氧糖剝奪再灌注引起的SH-SY5Y細胞凋亡與NF-κBp65和COX-2蛋白表達的關系

黃 赟， 董艷軍， 肖 雁， 官志忠

氧糖剝奪再灌注引起的SH-SY5Y細胞凋亡與NF-κBp65和COX-2蛋白表達的關系

黃 赟1， 董艷軍2， 肖 雁1， 官志忠1

目的 探討氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后SH-SY5Y細胞凋亡情況及NF-κB信號通路NF-κBp65、COX-2蛋白的表達。方法 將SH-SY5Y細胞分為正常對照組、氧糖剝奪4 h/再灌注24 h組(OGD/R)組。利用流式細胞術分別檢測各組細胞凋亡率，蛋白印記法(Western blot)檢測p65和COX-2的蛋白表達情況。結果 與正常對照組比較，OGD/R組細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)，p65和COX-2的蛋白表達也明顯增高(P<0.05)。結論 氧糖剝奪4 h/再灌注24 h能夠促進細胞凋亡，其機制可能是通過NF-κBp65對COX-2調控的信號通路來實現。

氧糖剝奪再灌注； 細胞凋亡； NF-κBp6； COX-2

缺血是引起細胞死亡的一個重要原因，然而醫學研究發現，真正造成細胞死亡的原因并不是缺血本身，而是恢復血供后，過量的自由基對缺血細胞的攻擊造成的損傷，這種損傷叫做“缺血再灌注損傷”。而缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡則是造成細胞死亡的一個重要原因[1]。眾多研究表明，缺血再灌注后細胞凋亡率明顯增高[2,3]。然而細胞凋亡的相關機制及其涉及到的信號通路尚不十分明確。本研究以人神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)為研究對象，通過構建氧糖剝奪再灌注模型，模擬缺血再灌注損傷，對缺血再灌注損傷后神經細胞的凋亡及可能機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材 料 細胞SH-SY5Y細胞株，為本實驗室本課題組穩定保存。試劑:DMEM高糖培養基、雙抗(青霉素、鏈霉素)、0.25%胰酶購自美國Hyclone公司；胎牛血清、DMEM無糖培養基購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物；p65抗體購自美國Cell Signaling公司；COX-2抗體購自美國Gentex公司；GAPDH購自美國Proteintech公司；HRP標記的抗鼠二抗、抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、顯影定影試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司；PVDF膜、ECL-Plus發光試劑購自美國Millipore公司；成像膠片購自柯達公司。儀器:流式細胞儀，美國BD公司；ELX800UV酶標儀，美國Bio-Tec公司；Western blot跑膠裝置，北京百晶生物技術有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 SH-SY5Y細胞培養 采用常規細胞培養方法復蘇SH-SY5Y細胞，然后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基將細胞稀釋至一定密度后置于37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中培養。約2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 SH-SY5Y細胞氧糖剝奪模型的建立 實驗前1 d向三氣培養箱內充入94%N2+5%CO2混合氣體，使培養箱內氣體濃度為94%N2、%CO2、1%O2。將細胞按0.5×106個/ml的密度接種于6孔板。24 h后，觀察細胞已貼壁且生長良好，將細胞分為正常對照組和OGD/R組，每組均設3個復孔。正常對照組于普通培養箱中繼續培養；而OGD/R組則將細胞取出，倒掉原培養基，用PBS清洗3次(1 min/次)以除去原培養基中的葡萄糖和胎牛血清對后續實驗的影響。然后加入只含1%雙抗，不含血清的無糖培養基，最后將細胞置于三氣培養箱中培養4 h。之后取出細胞，再以PBS清洗3次(1 min/次)后更換含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基于普通二氧化碳恒溫培養箱中繼續培養24 h。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 OGD/R結束后，收集兩組細胞。用0.25%不含EDTA的胰酶消化后終止消化，用PBS清洗兩次，每次以1000 rpm/min的速度離心5 min。然后用400 μl 1×Annexin V結合液懸浮細胞。在細胞懸浮液中加2.5 μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于4 ℃冰箱孵育15 min。之后再加入10 μl PI染色液后輕輕混勻于4 ℃冰箱孵育5 min。立即用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 Western blot檢測p65和COX-2的蛋白表達 RIPA蛋白裂解液與PMSF按100∶1的比例混合后，每孔加入100 μl蛋白裂解液，將細胞于冰上裂解1 h。之后于4 ℃低溫離心機12000 r/min離心20 min，取上清，BCA法進行蛋白定量后以25 μg的蛋白總量上樣。制備8%-聚丙烯酰胺凝膠，以80 V電壓跑至蛋白Marker條帶分開后，將電壓調至120 V至電泳結束。然后以200 mA的電流轉膜100 min，轉膜結束后用TBST洗膜兩次，5 min/次，之后封閉液封閉2 h。封閉結束后TBST洗膜3次，5 min/次，最后一抗p65(1∶1000)、COX-2(1∶1000)、GAPDH(1∶20000)孵育于4 ℃冰箱過夜。第2天回收一抗，TBST洗膜5次，5 min/次，p65和COX-2蛋白以抗兔二抗(1∶10000)孵育1 h，GAPDH蛋白以抗鼠二抗(1∶100000)孵育1 h，TBST洗膜1 h，最后暗室曝光，掃描條帶后使用Image J軟件對數據進行分析。

