葡萄酒蘋果酸—乳酸發酵高耐受性優良植物乳桿菌直投式發酵劑的優化

張莉+段浩云+田洪濤

摘要：從葡萄酒二次發酵液中篩選的優良植物乳桿菌L42為研究對象，對菌株L42的高效直投式發酵劑進行研制。利用單因素試驗和正交試驗對菌株L42最佳增殖培養基、離心條件、凍干保護劑進行優化，得到植物乳桿菌L42最佳廉價培養基為番茄汁基礎培養基、0.2% K2HPO4、0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖，培養后活菌數可達到57.8億CFU/mL，與番茄汁基礎培養基相比提高了8.41倍；最佳離心條件為6 000 r/min、10 min，離心后活菌數收得率可達99.37%；最佳凍干保護劑的配方為10%脫脂乳、10%海藻糖、1.5%谷氨酸鈉、1%吐溫80、0.5%酵母浸粉，凍干存活率為89.01%；凍干后的植物乳桿菌L42在11%乙醇度、130 mg/L SO2、pH值3.0的環境下能夠正常增殖，將獲得的直投式發酵劑于4 ℃下保存11個月后活菌數仍可達到10億CFU/mL。

關鍵詞：葡萄酒；植物乳桿菌；離心濃縮；凍干保護劑；直投式發酵劑

中圖分類號： TS201.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0167-04

蘋果酸-乳酸發酵（MLF）是乳酸菌以雙羧基L-蘋果酸為反應底物，在蘋果酸-乳酸酶的作用下，轉變成單羧基的 L-乳酸和二氧化碳的過程[1-2]。經MLF作用后，果酒中的蘋果酸被分解為乳酸而達到降低酸度作用；同時乳酸菌代謝活動還可以改變果酒中的酯類、醛類、氨基酸、有機酸和維生素等微量成分的含量以及呈香物質的濃度，有利于形成酒體風味復雜性[3-4]。當葡萄酒酸度較高時，釀造出的葡萄酒口感較酸澀，須要進行MLF改善其風味[5]。

直投式發酵劑（directed vet set starters，DVS Starters）是高度濃縮和標準化的冷凍干燥發酵微生物菌種，因使用時不須要活化和擴培處理而受到發酵行業的廣泛歡迎。目前，直投式發酵劑在歐美等發達國家得到了廣泛應用[6-7]，在葡萄酒生產中得到普遍應用，而國內該領域的相關研究和應用均較少。筆者已經從自然發酵的葡萄酒中篩選得到對乙醇度、SO2濃度、pH值具有高耐受性的植物乳桿菌L42，本研究旨在通過單因素和正交試驗對植物乳桿菌L42的復合增殖培養基、最適離心條件及凍干保護劑進行優化，確定適合葡萄酒二次發酵的優良植物乳桿菌高效直投式發酵劑研制參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源 菌種為植物乳桿菌L42，由筆者所在實驗室從自然發酵的葡萄酒中分離篩選所得。

1.1.2 培養基 （1）復原脫脂乳培養基的制備。脫脂奶粉加蒸餾水制成14%復原脫脂乳液，調節pH值為6.5，0.07 MPa 滅菌10 min冷卻后備用。

（2）MRS培養基。牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉 5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸二胺2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫80 1 mL/L、磷酸氫二鉀 2 g/L 配制固體培養基時另添加1.8%瓊脂，培養基均在 115 ℃ 下滅菌20 min。

（3）番茄汁培養基。番茄汁制備工藝為：新鮮番茄、清洗、熱燙（90～95 ℃，3～5 min）、榨汁→過濾（100目濾布）、調pH值至6.0，0.07 MPa滅菌30 min備用。

（4）白菜汁培養基。白菜汁制備工藝為：選取無破損、無霉爛、無蟲蛀的新鮮白菜清水洗凈、瀝干→搗碎、打漿→過濾（100目濾布）、調pH值至6.0，0.07 MPa滅菌30 min備用。

（5）胡蘿卜汁培養基。胡蘿卜汁制備工藝為胡蘿卜、洗凈、去皮及根梢、稱質量、切片→煮沸（料 ∶水=1 g ∶4 mL，100 ℃，5 min）→榨汁→過濾（100目濾布）→定容（1 kg胡蘿卜生產5 L汁定義為100%胡蘿卜汁）、調pH值至6.0、0.07 MPa 滅菌30 min備用。

