IgG型抗登革病毒NS1抗體介導被動系統性過敏反應的研究①

郭勇暉 朱 偉 王艷芳 丁細霞 陳政良 富 寧

(南方醫科大學基礎醫學院免疫教研室，廣州510515)

IgG型抗登革病毒NS1抗體介導被動系統性過敏反應的研究①

郭勇暉 朱 偉②王艷芳②丁細霞②陳政良 富 寧②

(南方醫科大學基礎醫學院免疫教研室，廣州510515)

目的：明確登革病毒Ⅰ型(Dengue virus serotype 1,DENV1)非結構蛋白1(Non-structure protein 1， NS1)與其IgG型抗體的免疫復合物(Immune complexes，ICs)能否誘導機體產生被動系統性過敏反應(Passive systmic anaphylaxis，PSA)，為闡明登革出血熱與登革休克綜合征(DHF/DSS)的發病機制提供依據。方法：從本課題組現有的多株抗NS1單克隆抗體中，篩選能夠與純化NS1結合并形成免疫復合物進而誘導小鼠產生被動系統性過敏反應(PSA)和被動皮膚過敏反應(Passive cutaneous anaphylaxis，PCA)的單抗或單抗組合；并觀察體內氯化釓(GdCl3)和血小板活化因子受體(PAFR)拮抗劑CV-3988處理對PSA的影響。結果：用親和層析純化的DENV1 NS1，從本室制備的20株IgG型抗DENV1 NS1單抗中僅篩選出2組單抗組合制備免疫復合物(NS1-IgG ICs)能成功誘導小鼠的PCA和PSA反應，而其他抗體或抗體組合并無此反應；用GdCl3抑制單核巨噬細胞或CV-3988阻斷PAFR處理可抑制或減輕小鼠PSA反應。結論：DENV1 NS1結合兩個IgG型單抗組合的免疫復合物可誘發PSA與PCA，但并非所有的抗NS1單抗或抗體組合與NS1結合都能誘發PSA，推測與識別表位不同有關；初步證明DENV1 NS1-IgG ICs 誘發PSA的主要效應細胞是巨噬細胞，主要效應分子是PAF。

IgG；NS1；免疫復合物；被動系統性過敏反應(PSA)；登革休克綜合征；被動皮膚過敏反應(PCA)

已知受到登革病毒感染威脅的全球人群近39億，每年感染患者達5千萬～1億，重癥患者約50萬人[1-4]。我國南方近年感染率增高，僅廣東省2014年就達45 000例[5]。登革感染的主要臨床表現是自限性的登革熱(Dengue fever,DF)，其中的重癥感染如登革出血熱與登革休克綜合征(DHF/DSS)約占DF患者的5%～10%[6]，發生率雖低但死亡率高。但重癥登革的發病機制尚未完全闡明。目前對致命性的DSS已有大量研究并提出若干可能的原因，如抗體依賴增強效應(ADE)[7]，細胞因子風暴[8]，補體依賴的細胞毒[9]反應等。近年，IgG而不是IgE抗體引發的過敏性休克研究備受關注，我們推測過敏性休克可能是導致DSS原因之一。因此，我們的關注點是非結構蛋白1(NS1)與其IgG型抗體結合形成的免疫復合物是否能夠引起休克。因重癥登革患者的血清動力學恰恰具備抗NS1的IgG抗體介導過敏休克反應的條件，即血清中含有較高濃度的NS1蛋白及相應的IgG抗體水平[10-12]。鑒于國際上僅有個別實驗室具有可感染登革的特殊成年小鼠，本文擬通過小鼠模型明確純化天然DENV1 NS1蛋白與其IgG型抗體的免疫復合物能否誘導機體產生PSA，并初步揭示PSA反應的主要效應細胞與效應分子，為闡明DHF/DSS的發病機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10 周齡的SPF級雌性BALB/c小鼠，購自南方醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 試劑 DENV1(Hawaii株)由本實驗室保存；Vero細胞由武漢病毒所惠贈；胎牛血清(FBS)、MEM培養基和慶大霉素購于美國Life technologies公司；一次性0.22 μm濾器、超濾膜夾購自美國Merck Millipore；CNBr-activated Sepharose 4B購自美國GE公司；預染蛋白相對分子量標準購自美國Thermo Fisher Scientific；ECL 底物購自美國BioRad；GdCl3、PAFR拮抗劑CV-3988購自美國Sigma-Aldrich；20株抗DENV NS1 IgG型單克隆抗體均由本實驗室制備[13,14]。其他所用試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 DENV1感染濃縮上清制備 Vero細胞用含10%FBS和50 μg/ml慶大霉素的MEM培養基置37℃培養至細胞密度約80%，PBS洗滌細胞3遍，然后用含DENV1病毒的無血清MEM培養基于34℃感染2 h，去上清并加入含2%FBS的MEM培養基，34℃培養4 d后收獲上清，12 000 r/min離心30 min后經0.22 μm濾器過濾，取上清，通過超濾系統濃縮5～10倍(Labscale System，美國Merck Millipore)，即為DENV1感染濃縮上清。

