納豆激酶液態發酵生產的研究進展

吳燕，李英波，梁向峰，劉會洲，肖建輝

1(遵義醫學院附屬醫院，醫藥生物技術研究所，貴州 遵義，563003)2(中國科學院過程工程研究所，中國科學院綠色過程與工程院重點實驗室，北京，100190)3(中國科學院青島生物能源與過程研究所，中國科學院生物基材料重點實驗室，山東 青島，266101)

納豆激酶液態發酵生產的研究進展

吳燕1,2，李英波2*，梁向峰3，劉會洲2，肖建輝1*

1(遵義醫學院附屬醫院，醫藥生物技術研究所，貴州 遵義，563003)2(中國科學院過程工程研究所，中國科學院綠色過程與工程院重點實驗室，北京，100190)3(中國科學院青島生物能源與過程研究所，中國科學院生物基材料重點實驗室，山東 青島，266101)

納豆激酶(EC 3.4.21.62)是一種具有強大溶栓活性的絲氨酸蛋白酶。與臨床一線溶栓藥物(尿激酶和鏈激酶)相比，納豆激酶具有安全性好、成本低、半衰期長和可口服等優點，作為溶栓藥物或保健食品備受關注。納豆激酶主要通過固態和液態發酵生產來制備，但現有生產能力偏低，遠不能滿足市場需求。文中從高產納豆激酶的菌株選育、培養基優化、發酵條件優化和培養方式等4個方面對近年來相關研究進行了綜述，以期為納豆激酶的生產和應用提供支持。

納豆激酶；微生物；液態發酵；溶栓藥物

血栓性疾病嚴重危害人類健康，其發病率和死亡率居各種疾病之首。據統計，目前全世界每年約有1 700萬患者死于血栓性疾病，且仍呈高發態勢，預計到2020年，該病導致的死亡人數將達到每年2 500萬[1]。我國每年進行溶栓治療的患者超過300萬[2]。因此，高效溶栓藥物的研制備受關注。目前臨床上常用的溶栓藥物如尿激酶、蚓激酶和纖溶酶原激活劑等存在副作用大、價格昂貴、半衰期短等缺點。相比之下，微生物源纖溶酶，具有可口服、安全、高效、持久和廉價等優勢，而日益引起人們的重視。在眾多已報道的微生物纖溶酶中，納豆激酶(EC 3.4.21.62)以其強大的溶栓效果備受青睞。納豆激酶是1987年日本學者SUMI[3]從日本傳統發酵食品納豆中發現的一種具有顯著纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，由納豆枯草桿菌(Bacillussubtilisnatto)產生。隨后，研究人員在中國豆豉、韓國發酵豆制品等發酵食品中也發現了該酶。1992年日本學者NAKAMURA[4]首次對納豆激酶基因aprN進行了克隆并對包含調控序列的1 473 bp的基因序列全長進行了測定。該酶的分子量為27.7 kDa，是由275個氨基酸殘基組成的單鏈多肽酶，在pH 7～12的范圍內具有強大的纖維蛋白溶解活性[3,5]。藥理研究表明，納豆激酶不但可以直接水解交聯纖維蛋白，而且可以激活體內的尿激酶原轉變成為尿激酶，刺激血管內皮細胞產生組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，間接地通過降解和失活尿激酶和t-PA的抑制劑pAI-1，發揮溶解纖維蛋白的作用[6-8]。此外，納豆激酶具有抗胰酶水解的能力，在胃腸道中具有良好的穩定性，且可被腸道上皮吸收進入血液循環[9-10]，因此可以通過口服來發揮溶栓作用。除了上述的溶抗栓功效，納豆激酶還對高血壓、阿爾茨海默癥和玻璃體視網膜病變等疾病具有良好的療效[11]。

