尼羅羅非魚補體C9基因的克隆和組織表達分析

胡欣欣，曹建萌，盧邁新，陳 瓊，陳昆平

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州 510380；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

尼羅羅非魚補體C9基因的克隆和組織表達分析

胡欣欣1,2，曹建萌1，盧邁新1，陳 瓊1,2，陳昆平1,2

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州 510380；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

為了探究補體C9在尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)免疫中發揮的作用，本研究克隆并分析了尼羅羅非魚補體C9基因(OnC9)。結果顯示：OnC9的cDNA序列全長2 502 bp，包含1 761 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼586個氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明，OnC9與牙鲆(Paralichthysolivaceus)補體C9氨基酸相似性最高，達73.0%，與其他魚類補體C9的相似性介于49.3%～71.4%之間。實時熒光定量PCR檢測結果表明，OnC9基因在所檢測的各個組織或器官中表達水平有明顯差異，在肝臟中表達量最高，其次是腸道、后腎、皮膚、肌肉、鰓，在腦、脾臟、心臟、頭腎、胸腺和血液中表達量最低。在無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)感染魚體后，肝臟、后腎等組織中OnC9表達量表現為在感染12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出現三個峰值的波動表達的規律。說明OnC9在無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚后的免疫應答中發揮作用。

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)；補體C9；無乳鏈球菌；組織表達分析

補體系統(Complement System)是由一組可溶性蛋白、膜結合性蛋白和補體受體組成的蛋白反應系統，是一個高度復雜的免疫防御系統，具有誘導炎癥反應，介導病原體的溶解與吞噬、免疫復合體的溶解等關鍵作用[1-3]。在魚類中，補體激活途徑有三種：經典途徑(Classical complement pathway，CCP)、凝集素途徑(Lectin complement pathway，LCP)、旁路途徑(Alternative complement pathway，ACP)[4-5]。這三種途徑活化后，機體都將產生膜攻擊復合體(Membrane attack complex，MAC)[6]。MAC是由C5b、C6、C7、C8和12-18個C9分子組成的兩性成孔結構，可聚合在靶細胞表面，通過增加其通透性，導致靶細胞死亡，是補體介導細胞死亡的一種重要機制[7-8]。已有研究表明，天然單體補體C9作為單鏈糖蛋白可直接造成靶細胞的裂解，是介導MAC在靶細胞表面組裝的重要分子[9]。據報道，從人血清中提取的補體C9，即使在沒有其它補體組分的情況下，也能快速地引起細菌的完全死亡[10]。近年來，在草魚(Ctenopharyngodonidella)[11]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[12]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[13]等中已有補體C9基因的研究報道。而補體C9作為介導靶細胞凋亡的重要組分，在尼羅羅非魚中還沒有相關研究。

羅非魚，屬鱸形目(Perciformes)鱺魚科(Cichlidae)，是我國淡水魚類養殖優勢品種，但近年來鏈球菌病嚴重制約了羅非魚產業的可持續發展。當前認為，進行抗鏈球菌病羅非魚新品種的定向選育和應用疫苗對該病進行免疫預防是解決羅非魚鏈球菌病的兩種可行的方法[14]。而上述工作都依賴于對羅非魚免疫基因和免疫機制的系統的研究。本研究選擇尼羅羅非魚免疫相關基因補體C9 (OnC9)為對象，既克隆了OnC9全長cDNA序列，又應用實時熒光定量PCR (Real-time Quantitative PCR，qPCR)技術分析其在健康魚不同組織中的表達情況，也了解無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)感染之后OnC9基因表達的變化，旨在探究OnC9在羅非魚免疫中的功能，為后續研究疫苗發揮免疫預防功能的分子機理、開發該基因潛在的抗鏈球菌病相關分子標記奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗所用尼羅羅非魚8.5日齡胚胎和幼魚均取于中國水產科學研究院珠江水產研究所高要養殖實驗基地。幼魚平均體質量為45 g，于實驗室暫養一周后，解剖4尾健康尼羅羅非魚，收集腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液等組織樣本，放入1.5 mL RNase-free凍存管中，液氮凍存，備用。

SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit和Advantage?2 PCR Enzyme System購于Clontech公司。2×EasyTaq?PCR SuperMix、總RNA提取試劑Trizol Reagent試劑盒、All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit、TransStart?Top Green qPCR SuperMix購于北京全式金生物技術有限公司；PrimeScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit、E.coliDH5α、pMT19-T Vecter、反轉錄RNA PCR Kit購于TaKaRa；用于瓊脂糖凝膠回收的試劑盒購于Omega公司。TIANgel Purification Kit購于天根生化科技有限公司。同時，本實驗的引物合成、測序都是由廣州艾基生物工程有限公司完成。

1.2 感染實驗

實驗前進行無乳鏈球菌感染羅非魚實驗，確定半致死濃度。具體實驗過程如下：隨機取尼羅羅非魚150尾，平均分為5組，每組30尾(4個實驗組，1個對照組)。37 ℃條件下培養無乳鏈球菌12 h，濃度經測定為0.99×109CFU/mL。然后用磷酸鹽緩沖液將其濃度稀釋到104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL。實驗組每尾魚腹腔注射200 μL，對照組注射等體積磷酸鹽緩沖液。病魚呈現打轉，不規則游動等非正常狀態。7 d天之后，預驗結果為：104CFU/mL組死亡2尾，105CFU/mL組死亡12尾，106CFU/mL組死亡26尾和107CFU/mL組死亡29尾，經計算確定105CFU/mL為該批次實驗的半致死濃度。

取健康尼羅羅非魚160尾，平均分到5個100 L水族箱中，一箱用作對照組，剩余用作實驗組。實驗組腹腔注射無乳鏈球菌(105CFU/mL)200 μL，對照組注射等體積的PBS緩沖液。細菌感染0、4、8、12、24、36、48、72、120、168 h，分別取4尾尼羅羅非魚的肝臟、腸道、后腎、皮膚、肌肉、鰓放入1.5 mL RNase-free凍存管中，液氮凍存，備用。

1.3 RNA提取和反轉錄

根據總RNA提取試劑Trizol Reagent試劑盒的操作說明，提取8.5日齡胚胎總RNA和幼魚各組織RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的提取效果，并用核酸蛋白定量儀(Bio-Rad Smartspic plus)檢測RNA純度和完整性。制備8.5日齡尼羅羅非魚cDNA，按照PrimeScriptTMII 1st strand cDNA合成試劑盒(TaKaRa)說明書進行操作；RACE-Ready cDNA的制備，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)說明書進行操作。qPCR cDNA的制備，按照All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit(全式金)說明書進行操作。實驗所用PCR引物見表1。

表1 尼羅羅非魚OnC9基因克隆和組織表達所用引物Tab.1 Primers used for amplifying cDNA and analyzing expression for the OnC9 gene in O. niloticus

以尼羅羅非魚補體C9的預測序列(登錄號：XM-003449649.2)為模板，用Primer 5.0軟件設計一對引物C9-f和C9-r，以8.5日齡的尼羅羅非魚總cDNA為模板擴增OnC9 cDNA的中間片段。PCR反應體系為：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O 11 μL，Total 25 μL。擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR結束之后，其反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用TIANgel Purification Kit回收純化目的片段，把純化的目的片段與載體pMD-19T連接，連接產物轉入E.coliDH5α感受態細胞中，均勻涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板上，37 ℃條件下過夜培養，挑取單克隆經PCR檢測后獲得陽性克隆，送到廣州艾基生物技術有限公司進行測序。

根據已獲得的中間片段，設計上游5’RACE引物C9-5’RACE-T、C9-5’RACE-N和下游3RACE引物C9-3RACE-1T、C9-3RACE-1N、C9-3RACE-2T、C9-3RACE-2N，與SMARTer試劑盒中自帶的通用引物UPM和NUPM，通過巢式PCR擴增OnC9基因的3端和5’端。反應條件：PCR擴增程序1：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增程序2：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃延伸3 min，25個循環；72 ℃延伸10 min。結束之后，其產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增產物的純化、連接、陽性克隆檢測和測序與中間片段克隆的步驟相同。

1.5 生物信息學分析

使用NCBI網站的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)軟件對測序后所得序列進行同源性檢索，用DNAMAN軟件進行序列拼接，得到全長cDNA序列。利用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在線確定開放閱讀框并預測氨基酸序列；ExPASy網站的ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的分子質量、等電點；SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析蛋白的信號肽；TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對蛋白進行跨膜區域預測；利用PSORT (http://psort.hgc.jp/)進行蛋白亞細胞定位；SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析蛋白結構；ExPASy網站的PROSITE (http://prosite.expasy.org/prosite.html)在線預測氨基酸功能域。

