團頭魴Toll樣受體II基因的克隆與表達分析

李 潔，王 虹，周 洋，馬潔樂，劉小玲，林 蠡

(華中農業大學水產學院水生動物醫學系，農業部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070)

團頭魴Toll樣受體II基因的克隆與表達分析

李 潔，王 虹，周 洋，馬潔樂，劉小玲，林 蠡

(華中農業大學水產學院水生動物醫學系，農業部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070)

為了研究團頭魴(Megalobramaamblycephala)TLR2(maTLR2)在抗嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染中的作用，本實驗克隆了maTLR2基因的cDNA全長。結果顯示：maTLR2基因cDNA的全長包括2923 bp，編碼792個氨基酸。預測得到的maTLR2的結構域包括一個信號肽、氨基端的亮氨酸重復基序(LRRs)、跨膜結構域(TM)和一個胞內的Toll/白介素(IL)-1受體區(TIR)。在嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴頭腎中，TLR2的表達量在6 h時顯著升高。TLR2下游相關的炎癥細胞因子TNF-α的表達量也顯著上調。結果表明maTLR2在嗜水氣單胞菌感染團頭魴后的免疫應答中起到了重要作用。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)；Toll樣受體II ；表達

先天性免疫系統是宿主防御的古老形式，是無脊椎動物和脊椎動物機體抵抗入侵病原微生物的有效防線[1]。在水生環境中，魚類保護自己免受各種病原微生物侵入的主要方式是通過先天或特異性免疫進行的[2]。模式識別受體(pattern recognition receptors ，PRRs)是先天性免疫的重要組成部分。PRRs識別病原體中病原體相關分子模式，觸發信號通路，激活免疫細胞以應對病原體感染[3]。

Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)家族是PRRs中的一類[4]。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白，包括三個部分，即一個胞外氨基端亮氨酸重復基序，一個跨膜區，以及一個胞內羧基端Toll/IL-1受體區(TIR)。胞外的LRRs是多變的，但是TIR結構域卻高度保守[5]。TLRs在識別病原體相關模式分子之后，下游信號的轉導主要是通過TLRs的TIR與下游接頭分子的特異性結合，從而將信號轉導至下游途經。TLR信號途徑大致可分為兩種：與炎癥因子產生相關的髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)-依賴和與干擾素產生相關的MyD88-非依賴的途徑。大部分的TLRs成員是依賴于MyD88信號途徑轉導信號的[6]， TLR4是同時擁有兩個信號途徑的TLR。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)隸屬于氣單胞菌科(Aermonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭氏陰性短桿菌，其廣泛分布于自然界的各類水體、土壤和水生動物[7]。嗜水氣單胞菌分為致病性和非致病性菌株。致病性菌株可引起多種淡水養殖品種急性出血性敗血癥，并導致魚類大量死亡[8]。嗜水氣單胞菌可感染草魚(Ctenopharyngodonidellus)[9]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[10]、鯽(Carassiusauratus)[11]、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]、黃顙魚(Pelteobogrusfulvidraco)[13]等養殖品種。團頭魴作為我國淡水養殖系統中重要的一種鯉科魚類，因其肉質鮮美，深受廣大消費者的青睞，具有很高的經濟價值。然而，細菌性疾病會導致大量的團頭魴死亡，從而給團頭魴養殖造成極大損失。而嗜水氣單胞菌感染就是引起團頭魴細菌性疾病的一種。本研究通過研究團頭魴在嗜水氣單胞菌感染后，先天性免疫相關的基因TLR2以及其下游相關的炎癥細胞因子TNF-α的表達變化，從而探究其免疫防御機制。這為更深一步了解細菌感染后，團頭魴抵御病原侵害時先天性免疫發揮的作用具有重要意義。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

實驗團頭魴(體重100 g)購自湖北百榮水產良種有限公司，在華中農業大學水產基地淡水循環養殖系統中(水溫25～26 ℃)暫養。實驗前，暫養兩周。嗜水氣單胞菌由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取

取30～50 mg的團頭魴頭腎，加入Trizol試劑，充分研磨至勻漿液呈無顆粒透明狀。采用RNAiso Plus試劑盒(TAKARA)，用微量核酸測定儀NanoDrop 2000測定RNA樣品的濃度及在260 nm與280 nm處吸光值。cDNA 合成按照Takara公司PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒(TAKARA)說明書進行操作。

