乳腺浸潤性導管癌組織中Pin1、CyclinD1蛋白表達變化及意義

鐘鳴，劉英霞，翁劍華，趙文麗

(惠州市第一人民醫院，廣東惠州516003)

乳腺浸潤性導管癌組織中Pin1、CyclinD1蛋白表達變化及意義

鐘鳴，劉英霞，翁劍華，趙文麗

(惠州市第一人民醫院，廣東惠州516003)

目的 觀察Pin1和CyclinD1蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達并探討其臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測108例乳腺浸潤性導管癌和30例正常乳腺組織石蠟切片中Pin1和CyclinD1蛋白表達，分析二者表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系。結果 Pinl蛋白在正常乳腺組織中不表達，在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，微弱表達時胞核少許輕微著色，過表達時胞核和胞質均著色。Pinl蛋白在55.6%(60/108)乳腺浸潤性導管癌患者癌組織中呈陽性或強陽性表達。Pin1蛋白表達與患者組織學分級、淋巴結轉移有關(P均<0.05),而與年齡、腫瘤大小、臨床分期無關(P均>0.05)。CyclinD1蛋白在正常乳腺組織中不表達。CyclinD1蛋白在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，65例表達陽性，陽性表達率為60.2%。CyclinD1蛋白表達與淋巴結轉移有關(P<0.05),而與年齡、腫瘤大小、組織學分級、臨床分期無關(P均>0.05)。在浸潤性導管癌組織中Pin1與CyclinD1蛋白表達呈正相關(r=0.224,P<0.05)。結論 Pin1和CyclinD1蛋白在浸潤性乳腺癌組織中呈高表達；二者可能在乳腺浸潤性導管癌侵襲和轉移中發揮作用。

乳腺浸潤性導管癌；Pin1蛋白；CyclinD1蛋白；免疫組織化學

肽基脯氨酰順反異構酶Pin1是一種高度保守的、特異性多肽脯氨?；樂串悩嬅?，能特異性地識別和結合磷酸化蛋白質的絲/蘇氨酸-脯氨酸基序，并催化其發生順反異構，然后調控諸多細胞周期蛋白的構象，從而調節細胞的增殖與分化。最近國外大量研究發現，Pin1過表達與腫瘤發生發展有關，其可直接或間接與CyclinD1相互作用而調節細胞周期。雖然在各種腫瘤發病機制中的作用尚存在爭議，但進一步研究Pin1作用將為各種腫瘤的病因、預防和治療提供新的思路和方法。2016年12月，我們采用免疫組化法對乳腺浸潤性導管癌組織中Pin1及CyclinD1蛋白表達進行檢測，同時分析二者表達與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2011年4月～2013年3月的108例乳腺浸潤性導管癌患者手術切除標本或粗針穿刺活檢標本制成的蠟塊，患者年齡28～66歲。送病理前均未進行任何治療。乳腺癌病理學分型及組織學分級參照2010年乳腺癌WHO 分類和分級標準。腫瘤直徑≥3 cm者70例；組織學分級Ⅰ+Ⅱ級52例，Ⅲ級56例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期70例；淋巴結轉移57例。選取同期30例份正常乳腺組織作對照，年齡38～64歲。

1.2 Pin1及CyclinD1蛋白表達檢測 采用免疫組化Envision法。一抗分別為濃縮型兔抗人Pinl多克隆抗體(美國Santa Cruz公司，SC-15340，工作濃度1∶300)；濃縮型兔抗人CyclinD1單克隆抗體(ZA-0101，工作濃度1∶50)；二抗和顯色檢測系統均為DAKO Envision檢測試劑套盒。試劑均購自上?；蚩萍加邢薰?。用已知的Pin1、CyclinD1陽性切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。標本均經10%中性甲醛固定8～12 h，常規石蠟包埋，3 μm厚連續切片，常規二甲苯脫蠟和梯度乙醇至水后，pH值9.0 Tris-EDTA微波修復20 min，3%過氧化氫水溶液阻斷10 min，浸洗PBS 5 min×3次，一抗室溫孵育1 h，浸洗PBS 5 min×3次，二抗室溫孵育30 min，浸洗PBS 5 min×3次，在顯微鏡下控制DAB顯色3～5 min，蘇木素復染2 min，1%鹽酸乙醇分化數秒，飽和碳酸鋰水溶液返藍數秒，梯度乙醇脫水透明，中性樹膠封片。在盲法下，每張切片選擇5個高倍視野，每高倍視野計數100個瘤細胞，由2名病理醫師獨立計數，取平均值進行分析。Pin1陽性染色位于胞核，過表達時胞核胞質均著色。CyclinD1蛋白定位于胞核。Pin1和CyclinD1免疫組化檢測結果判斷標準[1]：A染色強度分級：無染色者計0分，可見淡黃色顆粒計1分，較多棕黃色顆粒計2分，大量棕黃色顆粒計3分；B陽性細胞數分級：陽性細胞率<1%計0分，陽性細胞率1%～33%計1分，陽性細胞率34%～66%計2分，陽性細胞率≥67%計3分；隨后根據兩項的積分對結果進行判定：積分數=A×B。當A×B<3分時判為低水平表達，計為陰性(-)；當A×B≥3分時判為高水平或過表達，計為陽性(+)。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，Pin1和CyclinD1蛋白的相關性分析采用Spearman法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺浸潤性導管癌組織中Pin1、CyclinD1蛋白表達及其與患者臨床病理特征的關系 Pin1蛋白在正常乳腺組織中不表達，在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，微弱表達時胞核少許輕微著色，過表達時胞核和胞質均著色。Pin1蛋白在55.6%(60/108)乳腺浸潤性導管癌患者癌組織中呈陽性或強陽性表達。Pin1蛋白表達與患者組織學分級、淋巴結轉移有關(P均<0.05),組織學分級級Ⅰ+Ⅱ級陽性表達率為55.8%，Ⅲ級為55.4%；淋巴結轉移者陽性表達率為68.4%，無淋巴結轉移者陽性表達率41.2%。Pin1蛋白表達與年齡、腫瘤大小、臨床分期無關(P均>0.05)。CyclinD1蛋白在正常乳腺組織中不表達。CyclinD1蛋白在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，65例表達陽性，陽性表達率為60.2%。CyclinD1蛋白表達與淋巴結轉移有關(P<0.05),淋巴結轉移者陽性表達率為74.1%，無淋巴結轉移者陽性表達率44.0%。CyclinD1蛋白表達與年齡、腫瘤大小、組織學分級、臨床分期無關(P均>0.05)。