使用軟件clustalX進行氨基酸的多序列比較，DNASTAR中的MegAlign比較不同物種同源基因的相似性。MEGA 5.1軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ法)構建系統進化樹。

1.6 OnC9基因組織表達分析

根據已克隆得到的OnC9 cDNA序列，設計qPCR引物，將4尾健康尼羅羅非魚的12個健康組織(腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液)和無乳鏈球菌感染后的6個相關組織的RNA反轉錄成cDNA，以反轉錄成的cDNA為模板進行qPCR。同時，根據已克隆出的OnC9 cDNA序列設計特異性引物C9-q，以EF-1α為內參基因進行qPCR，反應體系為：10 μL 2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix，引物各0.4 μL，passive Reference Dye(50×) 0.4 μL，ddH20 7.8 μL，cDNA模板1.0 μL。反應程序為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。qPCR反應在ABI Stepone plus熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)上進行，每個待測cDNA樣品設置三個重復。qPCR數據分析采用相對定量2-ΔΔCt法，用SPSS 20軟件對數據進行單因子方差分析(One-Way ANOVA)，用Duncan多重比較進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 OnC9 cDNA克隆和序列分析

結果序列包含1 761 bp的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼586個氨基酸，5’非翻譯區(Untranslated region，UTR)長133 bp，3UTR長608 bp。在3UTR區出現1個mRNA不穩定性信號ATTTA和1個多聚腺苷酸加尾信號AATAAA(圖1)。使用ProtParam分析OnC9前體蛋白的理化性質，推測其分子式為C2787H4413N813O895S44，分子質量是65.04 ku，等電點(pI)為5.99，半衰期是30 h，不穩定指數是39.86，屬于穩定蛋白。親水性平均指數是-0.557，屬于親水性蛋白。經SignalP 4.1 Server在線分析可知，OnC9蛋白第1～27個氨基酸是信號肽，27～28氨基酸之間為可能的剪切位點。經TMHMM在線預測可知，該蛋白586個氨基酸全部位于膜外，屬分泌蛋白。PSORT分析結果也證實OnC9蛋白主要在胞外(胞外82%、溶酶體19%、內質網20%)。

OnC9存在血小板反應素1(Thrombospondin 1，TSP1)結構域、低密度脂蛋白受體A(LDL-receptor class A， LDLRA)結構域、膜攻擊復合物/穿孔素(Membrane attack complex/perforin，MACPF)結構域和表皮生長因子(Epidermal growth factor-like domain，EGF-Like)結構域。TSP1結構域對應的氨基酸區段為：38～88和546～582；LDLRA結構域對應的氨基酸區段為：94～130；MACPF結構域對應的氨基酸區段為：275～487；EGF-Like結構域對應的氨基酸區段為491～524。另外，使用PROSITE軟件搜索到OnC9還存在其它一些推斷的蛋白位點：13個N端豆蔻?；稽cG[^EDRKHPFYW]-x{2-[STAGCN][^P]位于G14、G64、G67、G315、G325、G366、G369、G416、G500、G535、G544、G557、G570，13個酪蛋白激酶II磷酸化位點[ST]-x{2}-[DE] (aa45～48、74～77、96～99、124～127、199～202、237～240、254～257、264～267、334～337、355～358、438～441、445～448、455～458)。10個蛋白激酶C磷酸化位點[ST]-x-[RK] (aa53～55、130～132、233～235、287～289、348～350、355～357、393～395、412～414、423～425、525～527)等。另外還存在1個酰胺化位點x-G[RK][RK] (aa557～560)和一個細胞黏著序列RGD (aa577～579)。

2.2 同源比較和系統進化分析

使用DNASTAR中的MegAlign軟件將OnC9氨基酸序列和已報道的序列進行同源性分析，OnC9與牙鲆(序列登陸號：BAA86878)、紅鰭東方鲀(Fugurubripes，AAC60288)、底鳉(Fundulusheteroclitus，AAR87007)、虹鱒(CAJ01692)、香魚(Plecoglossusaltivelis，CBX31962)、草魚(ABN49522)、人(Homosapiens，NP-001728)、小鼠(Musmusculus，NP-038513)、牛(Bostaurus，NP-001030441)、家兔(Oryctolaguscuniculus，NP-001075815)、爪蟾(Xenopuslaevis，NP-001079814)等物種的補體C9的氨基酸序列同源性分別為：73.0%、71.4%、63.9%、57.9%、54.3%、49.3%、38.3%、38.2%、41.9%、39.3%、40.6%。