傳統上，納豆激酶均是經過固態發酵獲得。目前商業化生產的納豆激酶固態發酵工藝多基于日本納豆的發酵工藝，發酵基質也是以黃豆為主。通過固態發酵的納豆激酶產品可以作為發酵食品食用，也可通過進一步分離提取制備不同級別的納豆激酶類產品(如納豆膠囊和納豆激酶膠囊)。目前，商業化應用的固態發酵工藝的納豆激酶活性一般能達到 20～100 FU/g[12]。然而，大規模固態發酵生產中存在物料滅菌不徹底，生產周期長，生物量濃度、pH、濕度等各項參數指標不易在線檢測，散熱、發酵調控及發酵終點等問題未能得到很好的解決，嚴重影響菌體的生長和酶的產量，并導致不同批次的產量差異大，生產效率低。相比之下，液態發酵具有傳質均勻，發酵過程檢測技術成熟、可控，能夠實現自動連續化和易于放大等優勢。因此研究人員轉而探索液態發酵生產的方法。在過去的20年中，盡管國內外有關納豆激酶液態發酵的研究已有許多報道，但發酵產量相對較低。課題組對納豆激酶液態發酵的方法和策略進行了歸納和總結，并對該領域存在的問題進行探討，期望為納豆激酶的高效生產和廣泛應用提供參考。

1 高產納豆激酶菌株的選育

1.1 傳統誘變育種

傳統誘變育種的方法由于操作簡單、突變率高、變異譜廣等的優點，目前仍是最為常用的育種方法。MOHANASRINIVASAN等[13]將芽孢桿菌菌株SFN01的菌落懸浮于PBS緩沖液中，并在波長254 nm的紫外線下分別照射2.5、5、7.5、10 min。誘變后的突變菌株培養后，經硫酸銨沉淀發酵液上清得到納豆激酶樣品。用Holmstorm法測定樣品活性，經過紫外誘變5 min和10 min的突變菌株，表現出了比出發菌株SFN01更高的納豆激酶活性。余功保[14]將納豆芽孢桿菌懸液均勻涂布于瓊脂平板，用紫外燈照射篩選到了比原始菌株酶活力高的43個菌株，進一步篩選得到了產納豆激酶最高的BSN-3菌株，誘變后的納豆激酶酶活為1 120 IU/mL，比原始菌株的酶活提高了313%。

離子注入法是指通過離子束轟擊菌種孢子，將離子注入孢子內，經過生化反應后離子取代DNA和RNA堿基中的離子，改變堿基的分子基團，從而使部分基因改變達到基因突變的方法。離子注入法兼有輻射誘變和化學誘變的特點，且同時存在能量傳遞、動量交換、離子沉積和電荷積累過程，可引起細胞遺傳物質發生非致死性局部突變。其損傷輕、突變譜廣、誘變效果顯著，被廣泛地應用于微生物誘變育種[15]。常用于誘變的離子有N+、H+、Ar+等，其中N+的誘變效率最高。高宏[16]將出發菌株枯草芽孢桿菌培養至對數期得到菌體懸浮液，然后涂布于無菌圓形培養皿內。將培養皿放入低能加速器的靶室內，進行N+注入誘變(能量20 keV，射入劑量(30～200)×2.6×1013ion/cm2)。隨后經過酪蛋白瓊脂平板初篩、搖瓶復篩和傳代，獲得1株高產的枯草芽孢桿菌XZ1125，比原始菌株的酶活力提高了160%。張勇[17]用N+作為誘變劑，以致死率為80%的誘變劑量作為最佳劑量，獲得了高產納豆激酶的地衣芽孢桿菌，其纖溶酶活力達到了1 210 IU/mL，比出發菌株提高了50.13%。這些研究結果表明，使用離子注入的誘變方法篩選菌株，可極大地提高篩選效率，更易于得到特異性強的高產菌株。

60Co-γ射線是一種高能電磁波，可通過γ射線高能量產生電離作用，直接或間接改變DNA的結構，達到基因突變的目的。該操作方法具有高突變率和寬突變譜的特點。李淑英等[18]用60Co-γ 射線誘變納豆激酶生產菌BSNK-5，考察不同輻照劑量下對菌株正突變率的影響，得出在輻照劑量800 Gy的條件下，正突變率最大，高達45%。共得到了11株活性提高的納豆激酶突變菌株。