2.2 Pin1和Cyclin D1蛋白表達的相關性分析 在Pin1表達陽性的60例乳腺癌中有42例CyclinD1表達表達陽性，在Pin1表達陰性的48例乳腺癌中有25例CyclinD1表達陰性，二者在乳腺癌中的表達呈正相關(r=0.224,P<0.05)。

3 討論

肽基脯氨酰異構酶Pin1使磷酸化絲/蘇氨酸-脯氨酰鍵發生異構化，這種異構化在調節細胞動態平衡中發揮關鍵作用。Pin1通過其氨基末端的WW結構域與磷酸化絲/蘇氨酸-脯氨酸結合及其羧基末端PPIase域催化中間的肽鍵發生順反異構化，最終導致其底物的構象發生變化[2]。Pin1誘導構象變化磷酸化后調控諸多蛋白質的功能，包括催化活性水平，磷酸化狀態，蛋白質相互作用，亞細胞定位，蛋白質的穩定性[3]。Tao等[4]報道，Pin1本身不是致癌基因，但其可能是致癌信號傳導過程中一個不可缺少的翻譯器和放大器。Pin1特異性識別磷酸化絲/蘇氨酸-脯氨酸的基序和調節磷酸化位點的構象，這可能激活腫瘤發生過程中多條致癌信號通路。因此，Pin1的功能多態性在生物學上可能是癌癥的重要病因學[5]。本研究結果提示，Pin1在正常乳腺組織中不表達或呈微弱表達，而在乳腺癌組織中呈高表達。Pin1低表達時主要定位于細胞核，高表達時胞漿胞核均會著色，此與文獻報道相似[6]。因Pin1本身不含有胞核定位信號，主要通過WW區域和底物相互作用定位于細胞內，因細胞狀態不同而異。同時，Pin1過表達與組織學分級、淋巴結轉移相關,而與年齡、腫瘤大小、臨床分期無明顯相關性。這可能是因Pin1靶底物近30種，參與調解細胞多個進程。據文獻報道，Pin1放大諸多致癌信號傳導途徑，抑制多種腫瘤抑制基因，促進乳腺癌細胞的血管生成和轉移[7]。本研究結果提示Pin1過表達可能促進乳腺癌生長，但由于樣本量有限，結論可能存在一定偏差，有待進一步擴大樣本予以證實。

Pin1是由酵母雙雜交篩選出的一種功能蛋白，主要調節有絲分裂相關蛋白酶，對細胞周期發揮重要的調節作用。周期素中的CyclinD1是細胞周期成分中與腫瘤有直接關系的癌基因[8]。Pin1的靶蛋白有20多種，其中研究最多的就是CyclinD1，CyclinD1作為G1期細胞周期相關蛋白其基因和編碼蛋白的異常在腫瘤發生發展中扮演重要角色。研究表明，CyclinD1是Pin1作用的重要靶蛋白之一，Pin1不僅可從轉錄水平促進CyclinD1轉錄，而且還能通過誘導CyclinD1從胞核移至胞漿降解，進而引起CyclinD1過表達，促進乳腺上皮細胞轉化增殖。本研究結果顯示，Pin1在正常乳腺組織中不表達，僅在乳腺癌組織中著色。在Pin1過表達的60例乳腺癌中42例合并有CyclinD1高表達，而在Pin1低表達的48例乳腺癌中僅有25例CyclinD1陰性表達，與此同時CyclinD1表達還與淋巴結轉移有關。Wang等[9]報道在腫瘤發生癌變過程中，Ras信號和CyclinD1過表達起關鍵作用，Pin1過表達后上調CyclinD1蛋白表達并激活其啟動子。此外，Pin1通過激活JNK或致癌的Ras與c-Jun結合，使絲氨酸63/73-脯氨酸磷酸化?？傊?，Pin1無論是激活Ras還是JNK，均是為提高CyclinD1啟動子c-Jun的轉錄活性。Pin1在前列腺癌[10]、鼻咽癌[11]、宮頸癌[12]等亦上調CyclinD1表達。Pin1可能直接或間接與CyclinD1相互作用而調節細胞周期，參與腫瘤的發生發展?；赑in1在正常乳腺組織和在乳腺癌組織中的表達水平差異，故有可能通過檢測 Pin1過表達來實現腫瘤的早期診斷。Pin1在多種腫瘤中高表達說明其可用作腫瘤標記的參考指標，其表達與腫瘤的臨床病理因素、腫瘤預后等的關系有待后續深入研究。

綜上所述，Pin1和CyclinD1蛋白在浸潤性乳腺癌組織中呈高表達；二者可能在乳腺浸潤性導管癌侵襲和轉移中發揮協同作用。

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惠州市科技局研究項目(0039107150321045)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.018

R737.9

B

1002-266X(2017)09-0055-03

2016-11-15)