1.2.2 親和層析純化DENV1 NS1蛋白 用DENV NS1高親和力單抗3B1交聯溴化氰活化的Sepharose 4B制備親和層析柱[15]， DENV1濃縮上清以1 ml/min 低速通過親和柱2次，充分洗滌后，堿洗脫并中和收集DENV1 NS1蛋白。蛋白純度及免疫反應性用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE及Western blot鑒定；純化蛋白濃度用BCA法定量。

1.2.3 以DENV1 NS1-IgG ICs構建小鼠PSA模型 IgG型DENV1 NS1抗體以單株抗體(100 μg)或以兩株組合(50 μg+50 μg)抗體分別與DENV1 NS1純化蛋白(10 μg)混合(以生理鹽水配成200 μl總體積)，37℃孵育30 min形成免疫復合物(NS1-IgG ICs)，經尾靜脈注射BALB/c小鼠，并用數字體溫儀(Mode BAT-12,美國 Physitemp)測定攻擊后0～90 min內小鼠直腸溫度的變化，用于評估過敏性休克的嚴重程度。

1.2.4 用NS1-IgG ICs構建小鼠PCA模型 以DENV NS1小鼠單抗或抗體組合20 μg與DENV1 NS1 5 μg混合，于37℃孵育30 min形成的免疫復合物直接注射小鼠足墊，5 min后經尾靜脈注射200 μl含0.5% 伊文氏蘭的生理鹽水，5 min后觀察小鼠足掌藍染程度。

1.2.5 GdCl3對NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA的影響 分別以每只小鼠尾靜脈注射1 mg(總體積200 μl)GdCl3，以等體積生理鹽水為對照，每個實驗組3只小鼠，重復2次)，24 h后按1.2.3步驟利用NS1-IgG ICs構建小鼠PSA模型，并觀察GdCl3對NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA的影響。

1.2.6 PAF受體(PAFR)拮抗劑對NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA的影響 分別以200 μg CV-3988(含5%乙醇，總體積200 μl 生理鹽水)或等體積生理鹽水靜脈注射小鼠，30 min后觀察NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA效果。

1.3 統計學處理 所有數據采用SPSS13.0分析，結果中各組間小鼠直腸溫變化采用重復測量數據的方差分析。

2 結果

2.1 純化DENV1 NS1蛋白的純度及免疫反應性 對獲得的純化DENV1 NS1蛋白進行SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定，上樣蛋白分別進行100℃加熱10 min或不加熱處理，SDS-PAGE結果顯示DENV1 NS1蛋白在未加熱處理時大小約100 kD，加熱變性后約48 kD，可見加熱變性處理后形成單體結構，不加熱處理的蛋白為二聚體結構，條帶位置與預期結果相符(圖1A)。 Western blot鑒定結果顯示，兩種處理后的蛋白條帶均可以與DENV1 NS1特異性單抗3B1反應(圖1B)，證明所獲純化蛋白具有天然結構。