在誘變過程中，由于使用一種誘變劑對基因的誘變作用位點有限，可能只作用于單一的位置，誘變效果“鈍化”，使正突變率下降。因此使用不同誘變機制的誘變劑交替處理，可提高變異率。關志煒[19]將枯草芽孢桿菌納豆亞種NT-6的菌懸液用含適宜濃度的鹽酸羥胺液體種子培養基誘變，再進行紫外誘變，得到了1株突變菌株，比出發菌株的產酶能力提高了68%。不同的誘變手段可能對DNA的作用位點不同。實驗中用鹽酸羥胺和紫外線這兩種誘變方式處理，可能引起NT-6基因組上的不同位點的突變，從而使復合誘變起到協同效應。WANG等[20]以枯草芽孢桿菌LD-8作為出發菌株，首先采用紫外線誘變，篩選出具有較高纖溶活性的突變體枯草芽孢桿菌LD-85，再進一步用NTG(N-甲基-N′-亞硝基-亞硝基胍)對LD-85進行誘變。經瓊脂平板篩選，得到具有較高活性的突變菌株LD-854。最后將1mL的枯草芽孢桿菌LD-854的細胞懸浮液用60Co-γ射線輻射誘變。通過UV、NTG和60Co-γ射線復合誘變的方法，最終獲得了纖溶活性為3 980 IU/mL的突變菌株LD-8547，比起始菌株高出約190%。進一步檢測其穩定性，顯示經過連續生長4代后，其高產量特征是穩定的。由此可見，誘變選育對于高產量菌株篩選是行之有效的。然而，相關誘變機制的研究卻尚未開展。因此，加強這方面的研究將對高效獲得高產納豆激酶的生產菌株起到極大的促進作用。

1.2 分子育種

隨著分子生物技術的發展，構建高效生產納豆激酶的工程菌也成為了一種提高酶產量的有效方法[21]。自從日本學者NAKAMURA[4]首次克隆納豆激酶的基因aprN以來，使得利用基因工程技術提高納豆激酶產量和活性成為了可能。目前，已有多例納豆激酶基因的克隆并表達在各種宿主中的報道。表達宿主包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、乳酸乳球菌和草地貪夜蛾昆蟲細胞等[11,22-24]。武漢大學的CAI等[25]首次利用直接進化的方法，分別對來自不同芽孢桿菌中的3個同源基因同源重組產生1個基因突變庫，經過同源重組和高通量篩選后，突變體的納豆激酶催化活性比野生型高2.3倍。WEI等[26]為了在地衣芽胞桿菌中提高納豆激酶的活性和產量，構建了敲除載體，利用載體敲除10個編碼胞外酶基因、鞭毛蛋白基因和淀粉酶基因。在此基礎上，研究了不同信號肽對提高納豆激酶活性的作用，使最高酶產量達到33.83 FU/mL。CHEN[27]通過金黃色葡萄球菌質粒pUB110與大腸桿菌質粒pUC18融合構建穿梭載體，并用于在枯草芽孢桿菌中表達納豆激酶，使重組的納豆激酶產量提高了2倍以上。WANG等[28]構建了多重基因缺失突變體LM2531，抑制了細胞裂解，顯著增加了枯草芽孢桿菌的生物量和重組蛋白的產生。與野生菌株相比，工程菌株LM2531產生分泌的納豆激酶增加了2.6倍。劉北域[29]采用堿性蛋白酶缺陷型工程菌為表達宿主，減少了發酵液中與納豆激酶性質相近的雜蛋白，這不僅提高了重組納豆激酶的產量，而且縮短了其分離純化流程，降低了成本。經分離純化后，每升發酵液可產100 mg純度為95%的納豆激酶，其比活性達到12 000 IU/mg。由于分子育種的方法傳遞遺傳信息量較大，目的性強，是選育菌種的有效手段，值得推廣應用。