1.2.2 團頭魴TLR2基因cDNA片段的克隆

由于團頭魴與草魚的親緣關系近，所以本實驗先參照草魚TLR2(ACT68333.1)克隆出團頭魴TLR2的一段核心片段。根據核心片段的序列設計引物進行5′-RACE和3′-RACE，根據3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase和5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒(TAKARA)操作步驟，以團頭魴頭腎cDNA為模板進行套式PCR，得到團頭魴TLR2的cDNA全長。

1.2.3 生物信息學分析

cDNA序列使用NCBI BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行同源性分析，使用ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進行開放閱讀框的尋找，使用ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白分子量及等電點的預測，使用Prosite (http://prosite.expasy.org/prosite.html)預測其蛋白結構域預測分析，使用Signal P (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測序列信號肽，使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測跨膜結構域。使用Mega6程序進行序列比對。系統進化樹用MEGA6構建，重復1 000次。

1.2.4 細菌感染團頭魴后頭腎中TLR2和TNF-α的表達變化

感染實驗參照Wang等[10]的方法。將健康團頭魴48尾隨機平均分為2組，實驗組腹腔注射100 μL嗜水氣單胞菌懸液(3×107CFU/mL)，對照組注射等量的0.65%生理鹽水。在注射后0、6、9、12、24和48 h取樣，每個時間點每組分別取3尾魚解剖，取頭腎組織，立即投入液氮中保存，后轉入-80 ℃冰箱保存用于組織RNA提取。Trizol裂解組織后，提取樣品總RNA，反轉錄得到cDNA以備熒光定量實驗所用?；虮磉_的定量分析通過羅氏公司的480熒光定量PCR儀完成，95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。每個樣品設定3組重復，PCR反應結束后,分析其溶解曲線確保反應的特異性，β-actin作為內參。數據以Cp值輸出，相對定量分析釆用2-ΔΔCP法。SPSS 16.0軟件進行統計分析，P<0.05差異顯著。

2 結果

2.1 maTLR2基因cDNA全長及序列特征

PCR擴增得到的產物經過純化、連接轉化、測序之后，得到的序列片段經過DNAstar軟件拼接后，除去重疊序列和接頭序列，最后得到團頭魴TLR2的cDNA全長序列(所用引物見表1)。如圖1和圖2所示，maTLR2的cDNA全長為2 923 bp，其中開放閱讀框為2 379 bp，5′非編碼區為174 bp，3′非編碼區為370 bp，編碼792個氨基酸。使用EXPASY ProtParam網站預測分析蛋白質的理化性質，推測maTLR2蛋白的分子質量是90.21 KDa，等電點7.07。使用TMHMM預測出maTLR2的跨膜結構域在585～607 AA。使用Signal P預測出maTLR2的信號肽在1～22。使用EXPASY網站預測出maTLR2擁有9個LRR，一個TIR區。

表1 本實驗所用引物

Tab.1 Primers used in these experiments

引物名稱序列(5'→3')引物用途TF1(forward)GTCTCCCACCCTGAAACTCTGCT核心片段1擴增TF1(reverse)GTATCCATGCTTTAGTCATCTGC核心片段1擴增TF2(forward)CTTGGCCTTGACCTGTCTTT核心片段2擴增TF2(reverse)AGCAGAGTTTCAGGGTGGGAGAC核心片段2擴增5'TR1(reverse)TTACCGAATCTACCCGAGTG5'RACE5'TR2(reverse)TATGTGTTCCTCCGTAAGTTTAGAGTTGC5'RACE5'RACEOuterPrimerCATGGCTACATGCTGACAGCCTA5'RACE5'RACEInnerPrimerCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG5'RACE3'TF1(forward)TTTATGGAACTGCCACAGGGGGAA3'RACE3'TF2(forward)TGTGCTCCTGCGAGTTTGTATCTTTCTTC3'RACE3'RACEOuterPrimerTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3'RACE3'RACEInnerPrimerCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3'RACETLR2-qF(forward)GTCCCATCGGTTTAGTCTqRT-PCRTLR2-qR(reverse)TAGTCCCACCTTCTTTCGqRT-PCRβ-actinF(forward)ACCCACACCGTGCCCATCTAqRT-PCRβ-actinR(reverse)CGGACAATTTCTCTTTCGGCTGqRT-PCRIL-1βF(forward)GTGCCAGGTGCCAAGTAGCqRT-PCRIL-1β-R(reverse)AAGCCCAAGATATGCAGGAGTqRT-PCRTNF-αF(forward)CCGCTGCTGTCTGCTTCAqRT-PCRTNF-αR(reverse)GCCTGGTCCTGGTTCACTCTqRT-PCR

