DAPT調節Treg/Th17細胞免疫平衡抑制動脈粥樣硬化①

楊敬寧 張 素 羅羽莎 陳 俊

(湖北醫藥學院免疫學教研室，十堰442000)

DAPT調節Treg/Th17細胞免疫平衡抑制動脈粥樣硬化①

楊敬寧 張 素 羅羽莎 陳 ?、冖?/p>

(湖北醫藥學院免疫學教研室，十堰442000)

目的：觀察Notch信號抑制劑分泌酶抑制劑(γ-DAPT)對動脈粥樣硬化小鼠病理改變及Treg/Th17細胞免疫平衡的影響。方法：將24只ApoE 基因敲除C57BL小鼠隨機分為空白組、模型組和DAPT組?？瞻捉M用普通飼料飼養，模型組和DAPT組用高脂飼料飼養。飼養5 周后，DAPT組小鼠以100 mg/(kg·d)皮下注射 DAPT(溶于DMSO中)，其余兩組皮下注射等量DMSO。5 周后，采用病理染色分析各組小鼠動脈病理改變，ELISA檢測血漿中IL-17水平，采用流式細胞術檢測各組小鼠脾臟Treg/Th17細胞比例。結果：HE染色結果顯示，模型組有明顯粥樣斑塊形成和泡沫細胞形成，DAPT組動脈病變程度比粥樣動脈硬化模型組明顯減輕。正常組、模型組和DAPT組各組血漿中IL-17水平分別為(293.94±28.59)、(454.05±172.68)和(335.40±89.57)pg/ml；DAPT降低AS小鼠血漿IL-17水平(P<0.05)?？瞻捉M、模型組和DAPT組各組小鼠Treg 細胞百分比分別為(3.80± 0.56)%、(2.54± 0.38)%和(4.73± 0.64)%；DAPT降低AS小鼠血漿IL-17水平(P<0.05)?？瞻捉M、模型組和DAPT組各組小鼠Th17細胞亞群分別為(3.46±0.23)%、(4.52±0.85)%和(1.38±0.37)%。結論：DAPT降低AS小鼠血漿IL-17的水平，抑制Th17細胞亞群分化，而促進Treg細胞分化，通過改變Treg/Th17細胞免疫平衡從而減輕動脈粥樣硬化。

動脈粥樣硬化；Notch 信號；DAPT；流式細胞術

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病的主要病理學基礎，是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因。越來越多的證據表明AS是慢性炎癥性疾病，固有免疫和獲得性免疫炎癥機制參與了此疾病的發展和發生過程[1,2]。研究發現T細胞失衡在AS致病過程中發揮了重要作用，其中調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)和輔助性T細胞17(Th17)尤為重要。

Notch信號途徑決定細胞分化、增殖和凋亡，同樣，參與T細胞的分化調控。(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨?；?L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(N-(N-[3,5-difluorophenacetyl]-L-alanyl)-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT)為Notch信號下游分子γ-分泌酶的抑制劑，可抑制Notch 信號通路。本研究探索Notch 通路抑制劑DAPT對AS 病變的影響及對AS 小鼠Treg/Th17平衡的影響，為AS 治療和預防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ApoE基因敲除C57BL 小鼠24 只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級，雌性，5～6周齡，體重15 g，飼養于湖北醫藥學院動物中心。

1.1.2 試劑 DAPT購自Selleck公司，離子霉素(Ionomycin,Ion)、佛波酯(Phorbol myristatr,PMA)，莫能霉素(Monesin)自Sigma公司，小鼠CD3、CD4、CD25、Foxp3、IL-17等抗體購自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 建立AS小鼠動物模型 ApoE基因敲除C57BL小鼠共24只，隨機分組?？瞻捉M使用普通飼料飼養，模型組和DAPT組使用高脂飼料(含2%膽固醇及10%豬油)飼養5周。從第6 周開始，空白組和模型組均接受隔天皮下注射DMSO 140 μl/只；DAPT組接受隔天皮下注射10 mmol/L DAPT 160 μl/只(DMSO 溶解)。注射時長為5周。

