核苷（酸）類藥物治療慢性乙型肝炎患者影響HBeAg血清轉換的免疫學因素研究進展*

曹輝綜述，張瑋審校

·綜述·

核苷（酸）類藥物治療慢性乙型肝炎患者影響HBeAg血清轉換的免疫學因素研究進展*

曹輝綜述，張瑋審校

宿主的免疫系統功能決定了乙型肝炎病毒(HBV)感染的最終轉歸。核苷（酸）類藥物抗病毒治療能快速降低病毒載量，恢復宿主的免疫功能，HBeAg血清轉換就是宿主免疫系統功能部分恢復的標志。本文介紹了近五年這個領域的相關基礎及臨床研究，探討了天然免疫和獲得性免疫與HBeAg血清轉換的相關性，為提高核苷（酸）類藥物抗病毒治療過程中的HBeAg血清轉換率提供依據。

慢性乙型肝炎；HBeAg血清轉換；先天性免疫；獲得性免疫；細胞因子

HBV感染是導致慢性肝臟損傷的重要病因。全球有超過2.8億人口為HBV慢性感染者，持續的HBV慢性感染是引起肝硬化、肝癌最主要的原因。近年來，病毒性肝炎相關死亡中一半以上都與HBV慢性感染相關[1]。在中國，HBsAg陽性的流行率超過7.18%，雖然已經實施了有效的疫苗干預，但HBV慢性感染一直是影響生活質量的危害因素[2]。

HBV慢性化機制尚未完全明確，但HBV清除已被證實與宿主HBV特異性免疫應答密切相關。在自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）和原發性膽汁性膽管炎（Primary biliary cholangitis，PBC）的患者中，HBsAg陽性流行率遠低于正常人，進一步證實了宿主的免疫應答在清除HBV感染中的重要性[3]。HBeAg血清轉換的定義是指血清HBeAg、HBV -DNA檢測不到，同時伴隨著中和性抗體Anti-HBe的出現。HBeAg血清轉換意味著宿主免疫系統已經具有控制和清除HBV的能力，形成了對HBV監控的“體系”[4]。HBsAg、HBeAg被證實對宿主的先天免疫和獲得性免疫中的多種免疫元素的功能有干擾作用?？共《舅幬锬芸焖俳档筒《据d量，給宿主免疫系統一個恢復的“窗口期”。HBeAg血清轉換就是機體部分免疫功能恢復的標志，是先天免疫和獲得性免疫共同作用的結果[5]。

1 先天免疫

先天免疫系統是非抗原特異的防護機制，在暴露于感染后可以立即或數小時內發生應答，是宿主清除病原體和控制感染的最初應答，也是抵御病原體和其他潛在威脅的第一道防線。肝臟先天免疫系統包括補體、Kupffer細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、自然殺傷T細胞（NKT細胞）和肝內樹突狀細胞（DC），這些免疫細胞可以針對病原微生物產生獨特的免疫應答[6]。多種先天免疫細胞的精細調節對于有效清除入侵的病原體和其他威脅是至關重要的。

1.1 NK/NKT細胞NK細胞是肝臟內主要的淋巴細胞，參與組成抵御病原體的第一道防線。NK細胞無主要組織相容性抗原復合體（MHC）限制、不依賴抗體、無須預先抗原致敏，就能殺傷病毒感染細胞。NK細胞有兩個表型：CD56（CD56brightNK）高表達，則其細胞毒性低，而IFNγ分泌高；低表達CD56（CD56dimNK），則細胞毒性高，而IFNγ分泌低[7]。慢性乙型肝炎患者（CHB），NK細胞分化多傾向于CD56dimNK，表現出“炎性”表型，特點是高表達活動性受體（包括CD161、CD38、KI67等）的CD56dimNK細胞，有傾向的聚集在肝臟內，表現出很強的肝細胞毒性，主要參與肝細胞凋亡，引起肝星狀細胞活化，導致肝纖維化。而IFNγ仍處于低表達狀態，導致了肝臟持續受損，卻不能徹底清除HBV[8]。核苷（酸）類藥物（NAs）治療后，NK細胞的表型逐漸恢復至“靜止”狀態，活動性受體的表達水平逐漸下降。與此同時，NK細胞分化開始傾向一個利于清除HBV的表型CD56brightNK。若隨著病毒載量以及抗原濃度下降，CD56brightNK細胞頻數以及分泌IFN-γ的水平逐漸上升，往往在接下來的治療中能獲得HBeAg血清轉換[9]。與NAs相比，Peg-IFNα對NK細胞的作用更加高效，Peg-IFNα能直接擴增CD56brightNK細胞頻數，提高NK細胞的活力，增強其分泌IFNγ的功能。CD56brightNK細胞是NK細胞最早分化的亞群，早于CD56dimNK細胞，它們能優先和DC細胞相互作用，在早期先天免疫應答以及獲得性免疫應答中占據重要的作用[10]。IFN和NAs聯合治療不但能促使HBeAg血清轉換，還能提高HBsAg陰轉率，這與改變NK細胞的表型和功能密切相關[11]。Femke等[12]發現Peg-IFNα聯合阿德福韋治療獲得HBeAg血清轉換、HBsAg陰轉的CHB患者，CD56dimNK細胞頻數明顯下降，其表面抑制性受體NKG2A、趨化因子受體CX3CR1呈低表達；而CD56brightNK細胞頻數明顯升高，并分泌高水平的IFNγ。其細胞表面，能使NK細胞表現出肝毒性的活動性受體CD161低表達，腫瘤壞死因子凋亡相關的調導配件（TNF-related apoptosis-indueing ligand，TRAIL）高表達，TRAIL可以介導機體特異性地清除肝細胞中的病毒?？傊?，CD56brightNK細胞頻數升高，有助于在抗病毒治療過程中獲得HBeAg血清轉換。