圖1 尼羅羅非魚OnC9基因cDNA全序列及推測氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA and deduced amino acid sequences of the C9 gene in O.niloticus數字代表該行末核苷酸位點，加粗數字代表該行末氨基酸位點，橢圓標識起始密碼子和終止密碼子，粗斜體標示多聚腺苷酸加尾信號，粗體字為poly(A)，大括號標示N-糖基化位點，下劃線標示為cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，波浪線標示為蛋白信號肽，雙下劃線所示為LDLRA信號序列，方框所示為MACPF信號序列，灰色陰影表示EGF信號序列。

利用MEGA 5.1軟件對OnC9氨基酸序列與其他物種的補體C9氨基酸序列進行鄰接聚類分析(圖2)。在系統進化樹中，尼羅羅非魚首先與牙鲆、紅鰭東方鲀聚類，然后與虹鱒、底鳉、香魚、草魚等聚為一簇；人和哺乳動物聚為一支，而兩棲類的非洲爪蟾單獨為一支，位于前面兩大分支的中間。

圖2 尼羅羅非魚補體C9基因和其它動物的NJ分子進化樹Fig.2 NJ-phylogenetic tree of C9 genes constructed by using amino acid sequences

對尼羅羅非魚和其它脊椎動物進行氨基酸多重序列比對，結果顯示參與比對的脊椎動物都具有TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Like結構域，哺乳動物僅N端存在一個TSP1結構域，魚類和兩棲類的補體C9氨基酸序列在C端和N端各存在一個TSP1結構域，哺乳動物C端不存在TSP1結構域(圖3)。

圖3 魚類、兩棲類和哺乳動物補體C9 C末端序列比對Fig.3 Multiple alignment of C-terminal amino acid sequences of fish, amphibians and mammalian C9

2.3 OnC9基因在健康尼羅羅非魚不同組織中的表達分析

qPCR檢測結果表明，OnC9基因在所檢測的12個組織器官(腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液)中表達水平有明顯差異。OnC9在肝臟中表達量最高，其次是腸道、后腎、鰓、皮膚，在肌肉中表達量比較低，腦、脾臟、心臟、頭腎、胸腺和血液中表達量最低。

圖4 尼羅羅非魚補體C9基因在不同組織中的表達分析Fig.4 Tissue distribution of the OnC9 gene in O. niloticus相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2.4 感染無乳鏈球菌后OnC9基因表達變化分析

尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后，不同時段下肝臟、腸道、后腎、肌肉等組織的OnC9表達變化如圖5所示。

圖5 無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚補體C9 基因在尼羅羅非魚中各組織的表達情況Fig.5 Quantitative expression profile of O. niloticus C9 gene after the challenge with Streptococcus agalactiae

3 討論

3.1 OnC9序列結構及同源性分析

本研究克隆得到的5’UTR和3UTR序列比預測序列更長更完整。相似性分析顯示，克隆得到的序列與預測序列相似性為99%。在本研究中，OnC9同樣存在TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Like結構域；與其它硬骨魚類一樣，OnC9具有兩個TSP1結構域，在氨基酸序列C端比哺乳動物多一個TSP1結構域。MAC中的C6，C7，C8α，C8β同樣存在重復的TSP1結構域，所以從分子結構方面來說，OnC9的氨基酸序列與被廣泛接受的其他物種的補體C9推導序列非常相似[11-13]。

NJ系統進化樹顯示，OnC9氨基酸序列與魚類的相似性為49.3%～73.0%，與哺乳類的相似性為38.2%～41.9%，與兩棲類補體C9的相似性為40.6%。同進化樹顯示結果一樣，OnC9與魚類有較高的同源性，可進一步確定得到的序列為補體C9氨基酸序列。同時，在系統進化樹中，尼羅羅非魚首先與牙鲆(鰈形目)、紅鰭東方鲀(鲀形目)聚類，然后與虹鱒(鮭形目)、草魚(鯉形目)等聚為一簇，這與傳統分類觀點一致，即鯉形目的魚類是最先從魚類祖先中進化出去的，然后是鮭形目種類，而鲀形目和鰈形目魚類則被認為是種類眾多的、較為高等的鱸形目中進化出來的[15]。

