活動性系統性紅斑狼瘡患者外周血嗜堿性粒細胞CD62L、BAFF和CD40L表達變化及意義

馮永民，陳秋萍，黃柳濤，潘慶軍，劉華鋒

(廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 524001)

活動性系統性紅斑狼瘡患者外周血嗜堿性粒細胞CD62L、BAFF和CD40L表達變化及意義

馮永民，陳秋萍，黃柳濤，潘慶軍，劉華鋒

(廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 524001)

目的 探討活動性系統性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血嗜堿性粒細胞淋巴歸巢受體(CD62L)、B淋巴細胞活化刺激因子(BAFF和CD40L)表達變化及意義。方法 選取SLE患者57例，根據SLEDAI評分將SLE患者分為活動組(SLEDAI評分≥10分)29例和非活動組(SLEDAI評分<10分)28例，選取同期20例查體健康者作為對照組，應用流式細胞術檢測SLE患者和正常人外周血CD62L、BAFF和CD40L表達，并采用Spearman法分析其與血清Anti-dsDNA水平的相關性。結果 活動組與非活動組外周血CD62L表達水平均高于對照組(P均<0.05)，且活動組高于非活動組(P<0.05)?；顒咏M外周血BAFF和CD40L表達水平均高于對照組和非活動組(P均<0.05)；而非活動組與對照組BAFF和CD40L表達差異無統計學意義(P均>0.05)。SLE患者外周血嗜堿性粒細胞CD62L和CD40L表達與血清Anti-dsDNA抗體水平均呈正相關(r分別為0.34、0.36，P均<0.05)；而外周血嗜堿性粒細胞BAFF表達與血清Anti-dsDNA抗體水平無關(r=0.26，P=0.14)。結論 活動性SLE患者外周血CD62L、BAFF和CD40L表達升高，嗜堿性粒細胞可能通過CD62L介導向次級淋巴器官遷移，通過BAFF和CD40L活化自身反應性B淋巴細胞而產生多種自身抗體,進而參與SLE的發病。

系統性紅斑狼瘡；嗜堿性粒細胞；嗜堿性粒細胞淋巴歸巢受體；B淋巴細胞活化刺激因子

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種多因素參與、累及多系統、多臟器的高度異質性的自身免疫性疾病，以產生多種高滴度自身抗體為顯著特點。目前SLE機體免疫功能異常的機制尚未完全明了，Th1/Th2失衡[1～3]、多克隆自身反應性B細胞的過度活化并伴以免疫負調節機制的缺損導致多種自身抗體產生[4]，被認為是SLE發病的重要機制。研究報道，嗜堿性粒細胞表面表達B淋巴細胞刺激因子(BAFF)[5]及CD40L[6]。BAFF在B淋巴細胞存活和分化中發揮重要作用。CD40L是B淋巴細胞活化的共刺激分子，能提供B細胞活化的第二信號。此外，有學者將嗜堿性粒細胞與B細胞共培養，發現培養上清中免疫球蛋白IgE及IgG4明顯增加[7]。嗜堿性粒細胞可通過增強Th2應答而活化B細胞或直接作用于B細胞而產生多種自身抗體，可能參與多種自身免疫性疾病的發病過程。2012年5月，我們檢測了57例SLE患者外周血嗜堿性粒細胞CD62L、BAFF和CD40L表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年5月～2013年3月廣東醫學院附屬醫院腎病內科確診的57例SLE患者，男7例、女50例，均符合美國風濕病學會1997推薦的SLE診斷標準。排除合并感染、過敏、合并其他自身免疫性疾病、腎功能受損(以血肌酐超過基礎值2倍以上)的患者。收集SLE患者的臨床資料和實驗室檢查數據，并計算患者SLE活動指數(SLEDAI),根據SLEDAI評分將SLE患者分為活動組(SLEDAI評分≥10分)29例(男3例，女26例)和非活動組(SLEDAI評分<10分)28例(男4例，女24例)，活動組與非活動組年齡分別為(26.8±10.1)、(31.6±8.7)歲。同時按照性別和年齡相匹配的原則選取健康志愿者20例(男4例，女16例)作為對照組，年齡(28.3±6.7)歲。