NKT細胞是一類特殊的T細胞亞群，同時表達NK細胞和T細胞的表面標志物。在HBV感染的動物模型中NKT細胞能分泌抗病毒因子IFNγ和TNFβ參與控制HBV復制[13]。NKT細胞按照表型和功能分為CD4+NKT和CD4-NKT。HBV慢性感染者，NKT細胞主要以CD4+NKT占優勢。CD4+NKT細胞主要分泌抗炎類細胞因子誘導免疫耐受，CD4-NKT主要分泌Th1類細胞因子，促使Th1免疫應答，清除病毒。隨后，jiang等[14]發現接受NAs獲得HBeAg血清轉換的患者，CD4-NKT/CD4+NKT比值明顯高于沒有出現的患者。提示HBeAg血清轉換與NKT細胞的表型密切相關。

1.2 DC細胞DC是經典的抗原遞呈細胞，攝入和提呈抗原后可活化CD4+和CD8+T細胞。此外，DC細胞還是體內Ⅰ型IFN的主要來源,Ⅰ型IFN主要參與調節肝臟內局部免疫應答[15]。HBV慢性感染后，隨著HBeAg濃度升高，DC細胞數量逐漸減少，幸存的DC細胞開始低表達CD80、CD86、HLA-DR等共刺激分子，使DC細胞的抗原提呈功能減弱以及分泌IL-10水平上升，進一步導致Th1以及細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）的效應下降。Lin等[16]調查發現與處于免疫耐受期的HBV感染者相比，自然獲得HBeAg血清轉換的HBV感染者，DC細胞表現出強大的抗原提呈及分泌IL-12等促炎細胞因子的功能。隨后，wei等[17]發現用恩替卡韋加自體DC細胞治療CHB患者，發現HBeAg血清轉換率明顯高于恩替卡韋單藥組。展現出了DC細胞在HBeAg血清轉換中不可或缺的作用。

1.3 TLRTOLL樣受體（TOLL-like receptor，TLR）常表達于肝細胞、DC細胞、Kuffper細胞和肝血竇內皮細胞膜表面和胞漿中，經病原相關分子（PAMP）激活，發揮信號傳感器作用。HBV多種抗原分子（如HBsAg、HBeAg）可激活多種TLR受體（如TLR2、TLR4、TLR7），TLR與病原分子結合后，經細胞內途徑，如核因子（NF）-KB，產生各種細胞因子如TNFα、IL-6、IL-12、IFNγ、趨化因子來清除HBV[18]。但HBV也有相應的拮抗機制，HBV病毒顆粒、HBsAg、HBeAg能降低TLR的表達，或抑制TLR途徑激活的先天免疫，從而促使HBV感染慢性化[19]。HBV還能下調模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）的表達，阻止PRR-PAMP相互作用，干擾下游信號轉導通路來阻止PRRs激活以及下游IFNγ及核因子（NF）-K B相關炎性因子（如TNFα）釋放[20]。