圖1 團頭魴TLR2核苷酸對應氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of maTLR2

起止密碼子用加粗字體表示，*代表的是終止密碼子。波浪線：信號肽(Signal P)；灰色：LRR(亮氨酸重復基序)；方框：TM(跨膜結構域)；雙下劃線：TIR(Toll/IL-1 受體區)。mRNA不穩定基序(ATTTA)用下劃線表示。

圖2 團頭魴TLR2結構預測圖Fig.2 The diagram of TLR2 of M.amblycephala

2.2 maTLR2基因同源性及系統進化分析

為了得到maTLR2的進化信息，分別從NCBI數據庫中選取20種TLR2的蛋白序列，其中包括11種魚類TLR2的蛋白序列，1種鳥類的蛋白序列，8種哺乳動物的蛋白序列，并將其進行BLAST分析，表2顯示同源性分析及進化樹分析所用物種的蛋白名稱、序列登錄號及比對結果。由進化樹可看出，團頭魴與鯉、鯽、印度鯪、草魚和斑馬魚聚為鯉形目的一簇，其中團頭魴TLR2與草魚TLR2的親緣關系最近。12種魚類TLR2組成了硬骨魚類的分支，同時與鳥類和哺乳動物聚為脊椎動物分支(圖3)，這與傳統分類學相匹配。

2.3 maTLR2及TNF-α在嗜水氣單胞菌的感染后的表達變化

采用Real time PCR檢測在嗜水氣單胞菌攻毒后，團頭魴免疫相關組織頭腎中maTLR2基因在mRNA水平上的表達變化。在處理后的6、9、12、24和48 h取樣分析。β-actin作為內參基因。每個實驗樣本至少有三個重復。實驗數據均為平均值±標準差顯示。星號顯示的與對照組的顯著性差異(P<0.05)。誤差線顯示的標準差。團頭魴頭腎中，TLR2的表達變化趨勢如圖4所示。在頭腎中，TLR2在6 h時出現峰值，急劇上升至對照組的2.68倍(P<0.05)，之后迅速恢復到注射前的水平。大體上來說就是在嗜水氣單胞菌注射團頭魴后，頭腎中maTLR2的瞬時表達量顯著升高。

細菌感染通常會引起機體的炎癥反應，為獲得關于團頭魴機體中細胞因子的信息，本實驗也檢測了團頭魴頭腎中TNF-α的表達變化。如圖4所示，TNF-α的表達模式與maTLR2的相似，大體符合單峰型的表達模式。即在感染后的6 h表達量迅速上升，達到對照組的2.14倍(P<0.05)，然后顯著降低。

表2 TLR2蛋白序列同源性和進化樹所用物種蛋白及序列登錄號

Tab.2 Species,protein and accession number of TLR2 used in the homologous and phylogenetic analysis,andthe amino acid sequence identities between maTLR2 and other organisms.

物種蛋白名稱Genbank登錄號氨基酸長度/aaE值同源性/%CtenopharyngodonidellaTLR2ACT68333.17860.094CyprinuscarpioTLR2ACP20793.17880.089LabeorohitaTLR2ADQ74644.17920.086CarassiuscarassiusTLR2AGO57934.17910.087DaniorerioTLR2NP-997977.17880.081IctaluruspunctatusTLR2AEI59663.17900.064OncorhynchusmykissTLR2CCK73195.18060.050EpinepheluscoioidesTLR2AEB32453.18210.047ParalichthysolivaceusTLR2BAD01044.18180.046TakifugurubripesTLR2AAW69370.18100.045TrematomusbernacchiiTLR2ACT64128.18040.049GallusgallusTLR2BAB16113.27930.041RattusnorvegicusTLR2NP-942064.17840.041OryctolaguscuniculusTLR2NP-001076250.17840.041SusscrofaTLR2ACZ82293.17850.041MusmusculusTLR2EDL15415.17840.041CanislupusfamiliarisTLR2BAD42423.17850.042PantroglodytesTLR2BAG55022.17840.042HomosapiensTLR2AAH33756.17840.042BostaurusTLR2ALL55248.17840.042