2.2 NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA 用20株單抗或抗體組合與NS1蛋白制備ICs進行小鼠體內攻擊，結果顯示：只有5D25+3B1和5D25+3C65這兩個抗體組合分別與不同濃度DENV1 NS1蛋白形成各組免疫復合物，分別靜脈攻擊BALB/c小鼠能誘導PSA反應，結果見圖2，可見其PSA反應程度與DENV1 NS1蛋白濃度相關。5D25+3B1的效果略優于5D25+3C65組合。值得注意的是這兩個抗體組合均可在體外形成雙抗體夾心ELISA，提示該特征有助于抗體Fc段在體內與巨噬細胞表面FcγR結合形成交聯(cross-linking)。

圖1 純化DENV1 NS1蛋白的SDS-PAGE及Western blot 鑒定Fig.1 Identification of purified DENV1 NS1 protein by SDS-PAGE and Western blot

圖2 NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA模型的建立Fig.2 Establishment of PSA model by challenge with NS1-IgG ICsNote: A.NS1-IgG ICs formed by DENV1 NS1 with mAb 5D25 and 3B1;B.NS1-IgG ICs formed by DENV1 NS1 with mAb 5D25 and 3C65.

圖3 NS1-IgG ICs誘導小鼠PCAFig.3 Establishment of PCA model by challenge with NS1-IgG ICs

2.3 NS1-IgG ICs可誘導小鼠PCA 以5D25+3B1和5D25+3C65抗體組合分別與DENV1 NS1蛋白形成免疫復合物，并皮下注射小鼠兩足墊，以生理鹽水為對照，5 min后給予小鼠靜脈注射200 μl含0.5% 伊文氏蘭-生理鹽水，可見注射NS1-IgG ICs后的小鼠足掌出現明顯的藍染即血漿滲透現象，而另一只注射生理鹽水的足掌則無此效應(圖3)，證明NS1-IgG ICs可誘導小鼠PCA反應。而其他單抗或單抗組合均無此反應，提示NS1-IgG ICs誘導PSA與PCA是平行的。

2.4 GdCl3處理對NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA的影響 應用GdCl3預處理小鼠24 h后用NS1-IgG(5D25+3B1)ICs觸發小鼠PSA反應，結果顯示GdCl3處理可以明顯抑制甚至完全消除小鼠的PSA反應(圖4)。已知GdCl3可以抑制單核巨噬細胞[16]，由此提示單核巨噬細胞是NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA反應的主要效應細胞。

圖4 GdCl3對NS1-IgG(5D25+3B1)ICs誘導小鼠PSA的影響Fig.4 Effects of GdCl3 on PSA induced by NS1-IgG(5D25+3B1)ICsNote: **.P<0.01,comparing with control group.

圖5 PAFR拮抗劑CV-3988對NS1-IgG(5D25+3B1)ICs誘導小鼠PSA的影響Fig.5 Effects of antagonists CV-3988 on PSA induced by NS1-IgG(5D25+3B1)ICsNote: **.P<0.01,comparing with control group.

2.5 PAF拮抗劑CV-3988對NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA的影響 如圖5所示，用PAF拮抗劑CV-3988 處理可以顯著減輕NS1-IgG(5D25+3B1)ICs誘導小鼠PSA反應，提示PAF是NS1-IgG ICs誘導小鼠PSA反應的主要效應分子。

3 討論

本研究擬通過IgG型抗NS1單克隆抗體或抗體組合與NS1抗原形成的免疫復合物從而誘發小鼠被動系統性過敏反應(PSA)，揭示重癥登革休克綜合癥(DSS)可能的發生機制。實驗結果證實兩個IgG型單克隆抗體組合即5D25+3B1和5D25+3C65可以誘發PSA與被動皮膚過敏反應(PCA)。進而以能引起小鼠肛溫顯著下降的NSl-IgG(5D25+3B1)免疫復合物(ICs)，建立NS1-IgG ICs觸發PSA模型，用GdCl3和PAF拮抗劑CV-3988初步證明此PSA反應的效應細胞是單核巨噬細胞，主要效應分子是PAF。