影響到HBV感染的轉歸與單核細胞TLR2的表達水平直接相關。TLR2主要表達在單核細胞上，經TLR2配體（Pam3csk4）刺激，分泌TNF-a、IL-6、IL-10。肝細胞內的HBeAg，可以干擾TLR2活化所需的MyD88與TRAM和（或）Mal的相互作用來阻止TLR2信號轉導通路，而血清中的HBsAg能選擇性的關閉JNK-MAPK信號通路，抑制Pam3csk4，從而降低IL-12的分泌。IL-12是重要的免疫調節因子，是連接先天免疫和獲得性免疫的橋梁，其主要功能是輔助T細胞的增殖和分化，促進Th1細胞的免疫應答以及分泌IFNγ,還能促使CD8+T細胞充分發育CTL細胞以及增強它們的殺傷能力[21]。故而當JNK-MAPK信號通路關閉時則更難清除HBsAg。Huang等[22]研究佐證了這一觀點，他發現接受NAs治療后，隨著病毒抗原濃度下降，單核細胞表達TLR2水平逐漸上升的CHB患者，都能在后續的治療中獲得HBeAg血清轉換。與NAs相比，PEG-INFα治療獲得HBeAg血清轉換率顯著升高，可能與PEG-INFα不僅能提升TLR2的表達，還能提高Pam3csk4的活性相關[23]。

TOLL樣受體中的TLR-7受體主要表達在漿樣樹突狀細胞（pDCs）和B淋巴細胞的核內體區域中，其作用是識別病毒的單鏈RNA（Single strand RNA，ssRNA）。TLR-7刺激上調，能促使pDC細胞分泌IFNα和其它的細胞因子/趨化因子，誘導NK細胞活化以及激活細胞毒性淋巴細胞[24]。此外，Lanford等[25]還發現TLR7被激活后，還能提高干擾素刺激基因（ISG）的表達，促進pDC細胞產生I型IFN，從而清除HBV。顯然，Toll樣受體能精密的協調先天免疫和獲得性免疫應答，在宿主清除HBV中占據重要的角色，可為徹底清除HBV帶來曙光。

2 獲得性免疫

長期暴露于高水平病毒抗原下，T細胞被大量耗竭，功能嚴重受損，受損程度與病毒載量成正比。殘存功能低下的T細胞表達高水平的共抑制性受體，如程序性死亡分子1（Programmed death 1，PD-1）、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin-3，Tim-3），影響T細胞的應答和分化[26]。正是基于上述原因，在HBV感染時，獲得性免疫反應表現為延遲、持續時間短和窄譜的T細胞應答，表現為免疫耐受。

2.1 Th1/Th2細胞Th1、Th2是CD4+Th細胞的亞群，CD4+Th細胞因細胞環境不同分化為功能不同的亞型。HBV慢性感染后，極高濃度的抗原肽、肝內微環境中相當豐富的IL-10、TGFβ、精氨酸酶等有助于CD4+Th細胞極向分化，導致Th1、Th2細胞頻數明顯比健康人少，且分泌Th1、Th2樣細胞因子能力差[27]?？共《局委熌芨纳七@一缺陷。Peg-IFNα能誘導CD4+Th細胞偏向Th1和Th2分化，雖然它們被認為是促炎細胞，分泌促炎因子，加重肝臟損傷。但Peg-IFNα誘導后分化的Th1、Th2細胞主要分泌IFγ、IL-2、TNFα等細胞因子以非細胞毒途徑清除肝內的HBV，降低HBV載量，減少病毒蛋白合成，雖然HBsAg清除率不高，但HBeAg血清轉換率明顯上升[28]。隨著血清HBV DNA載量、抗原濃度下降，若CD4+Th細胞分化開始以Th1、Th2占優勢，往往能獲得HBeAg血清轉換[29]。You等[30]隨訪長療程接受恩替卡韋治療獲得HBeAg血清轉換的CHB患者，發現其Th1、Th2細胞頻數以及Th1、Th2樣細胞因子明顯比基礎水平多。未實現HBeAg血清轉換的患者，沒有出現類似的現象，Th1、Th2細胞頻數和Th1、Th2樣細胞因子仍然較低。因此，他認為Th1、Th2細胞免疫應答強度，在HBeAg血清轉換中至關重要。