1.2.2 IL-17 的檢測 ApoE基因敲除C57BL小鼠于第10周采集眼球靜脈血，分離血漿于-80℃冰箱保存備用。應用酶聯免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組小鼠外周血上清中IL-17的濃度。外周血離心后收集的上清，采用預包被ELISA kit 檢測IL-17的表達水平，參照說明書進行具體操作，最后經酶標儀在450 nm處讀取吸光度值，并在標準曲線上計算其濃度值。

1.2.3 病理染色分析動脈病理改變 小鼠于第10周麻醉后，顯微鏡下分離主動脈，將取出的材料放入多聚甲醛4%中固定2～4 h后移至30%蔗糖中4℃冰箱保存過夜。經固定后，常規石蠟包埋，4 μm切片。常規方法行HE染色，于光學顯微鏡下拍照分析。

1.2.4 脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞FACS檢測 取脾臟研磨獲得細胞懸液，利用小鼠淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法得到單個核細胞。取1×106單個核細胞用100 μl PBS重懸，加入CD4和CD25抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，反應后洗滌，再加入1 ml的固定、穿膜劑，混勻后室溫避光15 min，反應后洗滌，加入100 μl穿膜劑重懸細胞，再加人20 μl Foxp3抗體，室溫避光孵育30 min，洗滌細胞后加入300 μl冷PBS重懸細胞，應用FACS Calibur型流式細胞儀檢測。

1.2.5 脾臟Th17細胞FACS檢測 取脾臟研磨獲得細胞懸液，利用小鼠淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法得到單個核細胞。取1×106單個核細胞懸液，加入離子霉素(1 μg/ml)、和PMA(100 ng/m1)，混勻后37 ℃、5% CO2條件下孵育，1 h后加入莫能霉素(1 μl/ml)繼續培養，5 h后離心收集細胞，100 μl PBS重懸，分別加入20 μl 的CD3和CD4抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，反應后洗滌，再加入200 μl的固定、穿膜劑A，混勻后室溫避光15 min，反應后洗滌，加入100 μl固定、穿膜劑B重懸細胞，再加人20 μl IL-17抗體，室溫避光孵育30 min，洗滌細胞后加入300 μl冷PBS重懸細胞，應用FACS Calibur型流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 小鼠主動脈形態及病理改變 HE染色結果顯示，空白組(圖1A)動脈內膜連續完整，模型組(圖1B)與空白組相比動脈內膜不規則增厚，AS斑塊明顯向管腔內突起，周圍纖維組織也逐漸增多，并在斑塊表面形成纖維帽，具有典型脂質核心，脂質核心區和纖維帽浸潤于散在的炎性細胞中，內皮下間隙大量巨噬細胞源性泡沫細胞聚集，泡沫細胞體積大，胞質呈空泡狀，動脈中膜平滑肌細胞穿增生并攝取脂質，內膜隆起及變形，粥樣斑塊形成。DAPT組(圖1C)動脈病變程度比粥樣動脈硬化模型組明顯減輕，動脈內膜沒有增厚，亦沒有大量泡沫細胞聚集，但血管內皮明顯脫落。

2.2 DAPT對動脈粥樣硬化小鼠血漿IL-17的影響 為明確干預Notch信號通路是否影響Th17細胞分泌細胞因子IL-17的水平，我們應用ELISA方法檢測培養上清中IL-17的水平。正常組、模型組和DAPT組各組血清中IL-17水平見圖2，分別為(293.94±28.59)、(454.05±172.68)和(335.40±89.57)pg/ml，模型組與正常組相比，血清IL-17水平明顯升高(P<0.05)，DAPT組與模型組相比，血清IL-17水平明顯降低(P<0.05)。由此可見IL-17參與了AS炎癥發生，DAPT抑制Notch信號通路降低AS小鼠血清IL-17的水平。

圖1 小鼠主動脈病理形態改變(H&E染色，×200)Fig.1 Pathological changes of aorta in mice(H&E,×200)Note: A.Blank group;B.Model group;C.DAPT group.

圖2 各組小鼠IL-17水平Fig.2 Plasma level of IL-17 in each group of miceNote: A.Blank group;B.Model group;C.DAPT group.