圖4 嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴頭腎中TLR2 (A)和TNF-α (B)在mRNA水平的表達變化Fig.4 Relative expression of maTLR2 (A) and TNF-α (B) at the mRNA level in head kidney after A.hydrophila infection

3 討論

Toll樣受體識別細菌、真菌、原生動物的組成部分，并引起炎癥反應，在模式識別受體中扮演重要角色。本實驗克隆了團頭魴的TLR2的cDNA全長序列，由預測結構域可看出，團頭魴TLR2符合TLRs的結構特征，即含有一個信號肽、多個LRR、一個跨膜結構域、一個TIR區。由于頭腎是魚類重要的免疫器官，所以本實驗在細菌刺激后，檢測了團頭魴頭腎中TLR2的表達變化。在嗜水氣單胞菌刺激團頭魴后，團頭魴TLR2 在頭腎中的瞬時表達量顯著升高，同時檢測了典型的炎癥細胞因子TNF-α的表達變化。由結果可看出，TNF-α的瞬時表達量也同時顯著升高。本實驗說明TLR2在嗜水氣單胞菌感染團頭魴時起到了免疫調節作用。

TLR胞外的LRR段呈馬蹄形，可以形成同型或異型二聚體，如TLR1/TLR2、TLR2/TLR6、TLR3/TLR3或TLR4/TLR4[14]。TLR2識別細菌、真菌和病毒的多種成分。TLR2是通過與TLR1或者TLR6形成二聚體來識別配體的[5,15]。也有研究證明了TLR2可以和受體相互影響以發揮作用。Good等[16]證明了，脂多糖誘導TLR4信號途徑時需要TLR2的參與。Xaplanteri等[17]研究發現在綠膿桿菌刺激下，MR與TLR2協同作用激活促炎性反應。Tachado等[18]的研究說明在巨噬細胞中，肺孢子蟲介導的IL-8的釋放是要通過MR和TLR2的共表達。這些都說明了TLR2在識別病原微生物時，是與多種受體相互影響著起作用的。TLR2識別嗜水氣單胞菌的機理需要進行更進一步的研究。MR在識別病原菌和介導機體先天免疫應答過程中具有重要作用[19]，本實驗室已經證明了在嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴和草魚的MR都參與了機體抗細菌感染的免疫反應[10]，且團頭魴MR對細菌的識別依賴于鈣離子[20]。本實驗對于TNF-α的釋放同maTLR2-MR-NF-κB之間是否存在聯系還不清楚，其具體的分子機理還需深入研究。

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(責任編輯：張瀟峮)

Cloning and expression of Toll-like receptor 2 in Megalobrama amblycephala

LI Jie,WANG Hong,ZHOU Yang,MA Jie-le,LIU Xiao-ling,LIN Li

(DepartmentofAquaticAnimalMedicines,CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity/KeyLabofFreshwaterAnimalBreeding,MinistryofAgriculture,Wuhan430070,China)

In this study,in order to clarify the function of TLR2 inMegalobramaamblycephala(maTLR2) during the infection ofAeromonashydrophila,we clonedmaTLR2,and analyzed the expression change ofmaTLR2 during the bacterial infection.The full-length cDNA ofmaTLR2 contained 2923 bp encoding a putative protein of 792 amino acid.The predicted amino acid sequences showed thatmaTLR2 contained a signal peptide,N-terminal leucine-rich repeats (LRRs),a trans-membrane region (TM) and a cytoplasmic toll/interleukin (IL)-1R homology (TIR) domain.Temporal expression ofmaTLR2 mRNA transcripts in head kidney ofM.amblycephalawas significantly increased at 6h after the infection ofA.hydrophila.TLR2 downstream related molecular TNF-α also up-regulated.These finding suggested thatmaTLR2 is a critical part in the immune responses ofA.hydrophilainfection.

Megalobramaamblycephala;Toll-like receptor 2;expression

2016-04-11；

2016-08-08

湖北省科技支撐計劃(2015BBA228；YSF2015000255)

李 潔(1989- )，女，碩士，專業方向為魚類病害與免疫研究。E-mail:li1005@hotmail.com

劉小玲。E-mail:liuxl@mail.hzau.edu.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)01-0022-08