2 培養基優化

2.1 碳源和氮源的影響

碳源和氮源是微生物生長以及各種初級和次級代謝最主要的營養成分。碳源為微生物的生長代謝提供必需的能量，氮源則是構成蛋白和核酸等生物大分子的重要組成部分。LIU[30]考察了5種碳源(葡萄糖、麥芽糖、木糖、甘油、蔗糖)和6種氮源(大豆蛋白胨、豆渣、硫酸銨、硝酸鈉、谷氨酸鈉、酪蛋白)對枯草芽孢桿菌生長及對納豆激酶合成的影響。結果表明，對于納豆激酶的生產，最佳的碳源和氮源分別為麥芽糖和大豆蛋白胨。隨后通過中心復合設計(CCD)和響應曲面法(RSM)，確定了最佳培養基成分和用量。優化后的培養基使納豆激酶活性達到1 300 IU/mL，比初始培養基提高了6倍。BERENJIA等[31]利用中心復合面設計實驗，研究了碳源和氮源對納豆枯草芽孢桿菌發酵生產納豆激酶的影響。結果提示，用6%酵母提取物，1.2%大豆蛋白胨和6%甘油組成的優化培養基發酵獲得納豆激酶活性為587 IU/mL。其中甘油作為碳源顯著促進了細胞密度的增加，而大豆蛋白胨，酵母提取物及其混合物作為有效的氮源，促進了納豆激酶的生物合成。這種協同效應主要是由于其提供了對細胞代謝和酶合成至關重要的必需氨基酸。DEEPAK等[32]采用響應面法和中心復合旋轉設計(CCRD)研究了培養基中4個變量葡萄糖、蛋白胨、CaCl2和MgSO4對枯草芽孢桿菌生產納豆激酶的影響。結果分析表明，只有蛋白胨對納豆激酶產量有顯著影響。優化后的培養基生產納豆激酶，產量比初始水平提高了2倍，達到了3 194.25 IU/mL。

基于降低發酵生產成本，利用低廉的食品工業副產品或農業廢棄物作為生產納豆激酶的培養基，引起人們極大的關注。KU等[33]利用色拉油生產中的副產物脫脂大豆作為氮源，價格低廉的葡萄糖作為碳源。通過RSM優化，確定了產納豆激酶的最優培養基組成為脫脂大豆29.3 g/L，葡萄糖17.5 g/L，按體積質量系數4%的接種密度，納豆激酶的產量達到13.78 SU/mL。WANG等[34]嘗試利用蝦殼廢棄物作為唯一的碳源和氮源對假單胞菌(Pseudomonassp. TKU015)發酵，結果發現蝦殼廢棄物可以作為該菌生長和生產納豆激酶的培養基。隨后，該研究組發現蝦殼廢棄物也可用于枯草芽孢桿菌TKU007生產納豆激酶，并最終純化獲得活性為27.5 FU/mg的納豆激酶[35]。

以上研究結果表明，不同的菌種對碳源和氮源的偏好不同，所以針對不同菌株進行碳源和氮源的優化十分必要。另外，中心復合設計、響應曲面設計、Plackett-Burman和Box-Behnken等實驗設計方法[36-38]的應用可以同時對各種不同的碳氮源進行快速、有效的優化，獲得適合菌株產酶的最佳條件。

2.2 無機鹽的影響

除了碳源和氮源兩種主要的培養基成分外，一些金屬離子，如鈣、鉀、鈉、鎂、鋅等無機鹽對微生物的生長代謝同樣具有必不可少的作用。例如，磷是核酸和蛋白質必不可少的成分，在代謝途徑的調節中起著重要的作用；鎂可作為某些酶的輔因子或激活劑，調節酶的活性；硫是某些輔酶的活性劑和含硫氨基酸的成分；錳可促進芽孢的生成；鈣是某些胞外酶的穩定劑；鈉離子可刺激枯草芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶的分泌[39]。在培養基中添加金屬離子在一定程度上能夠促進納豆激酶的合成。

