福瑞鯉對氨氮脅迫的生理響應

李利紅，袁宏利

(山西省水產科學研究所，太原 030006)

福瑞鯉對氨氮脅迫的生理響應

李利紅，袁宏利

(山西省水產科學研究所，太原 030006)

以福瑞鯉(Cyprinuscarpio)為材料，研究不同濃度氨氮(0、10、20和30 mg/L)處理對幼魚鰓組織中抗氧化系統和Na+/K+-ATP酶活力的影響。結果顯示，氨氮脅迫6 h誘導H2O2含量、總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性迅速顯著升高，并在脅迫24 h時達到最高水平。脅迫96 h后，各處理組H2O2含量、SOD 活性和總抗氧化能力均低于對照組水平，MDA含量顯著增加。氨氮脅迫后，Na+/K+-ATP酶基因轉錄水平和蛋白活性呈先降低后升高又降低的變化趨勢，參與脅迫過程中滲透壓的調控。研究結果表明，低濃度氨氮脅迫后，福瑞鯉鰓組織通過調節細胞抗氧化能力，提高Na+/K+-ATP酶活性，有效改善魚體的抗氨氮脅迫能力，但是高濃度氨氮脅迫對鰓組織造成氧化損傷。

福瑞鯉(Cyprinuscarpio)；氨氮；鰓組織；Na+/K+-ATP酶；抗氧化能力

近年來，在規?；s化水產養殖中，高放養密度和高投飼率使得水體中的殘餌、肥料和生物排泄物等不斷增多，經氨化作用產生大量的氨氮，成為目前水產養殖中影響魚類的主要脅迫因子之一[1-2]。養殖水體中的氨氮濃度經常會在短時間內急劇升高，通過魚鰓進入體內，使魚體的鰓、腎和肝組織結構發生病變、免疫力下降，生長、發育受阻，甚至導致死亡，嚴重影響水產品的產量和品質[3-4]。目前，國內外進行了許多關于氨氮脅迫對水生動物影響的研究。據報道，氨氮脅迫處理尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)后，造成組織中蛋白質氧化和膜脂過氧化，導致肝功能衰竭，非特異性免疫防御系統遭到破壞[5]。然而，氨氮脅迫對魚體鰓組織抗氧化系統影響的研究甚少。

福瑞鯉(FFRC strain common carp，Cyprinuscarpio)是2011年由建鯉和野生黃河鯉雜交獲得的鯉新品種，具有生長速度快、體型好、餌料轉化率高、適應能力強和遺傳性狀穩定等特點，是農業部“十二五”主推的大宗淡水養殖魚類之一[6]。本試驗以福瑞鯉為材料，研究氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織抗氧化系統和Na+/K+-ATP酶活性的影響，探討氨氮對魚類的毒性機理以及福瑞鯉對養殖水體環境變化的適應性，旨在為淡水魚類健康養殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用福瑞鯉幼魚購自長治沁縣漁場，體質量(50.00±0.16)g。試驗前室內暫養2周，日投食2次。養魚用水為曝氣自來水，水溫(25±1)℃，pH 7.5±0.3，用充氧機連續充氣以保證溶解氧含量以上，正式實驗前停食24 h。

1.2 染毒實驗

魚類染毒采用靜態水質接觸染毒法。通過預實驗，在確定福瑞鯉幼魚96 h 氨氮半致死濃度(25 ℃，T-AN:35.6 mg/L)的基礎上，設置1個對照組(0 mg/L)和3處理組(總氨氮T-AN=10 、20 和30 mg/L)，每個處理設3個平行組。用氯化銨(NH4Cl)配制各實驗組總氨氮濃度100 L，隨機放入健康活潑的福瑞鯉20尾。實驗期間每天定時換水，采用萘氏試劑法測定并調整總氨氮濃度。

1.3 樣品采集與分析

在染毒 6、24、48 和96 h后，各實驗組隨機取福瑞鯉3尾，分別用自來水、蒸餾水沖洗后迅速解剖。取新鮮的第2鰓弓上的鰓絲，用生理鹽水潤洗，濾紙吸干水分。準確稱量組織質量，按質量體積比制成10%的組織勻漿，4 ℃下3 500 r/min離心10 min，取上清液待用。Na+/K+-ATP酶活性、H2O2含量、SOD活性、總抗氧化力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，測定方法及單位參照試劑盒說明書。

數據為3個平行組的平均值±標準差(mean±SD)，用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比較分析處理組與對照組間的差異顯著性，取*P<0.05為差異顯著，**P< 0.01為差異極顯著。