1.1.3 儀器與設備 酸度計，PHS-3C，上海理達儀器廠；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫療器械有限公司；JA5002型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；BCD-210C華意冰箱，中國華意電冰箱制造廠；離心機、凍干機。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 菌種分別經140 g/L復原脫脂乳液體培養基、液體MRS培養基活化，備用。

1.2.2 廉價增殖培養基的優化

1.2.2.1 基礎培養基的確定 將活化菌株按1%接菌量分別接種于番茄汁、胡蘿卜汁、白菜汁基礎培養基中，37 ℃培養24 h，每2 h取樣，測定D600 nm值，確定最佳收獲期，37 ℃恒溫培養至最佳收獲期，采用平皿菌落計數法確定最佳基礎培養基。

1.2.2.2 增殖因子的篩選 在所選的基礎培養基中添加 0.2% 磷酸氫二鉀的基礎上分別添加1%大豆蛋白胨、1%胰蛋白胨、1%蛋白胨、1%牛肉膏、0.5%酵母膏、2%乳糖、2%葡萄糖、2%蔗糖、0.5%玉米漿，制成不同增殖培養基，通過活菌數及結果差異顯著性比較確定較優營養因子。

1.2.2.3 增殖復合培養基的確定 在單因素試驗基礎上采用正交試驗設計，以活菌數為評價指標，以L9（34）正交表（表1）進行試驗設計，篩選出增殖復合培養基。

1.2.3 乳酸菌濃縮分離技術 植物乳桿菌L42經液體MRS培養基活化，分別以1%（活菌數約0.01億CFU/mL）接種于番茄汁復合增殖培養基中，37 ℃恒溫培養至對數生長末期，分別采用不同離心力、離心時間濃縮分離菌體細胞，檢測不同離心條件下離心前初始活菌數和離心后上清液活菌數、沉淀的活菌數，計算離心損失率、離心存活率、離心收得率，以尋求獲得最高菌體收得率的離心條件。離心損失率、離心存活率、離心收得率計算公式如下。

離心損失率=上清液活菌數（CFU/mL）/初始活菌數（CFU/mL）×100%；

離心存活率=沉降細胞活菌數（CFU/mL）/[初始活菌數（CFU/mL）-上清液活菌數（CFU/mL）]×100%；

離心收得率=沉降細胞活菌數（CFU/mL）/初始活菌數（CFU/mL）×100%。

1.2.4 高效凍干保護劑 脫脂奶粉可作為乳酸菌的冷凍保護劑，糖類也是菌體在凍干時應用較為廣泛的保護劑[8-9]，常用作糖類保護劑的主要有葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖。它們共同點是有大量自由基，具有還原性，抗干燥保護能力較強，同時還可抑制菌表面自由基的產生[10-14]；Fuchigami等認為，海藻糖能使菌體內的水形成細小和鈍圓的小冰晶，減弱了冷凍時冰晶的機械損傷作用，能穩定細胞膜和蛋白質結構，抗逆保鮮作用較強[15]。

小分子保護劑，一般具有很強的親水性，分子結構含有3個以上氫鍵，在冷凍或干燥過程中，可與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或菌體蛋白質極性基團形成氫鍵，保護細胞膜和蛋白質結構與功能的完整性。而大分子保護劑通過包裹形式保護菌體，同時，促進低分子保護劑發揮作用。

1.2.4.1 單因素保護劑的篩選 將活化后的植物乳桿菌L42，以1%（活菌數約0.1億CFU/mL）接種于番茄汁復合增殖培養基中，37 ℃恒溫培養至對數生長末期，離心收獲菌體，以10%脫脂乳為基礎保護劑，分別添加單糖類、多糖類、蛋白質類等多種物質在-20～18 ℃冷凍12 h，進行真空冷凍干燥，測定其活菌數計算冷凍存活率及凍干存活率。

1.2.4.2 復合保護劑的篩選 在單因素試驗基礎上采用正交試驗設計，以活菌數為評價指標，以L9（34）正交表（表2）進行試驗設計，篩選出以10%脫脂乳為基礎保護劑的復合保護劑。冷凍存活率、凍干存活率計算公式如下：

冷凍存活率=冷凍后細胞活菌數（CFU/mL）/初始活菌數（CFU/mL）×100%；

凍干存活率=冷凍干燥后細胞活菌數（CFU/mL）/初始活菌數（CFU/mL）×100%。

1.2.5 菌株L42直投式發酵劑耐受性驗證 將凍干后的菌株L42直投式發酵劑無菌條件下加入等量4%葡萄糖溶液復溶，以0.1億CFU/mL的初始菌量，分別接種于不同乙醇度，乙醇度分別為9%、11%、13%；SO2濃度分別為70、100、130 mg/L；pH值分別為4.0、3.5、3.0的MRS液體培養基中，30 ℃恒溫培養24 h，采用平板計數法測定不同處理的活菌數。