2.2 DAPT對動脈粥樣硬化小鼠脾臟Treg/Th17細胞平衡的影響 為明確Notch信號通路在動脈粥樣硬化小鼠Treg/Th17細胞失衡中的作用，應用流式細胞術檢測各組中小鼠脾臟Treg/Th17細胞亞群的變化。結果如圖3所示：空白組、模型組和DAPT組小鼠Treg 細胞百分比分別為(3.80± 0.56)%、(2.54± 0.38)%和(4.73± 0.64)%。DAPT組與空白組和模型組相比，Treg細胞百分比明顯升高(P<0.05)，說明通過DAPT 抑制Notch 信號通路能夠調節動脈粥樣硬化小鼠Treg亞群變化。

空白組、模型組和DAPT組各組小鼠Th17細胞亞群分別為(3.46±0.23)%、(4.52±0.85)%和(1.38±0.37)%，模型組與空白組相比，Th17細胞亞群明顯升高(P<0.05)，DAPT組與模型組相比，Th17細胞亞群明顯降低(P<0.05)，提示通過DAPT抑制Notch信號通路能夠降低動脈粥樣硬化小鼠Th17細胞比例。

3 討論

AS是一種常見慢性、漸進性動脈疾病，盡管對于AS的原因及發生機制有多種學說闡述[3-8]，但并未能真正完全闡明。近來研究表明[1,4]，炎癥在AS的脂質條紋的形成、病變到斑塊破裂整個過程都起著非常重要作用。在引起炎癥的細胞中，主要包括巨噬細胞、肥大細胞和T細胞。其中，T細胞最為關鍵，調控炎癥的主要是Th17細胞亞群和Treg，前者具有促進AS發展的作用，后者則能抑制其他免疫細胞的功能，發揮抑制免疫炎癥反應作用[9,10]。

Notch 基因編碼一類高度保守的細胞表面受體，通過相鄰細胞之間的相互影響決定細胞分化、增殖和凋亡[11]。哺乳動物Notch 受體包括四種(Notch 1-4)，其配體分為兩個家族：Jagged 家族(Jagged1,Jagged2)和Delta樣家族[12]。當配體與受體胞外區結合后，發生酶切，然后經γ-分泌酶進行組成性酶切，激活相關基因的表達。DAPT為γ-分泌酶抑制劑，能抑制Notch 信號傳遞。已發現ox-LDL 能顯著上調巨噬細胞中Notch1受體的表達，提示Notch 信號通路與動脈粥樣硬化有關[13]。研究表明，ox-LDL 通過TLR2、TLR4 活化巨噬細胞，并促進 Notch 配體Jagged1 快速表達，活化巨噬細胞，產生大量的促炎因子[14]。 研究表明Notch 信號參與調控Treg細胞分化和參與調節Treg細胞的增殖[15-19]，但也有研究報道阻斷Delta樣分子4介導的Notch 信號可促進Treg細胞的產生[20]。由此可見，不同的Notch配體結合不同的受體后轉導的Notch 信號產生的生物學效應不同。另一方面，許多研究表明Notch1 激活與人類和小鼠Th17 細胞分化有關，Delta樣分子1與Notch 3結合的信號促進Th17 、Th1細胞的分化[21，22]。近來研究表明，人樹突狀細胞高表達Delta樣分子4結合Notch 受體促進Th17 、Th1細胞的分化[23]。

本研究利用ApoE基因敲除C57BL小鼠制備AS模型，結果顯示AS小鼠較正常小鼠Treg細胞比例減少(P<0.05)，而AS小鼠血漿IL-17的水平和Th17細胞比例較空白對照組升高(P<0.05)。用DAPT抑制Notch 信號途徑干預AS小鼠后，Treg細胞比例增加(P<0.05)，而Th17 細胞比例和血漿IL-17的水平均減少(P<0.05)。上述結果表明，Notch 信號促進Th17 分化，抑制Notch 信號則抑制Th17 分化，這與以前研究報道結果一致[21-23]。同時，DAPT促進了Treg細胞比例增加。 本研究HE染色結果顯示，應用DAPT后，C57BL小鼠AS減輕，可能與DAPT降低Th17細胞比例和增加Treg細胞比例有關。