1.2 外周血嗜堿性粒細胞CD62L、BAFF和CD40L表達的檢測方法 采用流式細胞術。采集受試者清晨空腹外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝。取流式上樣管進行編號，每一例標本分為3管，依次為A、B、C管。在每一流式上樣管內加入4 mL現配的1×紅細胞裂解液，再加入200 μL EDTA抗凝外周靜脈血充分混勻，避光放置15 min。1 500 r/min(300 g)×6 min離心后棄上清液，加入細胞染色液2 mL，充分混勻，再次離心，去上清，加入細胞染色液100 μL重懸細胞。A 管為空白管，不加入任何抗體；B 管為同型對照管，加入與C管所加抗體等量的同種屬同型對照抗體；C管滴加熒光素標記的鼠抗人相應抗體各5 μL。各管均用震蕩器充分混勻，室溫避光孵育30 min。加染色液2 mL，離心，去上清，重復2次。滴加細胞染色液200 μL重懸細胞，流式檢測備用。加熒光標記抗體及之后的操作均在避光下進行。常規采用空白對照、同型對照試劑和熒光微球Flow Check對流式細胞儀進行調控，以熒光微球上機調定熒光變異系數值小于4%；各熒光素之間熒光補償調至標準值范圍內。根據前向散射角(FSC)和側向散射角(SSC)，對單個核細胞群進行設門，以SSC/CD203c 標記嗜堿性粒細胞。對熒光標記的細胞進行分析，以同型對照組為基準設門，確定嗜堿性粒細胞陽性表達位置。使用FCS Express軟件分析數據,以特異性標記物平均熒光強度(MFI)與相應同型對照MFI的差值，代表相應生物學指標的相對表達水平。 Anti-dsDNA采用ELISA法檢測(上?？菩律锛夹g股份有限公司)。

2 結果

2.1 外周血嗜堿性粒細胞流式細胞術定位 外周血嗜堿性粒細胞主要分布于單個核細胞群，更接近于淋巴細胞群。

2.2 各組外周血CD62L表達比較 非活動組、活動組、對照組外周血CD62L表達水平分別為261.3(154.8，352.0)、322.5(279.0，444.4)、129.0(107.5，174.0)，三組間比較，P均<0.05。

2.3 各組外周血BAFF和CD40L表達比較 非活動組、活動組、對照組外周血BAFF表達水平分別為102.0(37.9，217.3)、220.5(99.2，280.6)、106.0(51.0，153.0)，CD40L表達水平分別為78.0(53.7，140.0)、146.0(109.5，240.5)、84.5(37.0，281.5)，活動組與另外兩組BAFF和CD40L表達比較，P均<0.05；對照組與非活動組BAFF和CD40L表達比較，P均>0.05。

2.4 外周血嗜堿性粒細胞CD62L、CD40L及BAFF表達與SLE患者血anti-dsDNA抗體水平的關系 SLE患者外周血嗜堿性粒細胞CD62L和CD40L表達與血清Anti-dsDNA抗體水平均呈線性正相關(r=0.340，P=0.015；r=0.360，P=0.017)；而外周血嗜堿性粒細胞BAFF表達與血清Anti-dsDNA抗體水平無線性相關關系(r=0.260，P=0.140)。

3 討論

SLE是典型的自身免疫性疾病，以自身反應性T、B細胞異?；罨岸喾N自身抗體產生為特點，常伴有多個組織器官損傷。研究發現，嗜堿性粒細胞參與天然免疫、獲得性免疫、免疫平衡調節等[8]，但在SLE發病中的作用，至今少見文獻報道。嗜堿性粒細胞參與過敏反應已被熟知[9]，近年有關嗜堿性粒細胞在天然免疫、獲得性免疫、免疫平衡調節等方面的研究取得較大進展[8]。在免疫調節方面，嗜堿性粒細胞表面表達高水平的IgE受體FcεRI，通過與抗原特異IgE交聯，或其他的活化途徑，能產生Th2型細胞因子如IL-4和IL-13[10]。研究[11～13]發現，堿性粒細胞可通過MHC Ⅱ分子參與抗原提呈，在體內介導Th0向Th2細胞分化[13,14]而增強體液免疫應答[15]。Charles等[16]報道，蛋白酪氨酸激酶Lyn 缺陷(Lyn-/-)的老年小鼠外周血嗜堿性粒細胞能被自身反應性免疫復合物(IgE-CICs)活化后高表達膜性BAFF。

本研究中我們以外周血嗜堿性粒細胞為研究對象，應用流式細胞術檢測其CD62L、BAFF和CD40L表達，初步探討嗜堿性粒細胞在SLE發病中的作用。首先，我們應用流式細胞術明確嗜堿性粒細胞在流式外周血白細胞散點圖中的位置，結果顯示，外周血嗜堿性粒細胞主要分布于流式細胞術血細胞散點圖中單個核細胞群，更接近于淋巴細胞群，與國外研究報道一致[17,18]。

文獻報道，嗜堿性粒細胞表達黏附分子CD62L，CD62L是一種淋巴歸巢受體[16,19]。Martin等[20]在乳腺瘤病毒感染的BALB/c小鼠淋巴結中發現明顯的樹突狀細胞浸潤，而預先用anti-CD62L抗體處理后小鼠淋巴結浸潤的樹突狀細胞明顯減少，此提示樹突狀細胞向淋巴結的遷移依賴于CD62L的作用。同樣，CD62L可介導淋巴細胞通過高靜脈內皮細胞向次級淋巴組織器官遷移[21]。有研究報道，在以Th2應答為主的Lyn-/-SLE樣小鼠外周血嗜堿性粒細胞CD62L表達上調，同時在其脾臟和淋巴結均可見嗜堿性粒細胞浸潤[13]，提示CD62L可能介導外周血嗜堿性粒細胞向次級淋巴組織器官遷移。而本研究結果顯示，活動性SLE患者嗜堿性粒細胞CD62L表達高于非活動性SLE患者，提示外周血嗜堿性粒細胞CD62L表達與SLE病情活動有關，且高表達CD62L的活動性SLE患者嗜堿性粒細胞可能向次級淋巴細胞遷移。但基于倫理問題，本研究未能在SLE患者次級淋巴器官中檢測嗜堿性粒細胞的浸潤情況。此外，SLE患者外周血嗜堿性粒細胞CD62L表達高于正常人，且與血清抗-dsDNA抗體水平呈正相關，提示外周血嗜堿性粒細胞CD62L可能與SLE自身抗體的產生有關，參與SLE的病理生理過程。