Th1、Th2免疫應答增強，表現在它們分泌的細胞因子水平上升。Th1細胞分泌IL-2、IFNγ、TNFα，能促使CD8+T細胞活化成高效的CD8+CTL細胞，在基因轉錄和轉錄后層面抑制HBV復制；還能維護CD8+T細胞分化、增殖、代謝以及凋亡的關鍵調節器AKT、mTOR的功能。HBV持續感染時，CD8+T細胞上的AKT、mTOR調節功能受損，FOX01效應作用上升。FOX01作為PD-1的轉錄激活因子，促使CD8+T細胞分化成功能低下的效應CD8+CTL細胞，這種細胞的特點是對病毒抗原不敏感，細胞毒性低，通過Fas/FasL或穿孔素直接殺傷感染的肝細胞途徑減弱以及分泌IFNγ等細胞因子減少[31]。Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-10，主要作用是支持B細胞的激活和增殖，輔助HBV特異性B細胞產生高水平的抗體。Rong[32]發現基礎Anti-HBc滴度與HBeAg血清轉換率高度相關，Anti-HBc包括IgM和IgG由HBcAg-特異性B淋巴細胞分泌。他認為基礎高滴度的Anti-HBc可能與Th1、Th2細胞高度免疫應答相關。

此外，Th1/Th2樣細胞因子的水平及比值在清除HBV中也起到了重要的作用。Tang[33]等從關于小鼠HBV感染模型中發現，下調細胞因子信號轉導抑制因子SOCS1和SOCS3，能顯著提高Th1、Th2細胞頻數以及Th1/Th2樣細胞因子的比值。SOCS1和SOCS3已經被證實是重要的T細胞分化調節信號，能干擾CD4+Th細胞分化的信號通路STAT1和STAT4。HBV可通過上調SOCS1和SOCS3的表達，影響宿主CD4+Th細胞的分化。NAs治療能快速抑制病毒的復制，降低病毒對CD4+Th細胞分化信號通路的干擾。在接受NAs治療獲得HBeAg血清轉換的患者，Th1/Th2樣細胞因子的比值顯著上升，具體表現在Th1型細胞因子IL-2、TNFα、IFNγ水平上升，Th2型細胞因子lL-6、IL-10水平下降等[34]。Chokshi[35]的研究得到了相似的結果，他發現在獲得HBeAg血清轉換的CHB患者外周血中，IL-2,TNF-a、IFNγ的含量顯著上升，而沒有獲得的HBeAg血清轉換的CHB患者，TGFβ、lL-6、IL-10含量上升。

2.2 調節性T細胞（Treg）Treg細胞由CD4+Th細胞分化而來，極化因子為TGFβ，主要分泌IL-10、TGFβ細胞因子。Treg細胞通過細胞直接接觸或分泌IL-10、TGFβ間接抑制多種淋巴細胞反應，從而抑制HBV的清除反應，導致感染慢性化[36]。急性肝衰竭（ACLF）發生時，活化的促炎細胞、促炎因子、趨化因子受體可以誘導Treg的產生，并募集其他抗炎細胞至肝臟，抑制過度的肝臟免疫損傷，促進肝臟修復，保護肝臟。提示Treg細胞在維持對內源性和外源性抗原免疫耐受的重要性[37]。Yang[38]比較了HBV慢性感染者與健康人的外周血發現，HBV慢性感染者外周血中調節性B細胞（Regulatory B cell,Breg）、Treg細胞頻數明顯比健康人多，且與HBV載量呈正相關。Breg細胞能促使CD4+Th細胞偏向Treg細胞分化，并提高Treg細胞上FOXP3和CTLA-4的表達來促進IL-10，TGF-B的分泌，從而抑制Th1細胞、Th17細胞的免疫應答[39]?？共《局委熌芙档屯庵苎蠺reg細胞頻數。從Yang等[40]研究可以反映出來。他發現接受TDF抗病毒治療獲得HBeAg血清轉換的CHB患者，其外周Treg細胞頻數明顯下降，而在沒有獲得的患者中，Treg細胞幾乎不下降。有趣的是，他還發現在獲得HBeAg血清轉換的患者，Treg細胞T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）/β鏈可變區（Vβ），Vβ家族中以Vβ14，Vβ20，Vβ24高表達。沒有獲得HBeAg血清轉換的患者，Vβ家族中以Vβ12，Vβ15，Vβ22高表達。β鏈可變區（Vβ）能對病毒表位肽進行特異性識別，是與表位肽/MHC-I復合體最密切聯結的TcR部分。Vβ家族不同成員的比例，直接關系到CTL細胞對病毒抗原的應答性[41]?；诖?，是否可以將Treg細胞頻數以及Vβ家族中的分子型作為預測HBeAg血清轉換的指標，這需要更加深入的研究。