本研究發現AS小鼠IL-17的水平較空白對照組升高，而DAPT可以降低AS小鼠血清IL-17的水平，說明IL-17參與AS發病，這與以前研究結果一致[24，25]。IL-17參與AS的發生發展，是重要損傷因素之一，但同時有研究表明IL-17可有助于粥樣硬化斑塊穩定[26]，有一定保護作用。由于IL-17是Th17細胞特征性細胞因子之一，Th17細胞是IL-17的主要來源，因此，DAPT降低AS小鼠血漿IL-17的水平可能是其降低Th17細胞比例導致的結果。但是IL-17有多個來源，除了Th17細胞外，還包括γδ T細胞、肥大細胞和中性粒細胞[26]，所以，DAPT降低AS小鼠血漿IL-17的水平可能還有其他通路，有待于進一步研究。

[1] Ross R.Atherosclerosis--an inflammatory disease [J].N Engl J Med，1999,340(2):115-126.

[2] Wick G,Xu Q.Atherosclerosis--an autoimmune disease [J].Exp Gerontol，1999,34(4):559-566.

[3] Weissberg PL,Bennett MR.Atherosclerosis--an inflammatory disease [J].N Engl J Med，1999,340(24):1928-1929.

[4] Liuzzo G.Atherosclerosis:an inflammatory disease [J].Rays,2001,26(4):221-230.

[5] Davis NE.Atherosclerosis--an inflammatory process [J].J Insur Med,2005,37(1):72-75.

[6] Matsuura E,Atzeni F,Sarzi-Puttini P,etal.Is atherosclerosis an autoimmune disease? [J].BMC Med,2014,12:p47.

[8] Klingenberg R,Matter CM,Lüscher TF.Immune cells in atherosclerosis-good or bad? [J].Praxis(Bern 1994)，2016,105(8):437-444.

[9] Christian E,Lili C,Sultan C,etal.Pathogenic mechanisms of IL-17 in atherogenesis in vivo and in vitro studies [J].Circulation,2008,118(3):S310.

[10] Gao Q,Jiang Y,Ma T,etal.A critical function of Th17 proinflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice [J].J Immunol,2010,185(10):5820-5827.

[11] Artavanis-Tsakonas S,Rand MD,Lake RJ.Notch signaling:cell fate control and signal integration in development [J].Science，1999,284(5415):770-776.

[12] Foldi J,Chung AY,Xu H,etal.Autoamplification of Notch signaling in macrophages by TLR-induced and RBP-J-dependent induction of Jagged1[J].J Immunol,2010,185(9):5023-5031.

[13] Fu WB,Li M,Feng YB,etal.The effect of oxidised low-density lipoprotein on Notch expression in THP1 macrophages [J].Heart,2012,98:E2.

[14] Chávez-Sánchez L,Garza-Reyes MG,Espinosa-Luna JE,etal.The role of TLR2,TLR4 and CD36 in macrophage activation and foam cell formation in response to ox-LDL in humans [J].Hum Immunol,2014,75(4):322-329.

[15] Yvon ES,Vigouroux S,Rousseau RF,etal.Overexpression of the Notch ligand,Jagged-1,induces alloantigen-specific human regulatory T cells [J].Blood,2003,102(10):3815-3821.

[16] Fu T,Zhang P,Feng L,etal.Accelerated acute allograft rejection accompanied by enhanced T-cell proliferation and attenuated Treg function in RBP-J deficient mice[J].Mol Immunol,2011,48(5):751-759.

[17] Mota C,Nunes-Silva V,Pires AR,etal.Delta-like 1-mediated Notch signaling enhances the in vitro conversion of human memory CD4 T cells into FOXP3-expressing regulatory T cells[J].J Immunol,2014,193(12):5854-5862.

[18] Burghardt S,Claass B,Erhardt A,etal.Hepatocytes induce Foxp3 regulatory T cells by Notch signaling[J].J Leukoc Biol，2014,96(4):571-577.