謝秋玲[40]通過正交試驗比較了CaCl2、MgSO4、MnCl2、K2HPO4、KH2PO4和Na2HPO4對納豆菌產納豆激酶的影響，發現Ca2+對酶的產量影響最大。在不添加Ca2+的情況下，產酶量較低。這說明Ca2+有利于納豆激酶的合成，但作者未對相關的機理作進一步研究。Mg2+的添加對酶合成的影響不大，可能是由于菌株對其需求量較少，氮源大豆蛋白胨中存在一定量的Mg2+，已經滿足了細菌的需求。Mn2+不利于產酶，是否因為其影響芽孢的生成尚待考察。最終優化后的條件，使納豆激酶的產量達到了759 IU/mL。LIU等[30]也發現培養基中Ca2+的存在可以促進納豆激酶的合成。CHEN等[41]在基因重組枯草芽孢菌株WB700/pU4-NAT2的培養基中添加10 μmol/L含10種不同金屬離子[Al2(SO4)3, CoCl2, CuCl2,MnCl2, NiCl2, Na2MoO4, FeCl2, CaCl2,MgCl2和ZnSO4]的混合物，使納豆激酶的產量增加了2.2倍。作者推斷，由于納豆激酶在從胞內向胞外分泌的過程中，納豆激酶被結合在細胞膜上，引起了反饋抑制作用，使納豆激酶的合成受到限制；而金屬離子的添加取代了納豆激酶和細胞膜結合，使納豆激酶順利分泌至胞外，胞內得以繼續合成納豆激酶。雖然這些推測有一定的道理，但是作者缺乏有力的證據。此外，由于作者添加的是混合離子，難以說明到底哪種離子在發揮作用?？傊?，研究發現不同的金屬離子對細胞的生長和納豆激酶的產量有不同的影響，但是它們的影響機制尚有待深入研究。

3 發酵條件優化

液體發酵的條件主要包括溫度、裝液量、初始pH值、接種量、轉速和溶氧等。影響納豆激酶產量的主要發酵條件有pH，發酵溫度和溶氧。

3.1 pH

pH既可以影響菌體的生長，也可以影響納豆激酶的生產。朱向輝[42]詳細研究了在培養基pH為6.0～10.0的條件下，納豆芽孢桿菌的生長和產酶情況。結果表明，適宜細胞生長和產酶的初始pH值分別為pH9.0和pH7.0。偏酸性的條件既不利于菌體生長，也不利于產酶。RASAGNYA[43]在搖瓶中考察了初始pH對納豆枯草桿菌發酵生產納豆激酶的影響。結果表明，pH7.5時納豆枯草桿菌的產酶量最高，pH值高于或低于pH7.5，均不利于產酶。由此可見，培養基pH條件中性或近中性是適合納豆激酶發酵生產的。

3.2 溫度

任何微生物都有最佳的生長溫度范圍，但此溫度不一定是目標代謝物最適合的生產溫度。在某些情況下，利用變溫控制策略(即在不同發酵階段采取不同溫度)可以提高產量。謝秋玲[40]研究了30～45 ℃范圍納豆枯草桿菌的生長和產酶過程，發現較高溫度(40 ℃)有利于細菌生長，而產酶的最佳溫度為35 ℃。熊曉輝等[44]考察了發酵溫度在25～35 ℃范圍內對枯草芽孢桿菌生產納豆激酶的影響，結果表明在30 ℃時酶產量最高，達到了2 000 IU/mL，比35 ℃時提高了大約40.86%。王正剛等[45]研究的Bacillusnatto6 菌株在發酵溫度為 37 ℃的條件下產生的納豆激酶活性最高?？偟膩碚f，對枯草芽孢桿菌而言，其生產納豆激酶的合適范圍一般在30～37 ℃。

3.3 溶氧

納豆激酶生產菌屬于好氧菌，在納豆激酶發酵生產過程中，溶氧對納豆激酶的產量影響很大。王萬春等[46]在250 mL的搖瓶中考察了在相同的轉速下，不同體積的裝液量(15、20、25、30、35、40 mL)對納豆激酶發酵生產的影響，結果發現產酶量隨著裝液量的增加而降低，當裝液量為15 mL時，酶產量為890.73 IU/mL，而當裝液量提高至40 mL時，酶產量下降了23%。這表明，溶氧對酶產量有著顯著的影響，溶氧降低，酶產量也隨之下降。UNREAN等[47]通過構建枯草芽孢桿菌反應網絡模型，定量研究了無氧和有氧條件下枯草芽孢桿菌的產酶情況，發現氧是納豆激酶合成的決定性因素。上述結果提示，在納豆激酶的發酵生產過程中，通過溶氧水平的調節，將有可能大幅度提高酶的產量。相比于優化培養基，目前有關溶氧對納豆激酶合成影響的研究較少，且缺乏系統性，有必要加強溶氧或氧供應方面的研究。