1.2.6 菌株凍干保護劑貯藏穩定性 將保存于4 ℃的菌株凍干發酵劑，每隔2個月測定活菌數，觀察菌株在保藏期內的活菌量變化，為今后確定其保質期提供依據。

2 結果與分析

2.1 廉價增殖培養基的篩選

2.1.1 基礎培養基的確定

2.1.1.1 植物乳桿菌L42的生長曲線 從圖1可以看出，在37 ℃條件下，植物乳桿菌L42在3種基礎培養基中培養6 h后細胞生物量開始快速增加，在6～16 h期間，菌體生物量呈對數增長，D值增長迅速，但胡蘿卜汁的增長速度較番茄汁、白菜汁增長緩慢。16 h后菌株L42在3種培養基中均進入生長穩定期，此時D值達到最大，并且保持穩定狀態。通常細菌在對數增長期的后期，菌體細胞的活性較強，存活率較高，因此，在適宜條件下培養13～16 h是植物乳桿菌L42細胞收獲的最佳時期。

2.1.1.2 基礎培養基的確定 從表3可以看出，植物乳桿菌L42在3種基礎培養基中均能生長，但由于3種基礎培養基的營養物質不豐富，其細胞生長量不如MRS培養基，且在3種基礎培養基中，菌株在番茄汁基礎培養基中的長勢最好，說明3種基礎培養基中番茄汁最適合菌株的生長，且與其他培養基差異極顯著，所以選擇番茄汁作為增殖基礎培養基。

2.1.2 基礎培養基增殖因子的篩選 試驗以番茄汁為基礎培養基，磷酸氫二鉀作為一種緩沖劑添加到番茄汁基礎培養基中，再添加不同的增殖因子，以期獲得高活菌數，從表4可以看出，添加的不同增殖因子對植物乳桿菌L42均有不同的增殖效果，其中1%胰蛋白胨、1%蛋白胨、2%葡萄糖為最佳增殖因子，為植物乳桿菌L42提供豐富的氮源和碳源。

2.1.3 正交試驗篩選植物乳桿菌L42番茄汁增殖復合培養基 根據單因素試驗結果，選用L9（34）正交表進行正交設計試驗，植物乳桿菌L42以胰蛋白胨、葡萄糖、酵母膏作為3個因素，參考正交表配制不同的復合培養基，從中優化篩選出植物乳桿菌L42的最佳番茄汁復合培養基。以1%接種量分別接入正交試驗所設計的9種復合培養基中，37 ℃條件下培養16 h，進行活菌計數。

從表5可以看出，植物乳桿菌L42的3個因素中，最佳培養基配比為A1B3C2。即在含有0.2% K2HPO4的番茄汁基礎培養基中添加0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖，植物乳桿菌L42經活化后按1%的接菌量接入該復合培養基中于37 ℃條件下培養16 h，活菌數可達到57.8億CFU/mL，與番茄汁基礎培養基相比提高了7.41倍，活菌數也提高了一個數量級。

2.2 乳酸菌濃縮分離技術

離心濃縮分離細胞是收獲菌體的簡便方法，多被采用。通過離心試驗，可盡量減少殘留在上清液中的細胞，也可改善離心力機械作用所造成的傷害，避免細胞死亡，尋求獲得活細胞最高收得率的最佳離心條件。從表6可以看出，菌株L42離心損失率最高為4 000 r/min、10 min；其次是 4 000、20 min，5 000、10 min，6 000、20 min，6 000、10 min，5 000、20 min，8 000、5 min，8 000、10 min，且差異極顯著（P<0.01）。

菌株L42離心收得率由低到高為 6 000、20 min，4 000、10 min，8 000、10 min，8 000、5 min，4 000、20 min，5 000、10 min，5 000、20 min，6 000、10 min。植物乳桿菌的最佳復合凍干保護劑為6 000 r/min、10 min，離心收得率可達 99.37%。

2.3 凍干保護劑的研究

2.3.1 單因素凍干保護劑的篩選 從表7可以看出，加不同保護劑的冷凍存活率和凍干后存活率差異極顯著，因而從大分子糖類中選擇海藻糖為最佳凍干保護劑，小分子凍干劑以谷氨酸鈉、吐溫80、酵母浸粉較高，具有抗冷凍作用，為較優凍干保護劑。