以往人們多關注再次感染不同血清型登革病毒時的抗體依賴增強作用(Antibody-dependent enhance,ADE)，尤其是登革E蛋白抗體或抗病毒多克隆血清的ADE作用，認為是ADE促進了病毒的大量復制而加重病情[7,17,18]。本研究結果顯示IgG型抗NS1抗體結合NS1可以導致被動過敏休克，恰恰臨床重癥登革熱的血清動力學表現具備了存在高水平NS1與抗NS1 IgG型抗體的條件[10-12]，提示NS1-IgG免疫復合物引發過敏性休克是重癥登革休克可能的發病機制之一。

我們采用的注射ICs誘導被動過敏休克反應是基于本課題組用36組抗原-抗體反應誘導PSA的前期工作[19],證明提前3 h注射單抗后注射抗原與直接注射ICs效果基本相同，PCA反應也是如此。因此本次直接采用了體外制備NS1-IgG ICs。前期工作曾證實并非所有特異性相同的單克隆抗體或抗體組合都能誘發PSA，而是需要兩個不同抗體分子識別抗原分子上的不同表位，或兩個單一抗體識別抗原分子上的重復表位，這樣其Fc段才有可能與FcγR形成交聯進而引發生物學效應?；谇捌谘芯康慕涷?，我們從20株單抗或單抗組合中只篩選到兩個抗體組合5D25+3B1和5D25+3C65，成功地誘導出PSA與PCA，其他8株抗體及6個抗體組合均未能成功。5D25、3B1和3C65這三株單抗單獨使用時均不能誘導PSA與PCA。它們構成兩個組合的另一特點是能夠在體外組成兩個雙抗體夾心ELISA，提示我們在尋找能夠誘導PSA抗體組合的時候可將能否形成雙抗體夾心ELISA作為初篩標準，我們前期36個抗原-抗體反應體系中19個能在體外形成雙抗體夾心ELISA的抗體或抗體組合中有14個能夠誘導PSA[19]。與我們制備的多株單抗比較，登革DSS患者血清含針對NS1不同表位的多克隆抗體，只要有足夠的IgG抗體與NS1濃度就似乎具備了誘導PSA的基本條件。我們推測DSS發生率極低，除在NS1蛋白高峰期能否具備高水平IgG抗體這個必需條件外，也許與特定表位是否是誘導該抗體反應的優勢表位有關。本實驗室制備并保存了149株針對不同血清型特異性及交叉反應的登革NS1的單克隆抗體[13,14,20]，有條件在后續工作中繼續去鑒定這些抗體與抗體組合并確定有關表位。

至于NS1-IgG ICs引發的PSA是否依賴補體，因暫時沒有補體缺陷動物而未能證實，但我們前期工作曾用補體第三成分(C3)敲除小鼠證實用卵黏蛋白(OVM)及其單抗誘導的PSA反應與野生型無區別，即這種IgG介導的PSA是補體非依賴性的[21]。

為明確NS1-IgG ICs誘導PSA的效應細胞與主要效應分子，我們用抑制單核巨噬細胞的經典方法GdCl3處理小鼠，證實巨噬細胞是NS1-IgG ICs誘導PSA的主要效應細胞。我們前期工作曾用抗Mar-1、anti-Gr1抗體、GdCl3、毒性脂質體(Clodronate liposome，氯磷酸鹽脂質體)、環磷酰胺分別清除BALB/c與C57BL/6兩種小鼠嗜堿粒細胞、中性粒細胞及單核/巨噬細胞或阻斷其功能，發現清除嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、單核細胞等各類血細胞對OVM-IgG 單抗誘導的PSA的發生與嚴重程度無明顯影響，只有GdCl3和毒性脂質體分別清除巨噬細胞才顯著抑制PSA反應。為確認該現象是否具有普遍性，我們又用5種不同的抗原-IgG抗體復合物誘導經毒性脂質體處理的小鼠并獲得同樣結果。證明巨噬細胞是IgG誘導被動過敏途徑的主要效應細胞。本研究只用GdCl3處理BALB/c小鼠，其抑制效果極為顯著，幾乎是完全抑制，這與我們的前期工作相符。