2.3 濾泡輔助性T細胞（Tfh）大部分抗原需要與Tfh細胞或Tfh細胞分泌的細胞因子接觸才能激活體液免疫，Tfh細胞的特征是高表達化學趨化因子受體CXCR5。CXCR5+Tfh細胞的特性與CXCR5+CD4+T細胞相似，后者在循環血液中的頻數可以反應出前者在淋巴組織中的頻數[42]。在生發中心（Germinal center），CXCR5+Tfh細胞的主要作用是輔助Anti-HBe分泌性B細胞分泌抗體Anti-HBe中和HBeAg[43]。Tfh細胞可通過CD40/CD154等多種受體/配體與B細胞結合，輔助抗原特異性B細胞分化成記憶性B細胞或漿細胞[44]。Tfh細胞與B細胞相互作用的強度與HBeAg的血清轉換率之間存在相關性。Zhang等[45]研究發現，接受Peg-IFNα治療獲得HBeAg血清轉換的CHB患者，外周血中CXCR5+CD4+T、CD19+CD38+B細胞頻數明顯增多，且CXCR5+CD4+T細胞表面高表達共刺激受體/配體ICOS、CD40L，低表達共抑制受體PD-1。CD19+CD38+B細胞高表達ICOSL、CD40，低表達PD-L1，而在沒有獲得HBeAg血清轉換的CHB患者中，這種情況是截然相反。CXCR5+CD4+T細胞表達的共刺激受體CD40與B細胞表達的配體CD40L之間相互作用，能誘導產生漿細胞和記憶性B細胞，還能加速抗體的成熟，促進抗體與抗原之間的親和力。CD19+CD38+B細胞表達的配體ICOSL上調，能促使Tfh細胞活化，促進IL-21分泌。IL-21是Tfh細胞最重要的輔助信號分子，血清中IL-21的水平可作為預期HBeAg血清轉換的生物學指標[43]。然而，Lei et al[46]發現CHB患者外周血中CXCR5+CD4+T細胞過度活化（表現在CXCR5+CD4+T細胞頻數增多，輔助B細胞產生高水平的抗體），但HBeAb和HBsAb的分泌卻無明顯改觀。此外CXCR5+CD4+T細胞過度的免疫應答，不僅與肝臟炎癥密切相關，還能產生ANA、AMA、ss-A、ss-B、scl-70、nRNP/sm等多種自身抗體，有誘發肝外自身免疫性疾病的可能。因此，Tfh細胞所介導的體液免疫在清除HBV感染中的免疫作用需進一步探索。

3 結語與展望

免疫學因素在清除病毒中發揮重要的作用?？共《局委熀?，隨著HBV-DNA、HBsAg、HBeAg等濃度下降，先天免疫和獲得性免疫中多種免疫元素功能逐漸恢復，分泌具有清除病毒作用的細胞因子明顯增多，HBeAg血清轉換是宿主免疫部分恢復的結果，意味著宿主的免疫系統出現重建。但是這種抗病毒治療帶來的免疫重建是不穩定的，終止抗病毒藥物后，宿主的免疫系統可表現出持續低效的免疫應答，甚至又有可能回到免疫耐受的狀態?？共《局委煂γ庖呦到y的影響很復雜，多種免疫細胞的相互作用、抗炎因子與促炎因子之間的平衡以及共刺激受體與共抑制受體的相互協調機制仍需深入研究，以期為安全停藥及清除HBsAg提供新的治療策略。

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（收稿：2016-10-10）

（本文編輯：朱傳龍）

Research Progress of Immunological factors influencing HBeAg seroconversion across chronic hepatitis B patients treated with nucleos(t)ide analogues

Cao Hui,Zhang Wei.Department of Liver Diseases,Longhua Hospital,Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200030,China

The function of host immune system determines the final outcomes of hepatitis B virus(HBV)infection.Antiviral treatment by nucleos(t)ide analogs can quickly reduce the viral loads and recovery host immune function.HBeAg seroconversion is a sign for at least a partial host immune system recovery.This paper reviews the relevant basic and clinical research in the nearly last 5 years to explore the correlation between innate immunity and acquired immunity with HBeAg seroconversion and tries to provide evidence for the improvement of HBeAgseroconversionrate in the nucleos(t)ide analogs treatment process.

Hepatitis B;HBeAg;Innate immunity;Acquired immunity;Cytokine

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.035

國家自然科學基金項目（編號：81373860）;上海市中醫中西醫臨床重點扶持項目（編號：ZY3-JSFC-1-1009）

200030上海市上海中醫藥大學附屬龍華醫院肝病科

曹輝，男，26歲，碩士研究生。主要從事中西醫結合治療肝病研究

張瑋，E-mail：18918104444@189.cn