3.2 OnC9組織表達特征

在哺乳動物中，肝臟是大多數補體成分的主要產生部位[16-17]。補體C9在硬骨魚中的表達模式也類似。在草魚中，補體C9在肝臟的表達量最高，其次是脾、頭腎等[11]；條石鯛(Oplegnathusfasciatus)補體C9在肝臟的表達量最高，其次是血液和腦[18]；鮸(Miichthysmiiuy) 補體C9在肝臟中表達量非常高，其次是眼睛[15]。健康尼羅羅非魚補體C9在后腎、肝臟、鰓、肌肉、皮膚、腸道中均有表達，主要在肝臟中表達，在腸道、后腎、鰓、肌肉、皮膚中有少量表達。本實驗同其它魚類補體C9熒光定量實驗結果一樣：補體C9在肝臟的表達量最高，這同時也驗證了肝臟是合成補體的主要器官[17-19]。另外，條石鯛和尼羅羅非魚同屬鱸魚目，條石鯛補體C9在肝臟的表達量最高，其次是血液和腦，OnC9表達其次是腸道和后腎，這可能由于檢測的補體C9基因屬于兩個亞型。

無乳鏈球菌是危害羅非魚的主要病原之一。因此，亟需對無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚的免疫反應進行研究。本研究表明，無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚168 h內，肝臟、腸道、后腎、皮膚、肌肉、鰓中的OnC9表達量均表現為在感染后12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出現三個峰值的波動式表達的規律，這與趙雪錦[20]在“粉玉”體色甌江彩鯉中的發現一致。此外，孟繁星[15]對鮸注射鰻弧菌(Vibrioanguillarum)后，補體C9的表達同樣呈現波動式表達的規律。qPCR結果表明無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚可有效誘導肝臟中OnC9的表達。同“粉玉”體色甌江彩鯉、鮸等一樣，在尼羅羅非魚中，相對于其它組織，OnC9在肝臟中的表達是非常高的，這表明OnC9和大多數補體成分一樣，屬于急性期蛋白(acute phase protein，APP)[16, 21]。動物體內APP具有多種結構和功能，并且它們在炎癥反應中促進組織修復和再生，從而使機體回復到內穩態[22]。

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(責任編輯：張瀟峮)

Cloning and expression analysis of complement 9 gene in Oreochromis niloticus

HU Xin-xin1,2, CAO Jian-meng1, LU Mai-xin1, CHEN Qiong1,2, CHEN Kun-ping1,2

( 1.KeyLab.ofTropical&SubtropicalFisheryResourceApplication&Cultivation,MinistryofAgriculture,PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510380,China; 2.CollegeofFisheries&Life,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

As a member of the complement system, complement 9 (C9) plays a key role in forming the pore-like membrane attack complex (MAC) of complement on target cells, which has the function of pore forming and is the effective component leading to cell lysis. In the present study, a full-length C9 (OnC9) cDNA ofOreochromisniloticus was 2 502 bp, containing 1 761 bp open reading frame, encoding 586 amino acids. The deduced amino acid sequence ofOnC9 shared 73.0% similarity with PoC9 (ParalichthysolivaceusC9), and 49.3%-71.4% identity with the C9 of other teleosts. Real-time quantitative PCR (qPCR) analysis demonstrated that the expression level ofOnC9 in different tissues ofO.niloticuswas significantly different, and the highest level was detected in the liver; the lower level was detected in intestine, kidney, gills, skin and muscle and the lowest level was detected in brain, spleen, heart, head kidney, thymus and blood. The expression ofOnC9 in liver, kidney and the other tissues appeared three peaks fluctuating at 12 hours, 48 (or 36) hours and 120 hours after infection ofStreptococcusagalactiae. The results suggested thatOnC9 may play an important role in tilapia immune response of anti-bacteria.

Oreochromisniloticus; C9;Streptococcusagalactiae; expression analysis

2016-04-18；

2016-09-06

現代農業產業技術體系專項資金(CARS-49)；國家自然科學基金(31502205)；廣東省自然科學基金(2014A030310337)

胡欣欣(1991- )，女，碩士，專業方向為羅非魚遺傳育種。E-mail:15139794169@163.com

盧邁新。E-mail: mx-lu@163.com

S917

A

1000-6907-(2017)01-0003-09