1.4 RNA提取和Real-time PCR分析

取對照組和20 mg/L處理組染毒 6、24、48 和96 h后福瑞鯉幼魚第2鰓弓上的鰓絲，利用TaKaRa RNAiso Reagent提取總RNA。以總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)合成cDNA。根據建鯉Na+/K+-ATP酶基因序列，設計Na+/K+-ATP酶α1和β1引物對分別為ATPα1FG、ATPα1RG和ATPβ1FG、ATPβ1RG。以β-actin基因作內參，引物對為Neican F和Neican R(表1)。利用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行Real-time PCR分析，反應采用Applied Biosystems 7500 Real time PCR儀。每個樣品重復三次，使用2-ΔΔCt計算方法，各組間比較采用獨立樣品t檢驗，P< 0.05 時差異顯著。

表1 Na+/K+-ATPα1和β1基因Real-time PCR所用引物

Tab.1 The primers used by Na+/K+-ATPase α1and β1 genes

引物序列ATPα1FG5'-GTGGGCCGATTTGATCATTTGC-3'ATPα1RG5'-CCTGGGCTGCGTCGAATGATAAG-3'ATPβ1FG5'-GCACAGGCAGCAGTTGGTTCAAG-3'ATPβ1RG5'-CGTATTATCGCTCATGGAGAAGCTGATC-3'NeicanF5'-GTTGTCAGCAATGCCTCCTGC-3'NeicanR5'-ACTGGCACCGCGACCATC-3'

2 結果

2.1 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織H2O2含量的影響

氨氮脅迫后，福瑞鯉幼魚鰓組織H2O2含量呈上升趨勢(圖1)。氨氮脅迫6 h時，鰓組織H2O2含量迅速升高。脅迫24 h后，各脅迫組H2O2含量呈濃度依賴性增高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。之后，隨著氨氮脅迫時間的延長，鰓組織H2O2含量增幅降低。氨氮脅迫96 h后，僅10 mg/L組與對照組差異顯著(P<0.05)，其它各組均恢復至對照組水平。

2.2 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織抗氧化能力的影響

氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織T-AOC和SOD活性產生顯著影響(圖2)。 氨氮脅迫6 h時，鰓組織T-AOC迅速增加。脅迫24 h后，各脅迫組T-AOC達到最大，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。之后，隨著氨氮脅迫時間的延長，鰓組織T-AOC仍顯著高于對照組，但增幅降低。氨氮脅迫96 h后，各脅迫組T-AOC均低于對照組，20 mg/L脅迫組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。氨氮脅迫6 h時，鰓組織SOD活性迅速提高至最大，10 mg/L和20 mg/L脅迫組與對照組差異極顯著(P<0.01)，30 mg/L脅迫組與對照組差異顯著(P<0.05)。隨著氨氮脅迫時間的延長，鰓組織SOD活性增幅降低。脅迫48 h后，30 mg/L脅迫組顯著降低(P<0.05)，其余各組與對照組相比無顯著差異。

氨氮脅迫后福瑞鯉鰓組織MDA含量呈時間和濃度依賴性提高(圖2)。脅迫6 h后，鰓組織MDA含量呈濃度依賴性增加，但與對照組間無顯著差異。脅迫24 h時，30 mg/L脅迫組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，而其他各組差異不顯著。48 h時，20 mg/L和30 mg/L脅迫組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)。脅迫96 h后，各脅迫組MDA含量均達到最大峰值，10 mg/L和20 mg/L脅迫組與對照組差異顯著(P<0.05)，30 mg/L脅迫組與對照組差異極顯著(P<0.01)。

圖1 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織H2O2含量的影響Fig.1 Effects of ammonia exposure on H2O2 content in the gill of C.carpio

圖2 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of ammonia exposure on antioxidative capacity in the gill of C.carpio

2.3 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織Na+/K+-ATP酶基因轉錄和蛋白活性的影響

福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶基因轉錄和蛋白活性水平在氨氮脅迫過程中發生明顯改變(圖3)。氨氮脅迫6 h時，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達無明顯變化。之后，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達量隨著脅迫時間的延長逐漸升高，Na+/K+-ATP酶α1基因在脅迫48 h 時達到最大。Na+/K+-ATP酶β1基因表達變化較Na+/K+-ATP酶α1基因更為明顯，脅迫24 h即達到最大，脅迫48 h時仍顯著增高。氨氮脅迫96 h后，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達量迅速下降，Na+/K+-ATP酶β1基因轉錄水平顯著降低。

氨氮脅迫6 h時，鰓組織Na+/K+-ATP酶活性迅速下降，但脅迫組與對照之間無顯著差異。之后，隨著氨氮脅迫時間的延長，鰓組織Na+/K+-ATP酶活性呈濃度依賴性增高，在脅迫48 h后，Na+/K+-ATP酶活性達到最大，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。氨氮脅迫96 h時，鰓組織Na+/K+-ATP酶活性回落，但除30 mg/L組顯著降低外(P<0.05)，其余各組與對照組相比無顯著差異。

