)在此基礎上又以純化的McAb 6E10標記膠體金顆粒，研制出快速、簡便檢測CSFV野毒的膠體金免疫層析試紙條，達到了區分檢測CSFV野毒株和弱毒株的目的。

3 豬瘟膠體金免疫技術與其他檢測方法的比較

3.1 豬瘟抗原檢測

王向鵬等[23](2010)系統比較了檢測CSFV的6種方法，結果表明RT-qPCR、RT-LAMP和RT-PCR由于其靈敏性高，可作為首選檢測方法，但操作時需要避免假陽性的出現；病毒分離雖然操作繁瑣，但結果準確，是確診豬瘟必不可少的檢測方法；抗原捕捉ELISA和膠體金試紙條檢測時間較短，但敏感性較低。張艷英等[24](2013)應用RT-nPCR、熒光抗體法、膠體金免疫層析試紙條3種方法，分別對30份疑似豬瘟病料中的CSFV進行檢測。結果RT-nPCR方法檢出陽性樣品11份，熒光抗體法13份，膠體金免疫層析試紙條8份；3種方法檢測全為陽性8份，全為陰性17份。結果表明，RT-nPCR具有快速、敏感等優點，但需一定儀器設備及成熟的方法；熒光抗體法所需時間較短，但需要經驗豐富人員判定結果，且存在假陽性結果，敏感性較差；膠體金免疫層析試紙條方法最大的優點就是簡便快速，且適合基層的應用，不足之處就是敏感性較低。

3.2 豬瘟抗體檢測

金顏輝等[25](2004)用金標免疫層析技術檢測30份豬瘟標準陽性血清和18份標準陰性血清，結果陽性、陰性符合率均為100%。同時采用GICA、間接ELISA、Dot-ELISA、IHA平行檢測205份血清樣品，間接ELISA陽性率86.8%、GICA陽性率85.4%、Dot-ELISA陽性率81.5%、IHA陽性率58.5%。向林遠等[26](2012)用GICA和ELISA平行檢測豬血清抗體滴度，二者符合率為86.6%，用GICA檢測豬瘟抗體滴度存在一定程度的漏檢率及誤診率，只能初步篩查豬瘟抗體，GICA篩查陰性的豬血樣應再用ELISA法復檢以防漏檢。邢東義等[27](2014)對西藏林芝地區某縣采集的92個疑似豬瘟樣品應用膠體金免疫層析法與ELISA法檢測豬瘟抗體和抗原，結果表明，豬瘟膠體金法抗原和抗體檢測陽性符合率為100%，ELISA法檢測的陽性符合率為95%以上。宋忠旭等[28](2015)也進行了膠體金免疫層析試紙條與ELISA檢測豬瘟抗體的比對試驗。結果膠體金免疫層析試紙條檢測豬瘟抗體陽性檢出率94.69%，ELISA法檢測豬瘟抗體合格率95.58%，兩者符合率為99.07%。這兩種方法操作方便、快速，適合于臨床快速檢測和疫病普查中高通量樣品的篩查。

4 小結與展望

豬瘟的檢測方法較多，主要包括病毒分離鑒定、分子生物學及血清學方法。各種檢測方法均具有有一定的優缺點和局限性，各實驗室和廣大養殖戶可根據自身條件選擇一種或多種方法聯合應用[29]。膠體金免疫技術具有簡便、快速、特異、靈敏等優點，特別適合廣大基層獸醫人員進行大批量樣品檢測和大面積動物疫病普查等應用，是當前豬瘟檢測方法中簡單、快速、敏感的免疫學檢測技術之一，具有廣闊的應用前景和巨大的發展潛力[30]。相信隨著免疫學技術的不斷發展、豬瘟病毒研究的不斷深入及膠體金免疫技術的不斷完善，豬瘟膠體金免疫技術將不斷走向成熟，逐漸實現抗原抗體的多元、定量或半定量檢測?！?/p>

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