自身抗體主要由SLE患者體內自身反應性B淋巴細胞異?；罨只癁闈{細胞而產生。文獻報道，嗜堿性粒細胞可延長漿細胞的存活，促進漿細胞產生更多免疫球蛋白IgG1及IgG2[22]。此外，有學者將嗜堿性粒細胞與B細胞體外共培養，發現培養上清中免疫球蛋白IgE及IgG4明顯增加[16]。研究報道，嗜堿性粒細胞表面表達BAFF[5]及CD40L[6]。過表達于樹突狀細胞的BAFF可促進漿母細胞的存活和漿細胞分化[23]。Mackay等[24]研究發現，BAFF轉基因小鼠可出現B細胞功能失常而呈現SLE樣綜合征。CD40L是B淋巴細胞活化的共刺激分子，與表達于B淋巴細胞表面的CD40相互作用，可提供B細胞活化的第二信號。本研究結果顯示，活動性SLE患者外周血嗜堿性粒細胞BAFF和CD40L表達均高于非活動性SLE及正常人，提示嗜堿性粒細胞BAFF和CD40L表達與SLE病情活動有關。最近，美國FDA批準Belimumab用于SLE的治療，該藥主要靶向BAFF，療效顯著[25,26]。其機制除了抑制B淋巴細胞活化，有可能亦清除了部分表達BAFF的嗜堿性粒細胞，從而控制SLE活動。此外，CD40L水平與血清抗-dsDNA抗體水平呈正相關，提示CD40L可能與自身抗體產生有關。因此，我們推測活動性SLE外周血嗜堿性粒細胞由CD62L介導向次級淋巴組織器官遷移，一方面通過BAFF作用延長自身反應性B淋巴細胞的存活，一方面通過CD40L活化自身反應性B淋巴細胞而產生多種自身抗體，從而參與SLE發病。

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Expression changes of CD62L, BAFF and CD40L in basophils of patients with systemic lupus erythematosus

FENGYongmin,CHENQiuping,HUANGLiutao,PANQingjun,LIUHuafeng

(AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China)

Objective To investigate expression changes of lymph homing receptor (CD62L) and B-lymphocyte activation factors (BAFF and CD40L) in peripheral blood basophils of patients with active systemic lupus erythematosus (SLE) and their significance. Methods Fifty-seven SLE patients were selected and were divided into the active group (SLEDAI score≥10,n=29) and inactive group (SLEDAI score <10,n=28) according to the SLEDAI score. Twenty healthy volunteers were selected as the control group. The levels of CD62L, BAFF and CD40L in the peripheral blood basophils were detected by flow cytometry and their correlations with the Serum anti-dsDNA levels were analyzed by Spearman correlation analysis. Results The expression of CD62L in peripheral blood basophils of the active group and inactive group was higher than that of the control group, and the active group was significantly higher than the inactive group (P<0.05). The expression of BAFF and CD40L in peripheral blood basophils of the active group was significantly higher than that of the inactive group and control group (allP<0.05), while there was no significant difference between inactive group and control group (P>0.05). Expression of CD62L and CD40L in the peripheral blood basophils was positively correlated with serum anti-dsDNA levels in SLE patients (r=0.34,r=0.36; allP<0.05). The expression of BAFF in peripheral blood basophils was not related with serum anti-dsDNA levels in SLE patients (r=0.26,P=0.14). Conclusions Expression of CD62L, BAFF and CD40L in basophils of patients with active SLE increases. CD62L may mediate the basophils migrating to the secondary lymph organs where the basophils could activate the self-reactive B-lymphocytes producing diverse antibodies through BAFF and CD40L to participate in the pathogenesis of SLE.

systemic lupus erythematosus; basophil; CD62L; B-lymphocyte activation factors

國家自然科學基金資助項目(81202346)；廣東省自然科學基金項目(S2012040006216)；廣東省醫學科學技術研究基金項目(A2015520)。

馮永民(1978-)，男，碩士，副主任醫師，主要研究方向為免疫性腎小球疾病發病機制。E-mail:fymcqp@163.com

劉華鋒(1969-)，男，博士，教授，博士生導師，主要研究方向為免疫性腎小球疾病發病機制。E-mail:hf-liu@263.net

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.006

R593.24

A

1002-266X(2017)09-0020-04

2016-11-20)