此外，已知登革病毒可在體外刺激單核細胞產生PAF[22]，而PAF受體敲除小鼠或給予PAR受體阻斷劑能減輕小鼠感染表現以及降低死亡率[23]。也有報道PAF 在人類 IgG 抗體所介導的過敏反應中發揮關鍵作用[24]，本研究以 PAF受體拮抗劑 CV-3988 阻斷體內PAF的功能，顯著減輕了NS1-IgG ICs所誘發的PSA反應，結果說明PAF是NS1-IgG ICs誘發PSA反應的主要效應分子，阻斷PAF也可能是治療重癥登革的策略與藥物研發思路之一。

當然，重癥登革(DHF/DSS)的發生機制是復雜、多因素的，基于我們的149株抗NS1單抗，我們還發現了少數單抗可以結合人和家兔血小板(未發表)。本研究僅是初步提供了認識DSS形成機制的一種可能性，因受限于國內無登革感染成年小鼠模型，尚未能進行體內感染實驗以模仿體內NS1及NS1抗體動力學與形成PSA的關系。

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[收稿2016-12-30]

(編輯 倪 鵬)

IgG antibodies against Dengue virus non-structure protein 1 mediate passive systemic anaphylaxis in mice

GUOYong-Hui,ZHUWei,WANGYan-Fang,DINGXi-Xia,CHENZheng-Liang,FUNing.

DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515,China

Objective:To ascertain whether the immune complexes(ICs) formed by Dengue virus 1 non-structure protein 1(DENV1 NS1)and its IgG antibodies could mediate passive systemic anaphylaxis(PSA) and to explain the pathogenesis of Dengue hemorrhagic fever or Dengue shock syndrome(DHF/DSS).Methods: The monoclonal antibodies(mAbs) or mAb cocktails from 20 IgG mAbs of DENV1 NS1 prepared in this lab were screened to initiate PSA and passive cutaneous anaphylaxis(PCA) in mice.Meanwhile,the effects of GdCl3and platelet activating factor(PAF) antagonist CV-3988 on PSA induced by the NS1-IgG ICs were observed.Results: Two groups of monoclonal antibody cocktails with purified NS1 were proved to be capable of provoking PCA and PSA in mice,whereas the other mAbs or mAb cocktails could be not.The murine PSA initiated by NS1-IgG(5D25+3B1) ICs could be significantly inhibited by in vivo treatment with GdCl3or PAF antagonist CV-3988.Conclusion: The NS1-IgG ICs formed with DENV1 NS1 and IgG mAb cocktails can mediate PSA and PCA,but not all of ICs formed by DENV1 NS1 mAbs or mAb cocktails with DENV1 NS1 can induce PSA,indicating that it may be related to the special epitopes of DENV1 NS1.The monocyte/macrophages and PAF may be as major effector cells and the major mediator for PSA induced by NS1-IgG ICs,respectively.

IgG；NS1；Immune complexes；Passive systemic anaphylaxis(PSA)；Dengue shock syndrome；Passive cutaneous anaphylaxis(PCA)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.004

①本文為國家自然科學基金委員會-廣東省人民政府聯合基金資助項目(U1132002)。

郭勇暉(1984年-)，男，碩士，主管技師，主要從事急性傳染病病原微生物診斷及感染機制方面研究，同時就職于南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部，E-mail:kink1984@163.com。

及指導教師：陳政良(1957年-)，男，博士，教授，主要從事天然免疫及免疫性疾病方面的研究，E-mail：zhlchen@fimmu.com。

R373.3+3

A

1000-484X(2017)03-0338-05

②南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部，廣州 510515。