圖3 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶的影響Fig.3 Effects of ammonia exposure on Na+/K+-ATPase in the gill of C.carpio

3 討論

水體中高濃度氨氮會阻斷魚體內氨的排泄，使血液和組織中氨氮的含量上升。同時，環境中氨通過鰓上皮滲入魚體內，對魚體細胞產生一系列毒害作用[7]。當受到環境脅迫時，魚體細胞內產生大量的活性氧，使蛋白質、核酸、膜脂等生物大分子結構損傷、功能異常，導致細胞生理活動紊亂，引起細胞凋亡等[8-9]。生物體內存在一套完整的抗氧化防御系統，包括抗氧化物質和抗氧化酶等，可以清除胞內過量的活性氧，從而維持相對的動態平衡[10-11]。研究表明，氨氮脅迫誘導青魚、羅非魚和凡濱濱對蝦出現氧化應激，過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽含量等發生改變[7，11]。本研究中，氨氮脅迫初期，福瑞鯉幼魚鰓組織內產生大量的H2O2，SOD活性和T-AOC迅速增高，MDA含量較低，說明氨氮脅迫后福瑞鯉幼魚鰓組織中抗氧化能力提高，有效清除脅迫產生的活性氧，維持細胞正常的生理功能。但隨著氨氮脅迫時間的延長，胞內過量的活性氧不能及時清除，從而造成組織細胞損傷，SOD活性降低，MDA含量顯著增加。MDA是膜脂過氧化的產物，可間接反映細胞的損傷程度，同時又可與蛋白質的游離氨基作用，引起蛋白質分子內和分子間的交聯，進一步導致細胞損傷[12]。這預示著隨著氨氮脅迫時間的延長，福瑞鯉鰓組織脂質過氧化反應增強，細胞抗氧化酶活性降低，從而引起細胞生理活動紊亂。

Na+/K+-ATP 酶是生物膜上存在的一種蛋白酶，由一個α亞基和一個β亞基組成[13]。據報道，許多環境因素如鹽度、重金屬及臭氧等都可影響到鰓組織Na+/K+-ATP酶活性[14]。研究結果表明，氨氮脅迫后，福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達量產生明顯影響，且基因轉錄水平的變化與氨氮脅迫濃度相關，這為從分子水平上闡明脅迫過程中的滲透調節機制奠定了基礎。Na+/K+-ATP 酶活性先下降后升高，最后又回到對照水平。氨氮脅迫初期，環境中高濃度氨氮滲入魚體細胞，使得Na+/K+-ATP 酶蛋白結構改變而導致酶活力下降。之后，鰓主動滲透調節機制被激活，Na+/K+-ATP 酶活性提高。最后，由于鰓組織中積累了大量的活性氧，脂質過氧化產物破壞Na+/K+-ATP 酶結構，導致酶活力降低[7,15]。

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(責任編輯：陳細華)

Physiological response of FFRC strain common carp to ammonia stress

LI Li-hong,YUAN Hong-li

(FisherySciencesResearchInstituteofShanxiProvince,Taiyuan030006,China)

The effects of ammonia-N on antioxidant system and Na+/K+-ATPase were studied in the gill of FFRC strain common carp (CyprinuscarpioL.).The carp were transferred off the freshwater and exposed to different ammonia-N levels (0,10,20 and 30 mg/L),and each ammonia-N level was randomly triplicate and sampled at 0,6,24,48 and 96 h,respectively.The results showed that with the concentration of ammonia-N increased,the H2O2content,total antioxidant capacity (T-AOC) and superoxide dismutase (SOD) activity enhanced significantly at first 6 h and reached the maximun after 24 h exposure.Then,the H2O2content,SOD activity and T-AOC decreased,and MDA content increased significantly in all ammonia-N treatment group after 96 h exposure.The gene expression level of Na+/K+-ATPaseα1 and Na+/K+-ATPaseβ1 increased at 24 h,and then decreased to be lower than that of control group after 96 h exposure.Meanwhile,Na+/K+-ATPase activities decreased at first 6 h,and then increased gradually and reached the maximum at 48 h,showing the induction of Na+/K+-ATPase in response to ammonia-N stress.These results indicated that ammonia-N stress induced changes in antioxidant system and Na+/K+-ATPase level,which play a key role in preventing ammonia-N damage in gill cells.

carp;ammonia stress;gill;Na+/K+-ATPase;antioxidant system

2016-03-31；

2016-05-24

山西省青年科技研究基金(2013021022-5)

李利紅(1982- )，女，博士，工程師，主要從事魚類生態毒理學研究。E-mail:lihongli19821129@163.com

S965.89

A

1000-6907-(2017)01-0097-04