2.4 菌株L42直投式發酵劑的耐受性

植物乳桿菌L42經冷凍干燥后獲得的直投式發酵劑對乙醇、SO2、pH值仍具有一定的耐受性，在11%乙醇、130 mg/L SO2、pH值3.0的環境下能夠正常增殖且與原始菌株耐受性在同一數量級上（表9至表11）。

2.5 植物乳桿菌L42直投式發酵劑保藏期的驗證

菌株L42凍干發酵劑在4 ℃，11個月內活菌數呈下降趨勢，但在11個月后活菌數依然可以達到10億CFU/mL，表明選擇的發酵劑可以滿足直投式發酵劑的活菌數要求，在保證乳酸菌的活菌數方面具有一定的優勢，并具有一定的穩定性（圖2）。

3 結論

確定植物乳桿菌L42的最佳廉價培養基為番茄汁基礎培養基、0.2% K2HPO4、0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖；最佳離心條件為6 000 r/min、10 min；最佳凍干保護劑的配方為10%脫脂乳、10%海藻糖、1.5%谷氨酸鈉、1%吐溫80、0.5%酵母浸粉。在此條件下獲得的植物乳桿菌L42直投式發酵劑進行穩定性研究，結果表明，該菌株直投式發酵劑在4 ℃條件下保藏11個月后活菌數仍可保持在10億CFU/mL。經冷凍干燥后獲得的植物乳桿菌對乙醇、SO2、pH值仍具有一定的耐受性，在11%乙醇、130 mg/L SO2、pH值3.0環境下能夠正常增殖。

目前，我國大多數葡萄酒廠進行葡萄酒MLF依靠進口直投式活性乳酸菌或自然發酵，致使生產成本極大增加、葡萄酒質量很難保證。本研究對葡萄酒二次發酵優良植物乳桿菌L42進行高密度培養和直投式發酵劑的制備，為葡萄酒優良乳酸菌L42的大規模培養提供依據，對葡萄酒工業生產具有深遠意義。

參考文獻：

[1]李 華. 現代葡萄酒工藝學[M]. 西安：陜西人民出版社，1995：109-118.

[2]Davis C R，Wibowo D，Eschenbruch R，et al. Practical implications of malolactic fermentation：a review[J]. American Journal of Enology and Viticuluture，1985，36（4）：290-301.

[3]朱寶鏞. 葡萄酒科學與工藝[M]. 北京：中國輕工業出版社，1992：17-18.

[4]張春暉，王 華，李 華. 蘋果酸-乳酸發酵對干紅葡萄酒品質的影響[J]. 西北農業大學學報，1999，27（6）：74-78.

[5]朱寶鏞. 葡萄酒工業手冊[M]. 北京：中國輕工業出版社，1995：170-172.

[6]Vinderola C，Mocchiutti P，Reinheimer J. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（4）：721-729.

[7]Crittenden R，Bird A，Gopal P，et al. Probiotic research in Australia，New Zealand and the Asia-Pacific region[J]. Current Pharmaceutical Design，2005，11（1）：37-53.

[8]吳雁軍，劉松玲，郭慧媛，等. 直投式乳酸菌發酵劑活性影響因素的研究進展[J]. 中國乳業，2011，113（5）：52-55.

[9]Wang W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals[J]. International Journal of Pharmaceutics，2000，203（1/2）：1-60.

[10]徐致遠，劉 榮，郭本恒，等. 保護劑在乳酸菌凍干過程中的應用[J]. 乳業科學與技術，2006，29（4）：155-157，165.

[11]萬紅兵. 高效濃縮型酸奶凍干發酵劑制備關鍵技術研究[D]. 保定：河北農業大學，2006.

[12]翟碩莉. 新鮮軟質干酪發酵劑及發酵工藝研究[D]. 保定：河北農業大學，2007.

[13]Bynum D G，Barbano D M. Whole milk reverse osmosis Retentates for cheddar cheese manufacture：Chemical changes during aging[J]. Journal of Dairy Science，1985，68（1）：1-10.

[14]于修維. 乳酸菌高密度培養及濃縮型發酵劑研究[D]. 南京：南京工業大學，2004.

[15]Fuchigami M，Ogawa N，Teramoto A. Trehalose and hydrostatic pressure effects on the structure and sensory properties of frozen tofu（soybean curd）[J]. Innovation Food Science&Emerging Technologies，2002，3（2）：139-147.林文秋，楊為海，鄒明宏，等. 澳洲堅果果皮不同溶劑提取物的含量和抗氧化活性[J]. 江蘇農業科學，2017，45（1）：171-174.