[19] Kared H,Adle-Biassette H,Fo?s E,etal.Jagged2-expressing hematopoietic progenitors promote regulatory T cell expansion in the periphery through notch signaling [J].Immunity,2006,25(5):823-834.

[20] Bassil R,Zhu B,Lahoud Y,etal.Notch ligand delta-like 4 blockade alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis by promoting regulatory T cell development[J].J Immunol, 2011,187(5):2322-2328.

[21] Jiao Z,Wang W,Xu H,etal.Engagement of activated Notch signalling in collagen II-specific T helper type 1(Th1)-and Th17-type expansion involving Notch3 and Delta-like1[J].Clin Exp Immunol,2011,164(1):66-71.

[22] Keerthivasan S,Suleiman R,Lawlor R,etal.Notch signaling regulates mouse and human Th17 differentiation [J].J Immunol,2011,187(2):692-701.

[23] Meng L,Bai Z,He S,etal.The Notch ligand DLL4 defines a capability of human dendritic cells in regulating Th1 and Th17 differentiation[J].J Immunol, 2016,196(3):1070-1080.

[24] Jeon US,Choi JP,Kim YS,etal.The enhanced expression of IL-17-secreting T cells during the early progression of atherosclerosis in ApoE-deficient mice fed on a western-type diet [J].Exp Mol Med,2015,47:e163.

[25] Christian E,Roland K,Sultan C,etal.Inhibition of proinflammatory cytokine IL-17 reduces atheroscleroticllesion development in ApoE-/-mice[J].Circulation,2007,116(8):II145-II146.

[26] Gong F,Liu Z,Liu J,etal.The paradoxical role of IL-17 in atherosclerosis[J].Cell Immunol, 2015,297(1):33-39.

[收稿2016-10-11 修回2016-11-18]

(編輯 張曉舟)

DAPT regulates Treg/Th17 cells immune balance to inhibit atherosclerosis

YANGJing-Ning，ZHANGSu，LUOYu-Sha,CHENJun.

DepartmentofImmunology,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

Objective:To observe the effect of Notch signal inhibitor DAPT (γ-secretase inhibitor)on the pathological changes of atherosclerosis mice and the immune balance of Treg/Th17.Methods: 24 ApoE knockout C57BL mice were randomly divided into blank group,model group and DAPT group.The blank group were fed with normal diet,the model group and the experimental group were fed with high fat diet.After 5 weeks of feeding,the mice in the experimental group were injected with DAPT[100 mg/(kg·d)，resuspended in DMSO],and the other two groups were injected with the equivalent amount of DMSO.After another 5 weeks,pathological changes of the mice in each group were analyzed by HE staining.ELISA was used to detect the level of IL-17 in plasma,and the proportion of splenic Treg/Th17 cells in each group was detected by flow cytometry.Results: HE staining results showed that the model group had obvious plaque formation and foam cell formation,which showed that the AS model was successfully prepared.The degree of arterial disease in the DAPT group was significantly less than that in the model group.The plasma levels of IL-17 in the blank group,model group and DAPT group were(293.94± 28.59),(454.05± 172.68) and (335.40± 89.57) pg/ml，respectively .The percentages of Treg cells in the blank group,model group and DAPT group were(3.80± 0.56)%,(2.54± 0.38)% and(4.73± 0.64)%,respectively.The Th17 cell subsets of mice in the blank group,model group and DAPT group were (3.46±0.23)%,(4.52±0.85)% and (1.38±0.37)%，respectively .Conclusion: DAPT decreased the plasma level of IL-17 in AS mice,inhibited the differentiation of Th17 cell subsets,and promoted the differentiation of Treg,and reduced the atherosclerosis by changing the Treg/Th17 cells immune balance.

Atherosclerosis;Notch signal;DAPT;Flow cytometry

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.005

①本文受湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB650)和湖北省教育廳科學研究計劃(B2015495)資助。

楊敬寧(1971年-)，男，碩士，教授，主要從事心血管免疫的研究，E-mail:yangjjnn@163.com。

R541.4

A

1000-484X(2017)03-0343-04

②湖北醫藥學院附屬東風醫院心血管內科，十堰442008。

③通訊作者，E-mail：chenjun0121@126.com。