2 結 果

2.1 細胞凋亡檢測結果 細胞凋亡情況用凋亡率表示，為早期凋亡與晚期凋亡之和。在流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為FITC-/PI-；右上象限為晚期凋亡細胞，為FITC+/PI+；而右下象限為早期凋亡細胞，FITC+/PI-(見圖1)。從圖上看出，對照組細胞主要分布在左下象限，只有少量細胞分布在右上象限和右下象限；而OGD/R組細胞在右上象限和右下象限都有明顯增加，說明早期凋亡細胞、晚期凋亡和壞死細胞增加。統計結果表明，OGD/R組與正常對照組相比細胞凋亡率明顯增加且有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

2.2 NF-κBp65與COX-2蛋白表達情況 Western blot結果顯示，與正常對照組相比，OGD/R組p65和COX-2蛋白表達量均有顯著增高且有統計學意義(P<0.05)(見圖3)。

a:正常對照組(Control組)；b:氧糖剝奪再灌注組(OGD/R組)

圖1 AnnexinV-FITC /PI雙染流式細胞術檢測凋亡

與Control組比較*P<0.05

與Control組比較*P<0.05

3 討 論

缺血再灌注造成的腦損傷是導致死亡和長期殘疾的一個主要因素[4]，在體外研究中，OGD/R模型是體外模擬腦缺血再灌注的常用模型。SH-SY5Y細胞株是人神經母細胞瘤細胞，具有神經細胞及腫瘤細胞的特點，因而廣泛應用于神經系統疾病研究。細胞凋亡(apoptosis)或程序化細胞死亡(programmed cell death，PCD)是多細胞有機體為調控機體發育、維護內環境穩定、由基因控制的細胞主動死亡的過程[5]。凋亡過程中細胞發生一系列形態學及生物化學的改變，目前在體內體外均有多種方法可以檢測這些改變以反映凋亡過程，如形態學檢測法、DNA片段化檢測、TUNEL檢測法等；流式細胞術、線粒體膜電位檢測等[6]。

本實驗研究以SH-SY5Y細胞為研究對象構建OGD/R模型，以AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術為檢測手段檢測細胞凋亡。從實驗結果可以看到，正常對照組細胞只有少量細胞凋亡。當OGD/R發生時，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞數明顯增多，表明SH-SY5Y細胞凋亡率明顯增高，說明對細胞進行OGD/R處理后可明顯誘發SH-SY5Y細胞凋亡。

核因子-κB(NF-κB)是細胞內普遍存在的轉錄因子，是多種信號通路轉導途徑的匯聚點，其典型代表是p50/p65異源二聚體，NF-κBp65在缺血引起的程序性細胞死亡包括細胞凋亡和自噬中起重要作用[7～9]。Zhang等在研究短暫性腦缺血發作的實驗中發現，NF-κBp65激活與神經元損傷密切相關，且抑制NF-κBp65活化對神經細胞凋亡有保護作用[10]。COX-2為誘生型環氧化酶，是炎性反應的標志物，也是腦缺血導致神經元死亡的關鍵酶[11]。它是NF-κB信號通路中一種重要的蛋白分子，對腦缺血損傷有重要作用，也對激活NF-κB有重要意義[12]。有報道指出，當缺血再灌注損傷發生時，大鼠腦組織中COX-2表達增加[13]。本課題組前期研究表明，缺血再灌注大鼠海馬NF-κBp65及COX-2的表達均高于正常SD大鼠[14]。本次研究利用Western blot技術對NF-κBp65和COX-2在SH-SY5Y細胞中的表達量進行測定，發現OGD/R后，細胞NF-κBp65和COX-2的表達量較正常對照組都有明顯增高。說明當OGD/R發生時可能激活了NF-κB信號通路，NF-κBp65又對其下游的COX-2產生作用，使其表達量增高。

綜上所述，當對SH-SY5Y細胞進行氧糖剝奪4 h、再灌注24 h處理后，細胞凋亡率較正常細胞明顯上升，且NF-κB信號通路被激活，說明其產生凋亡的機制可能是通過NF-κBp65激活COX-2實現的。

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The relationship between the apoptosis of SH-SY5Y cells and NF-κBp65,COX-2 after oxygen-glucose deprivation/reperfusion

HUANGYun,DONGYanjun,XIAOYan,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To explore the relationship between the apoptosis of SH-SY5Y cells and NF-κBp65,COX-2 after oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R).Methods Cells were divided into normal control group and oxygen glucose deprivation 4 h/reperfusion 24 h groups.The cell apoptosis rate was analyzed using flowcytometry,and Western blot assay was used to evaluate the expression of p65 and COX-2 proteins in control group and OGD/R group.Results Compared with the normal control group,the apoptosis rate of OGD/R group was significantly higher (P<0.05),and the protein expression of p65 and COX-2 was also significantly increased (P<0.05).Conclusion Oxygen glucose deprivation 4 h/reperfusion 24 h can induced apoptosis,which may be through the signaling pathway that NF-κB p65 regulates COX-2 to achieve.

Oxygen-glucose deprivation/reperfusion; Apoptosis; NF-κBp65; COX-2

2016-10-09；

2016-11-29

國家自然科學基金(No. 81160149)；貴州省科技廳基金項目[黔科合J字(2014)2012]

(1.貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州醫科大學地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院病理科，貴州 貴陽 550004)

肖 雁，E-mail：xiaoyanhonan@hotmail.com

1003-2754(2017)02-0119-03

R743.3

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