4 培養方式

培養方式可對細胞生長和產物的產量造成顯著的影響。目前，納豆激酶的生產主要有分批培養和補料分批培養兩種方式。

CHO等[48]在篩選氮源的基礎上，考察了培養方式對納豆激酶產量的影響。研究表明, 采用補料分批培養策略，以培養基中的pH變化為指標來判斷補料時間，使葡萄糖濃度始終維持在1g/L的條件下，在發酵的第19 h時，納豆激酶產量達到7 100 IU/mL，是分批培養的酶產量的2.1倍。隨后，該研究組利用pH-stat分批補料的培養方式，當發酵液pH由于葡萄糖的消耗而高于pH7.0時開始加入葡萄糖和蛋白胨的濃縮混合溶液，最后納豆激酶活性達到14 500 IU/mL，比分批培養提高了4.3倍[49]。祝亞嬌等[50]以構建的產納豆激酶的地衣芽胞桿菌工程菌為研究對象，在5 L的發酵罐考察了分批培養和補料分批培養對納豆激酶產量的影響。結果發現，當以0.25 mL/min的速率補加質量濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液時，納豆激酶的產量比不補料時提高了13%，說明補加適當質量濃度的葡萄糖有利于納豆激酶的合成，與前面的報道相一致。但其補加氮源卻對酶的產量無影響，這與前人的結果不同。作者認為一方面可能是由于他們的研究中所用發酵培養基中氮源是充足的，故不需補加；另一方面可能由于他們的研究中所用基因工程菌與野生菌存在差異，氮源對工程菌分泌納豆激酶并不是關鍵因素。由此可見，適當的補料策略對納豆激酶產量的提高是有益的。

5 展望

自從納豆激酶及其強大的溶栓活性被發現以來，其廣泛應用于醫藥、食品和保健品行業，市場需求日益增加。雖然目前國內外針對菌株選育、培養基、發酵條件、基因工程等方面已展開了大量的研究，但是仍然存在納豆激酶產量和酶活偏低等問題。此外，對整個納豆激酶發酵過程代謝調控的研究還相對較少，對影響納豆激酶產量、生產效率和生物過程放大等因素的研究還不夠深入。因此，應對以下幾個方面的問題進行更為深入的研究：(1)納豆激酶生物合成的機理及代謝調控；(2)影響發酵過程關鍵因素的作用機理；(3)發酵放大的關鍵因子的確定及放大規律；(4)發酵過程中多層次、多水平的系統生物學。

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Researchprogressofliquidfermentationofnattokinase

WU Yan1,2,LI Ying-bo2*,LIANG Xiang-feng3, LIU Hui-zhou2, XIAO Jian-hui1*

1(Institute of Medicinal Biotechnology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, China)2(Key Laboratory of Green Process and Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)3(Key Laboratory of Bio-based Material, Chinese Academy of Sciences, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Qingdao 266101, China)

Nattokinase(EC3.4.21.62)is a kind of serine proteinase that has potent thrombolytic activity. Compared to the first-line thrombolytic drugs(urokinase and streprokinase), nattokinase possesses several advantages such as safety, low cost, long half-life and easy oral administration. Therefore, nattokinase has been receiving increasing attention for its use as thrombolytic agent or health care product.The solid and liquid fermentation sare usually employed for the nattokinase production.However, the fermentation titer of nattokinase is still poor, and can meet the requirement of the market. In this review, the strain breeding, medium optimization, fermentation conditions optimization, and culture mode of nattokinase have been outlined and summarized, which would provide valuable reference for the industrial production and application of nattokinase.

nattokinase; microorganism; liquid fermentation; thrombolytic drug

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014789

碩士研究生(李英波副研究員，肖建輝教授為通訊作者,E-mail:ybli@ipe.ac.cn; jianhuixiao@126.com)。

中國科學院綠色過程與工程實驗室青年基金(GPE-2013-3)；貴州省高層次創新型人才支撐計劃(QKH-RC-20154028)；國家自然科學基金(81460156)

2017-05-17，改回日期2017-07-05