丹參酮ⅡA對樹突狀細胞表型的影響及對功能的調控

夏金華 夏建川 謝麗燕 廖傳英

(廣州衛生職業技術學院,廣州510450)

丹參酮ⅡA對樹突狀細胞表型的影響及對功能的調控

夏金華 夏建川①謝麗燕 廖傳英

(廣州衛生職業技術學院,廣州510450)

目的：提取小鼠骨髓樹突狀細胞(DCs)，體外給予丹參酮ⅡA干預，觀察藥物刺激后DCs功能的改變，從而探討丹參酮ⅡA在免疫系統中的作用機制。 方法：提取小鼠的骨髓DCs，體外給予10 ng/ml GM-CSF及IL-4的完全培養液培養，并在第5天，磁珠分選得到純度90%以上的樹突狀細胞，體外給予一定濃度的丹參酮ⅡA及LPS刺激，收集細胞及上清，運用流式細胞技術檢測DCs表型，ELISA方法檢測細胞上清TNF-α、 IL-12含量變化，同種混合淋巴細胞反應檢測樹突狀細胞刺激淋巴細胞增殖及分化的能力。 結果：在丹參酮ⅡA濃度為500 ng/ml時，藥物對DCs抑制作用達到最大，因此選取該濃度為實驗作用濃度；即在500 ng/ml作用下，實驗組與對照組相比，DCs表達MHCⅡ、CD86及CD80水平均顯著降低(P<0.05)；實驗組DCs分泌的TNF-α及IL-12含量均顯著降低(P<0.05)；實驗組DCs刺激淋巴細胞增殖反應能力明顯降低(P<0.05)；實驗組DCs刺激T淋巴細胞分泌IL-4含量明顯高于對照組，IFN-γ含量明顯低于對照組(P<0.05)。 結論：丹參酮ⅡA可以通過降低LPS誘導的DCs成熟狀態，來參與免疫系統或自身免疫性疾病的發生發展。

樹突狀細胞；丹參酮ⅡA；脂多糖；成熟

作為從中國中草藥丹參中的提取物，丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)在機體內具有多種藥理作用，包括改善體內微循環、清除體內自由基、抗癌抗氧化、抗菌消炎等[1]。鑒于其廣泛的藥物作用，在臨床與科研方面已開展了多種研究，尤其針對其調節免疫功能方面得到了高度的重視。已有研究將其應用于免疫疾病方面，取得了較大的進展。作為體內最重要的抗原提呈細胞，樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)在免疫系統及自身免疫性疾病中起著重要作用，其不同的成熟狀態可顯著影響疾病的進展[2]。因此，本研究提取小鼠骨髓DCs，體外給予丹參酮ⅡA刺激，觀察丹參酮ⅡA對DCs成熟功能的影響，從而從細胞領域探討丹參酮ⅡA的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57小鼠，雌性，8～10周，購于廣州省醫學實驗動物中心[合格證編號：SYXK(粵)2013-0085]。

1.1.2 實驗試劑 丹參酮ⅡA購于蓋德化工網，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)購于Sigma公司，重組細胞因子GM-CSF及IL-4購于Peprotech公司，CD11C磁珠購于美天旎公司，CD11C、MHCⅡ、CD86及CD80流式抗體購于eBioscience公司，細胞因子IL-12、TNF-α、IL-4、IFN-γ檢測試劑盒購于Biolegend公司，MTS細胞增殖試劑盒購于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 DCs的培養 頸椎脫位法處死小鼠，浸泡于75%酒精5 min，然后置于超凈臺操作。無菌操作下取出小鼠的股骨，用1 ml注射器抽取RPMI1640溶液沖洗股骨骨髓腔，收集沖洗液，離心，用RPMI1640溶液清洗，紅細胞裂解液常溫裂解3 min，再應用含10%血清的RPMI1640溶液中和裂解液，離心，RPMI1640清洗細胞備用。無菌條件下制備DCs完全培養基，即應用含10%血清的RPMI1640溶液并添加GM-CSF及IL-4細胞因子(使終濃度均為10 ng/ml)。將離心所得的細胞重懸于DCs完全培養基，置于CO2培養箱培養(即為第1天)。第3天全量換液，棄去懸浮細胞，添加新的培養基再次置于孵箱培養。每隔1 d半量換液，直至培養第5天后，收集懸浮細胞，經CD11C磁珠分選，得到純度>90%的細胞，并應用CD11C流式抗體標記，鑒定合格后，進行后續實驗。在第5天收集純化后的細胞應用完全培養基重懸(使細胞密度為5×105)，取3 ml鋪于6孔板中，置于孵箱靜置培養24 h，然后將培養孔均分為2組。一組為實驗組，其在第6天先給予最佳濃度的丹參酮 Ⅱ A預處理24 h，然后在第7天給予LPS(1 μg/ml)再次刺激24 h；一組為對照組，在第6天向細胞培養孔中先加入等量(與丹參酮 Ⅱ A同等體積)的PBS溶液，然后在第7天給予LPS(1 μg/ml)再次刺激24 h。兩組均收集細胞及培養上清，進行相關檢測。

1.2.2 ELISA方法檢測藥物最佳濃度 取純化的細胞應用完全培養基重懸，使細胞密度為5×105，取3 ml鋪于6孔板中，向孔板中加入不同濃度的丹參酮ⅡA，使其終濃度為100、300、500、700、900 ng/ml，將孔板置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，再加入LPS(1 μg/ml)刺激24 h。于培養結束后取上清進行TNF-α細胞因子檢測，并選擇抑制TNF-α作用較強，而用量較小的濃度作為藥物最佳作用濃度。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞表型 收集實驗組及對照組細胞，清洗后重懸于PBS溶液中，向細胞懸液里加入MHC Ⅱ、CD86及CD80及同種型抗體，4℃孵育30 min。應用流式細胞儀檢測，Flowjo軟件分析。

1.2.4 細胞因子檢測 取實驗組及對照組細胞培養上清，應用ELISA方法檢測IL-12及TNF-α的含量，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.5 混合淋巴細胞反應 取C57小鼠脾臟，碾磨后上過濾網，用PBS清洗后，應用含10%血清的RPMI1640溶液重懸，置于CO2培養箱培養24 h，培養結束后，棄去貼壁細胞，取懸浮細胞即為T淋巴細胞備用。取刺激后的DCs應用絲裂霉素C(25 μg/ml)刺激30 min，PBS清洗后，調整細胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。應用含10%血清的RPMI1640溶液重懸淋巴細胞，調整細胞為1×106ml-1，取100 μl置于孔板中，使每孔終濃度為200 μl，并置于5%CO2培養箱中培養48 h。培養結束后，實驗分成兩部分，一部分向96孔板每孔添加20 μl的MTS溶液，再置于培養箱中培養2 h，然后應用酶標板讀取光密度值，以光密度值來代表淋巴細胞增殖能力；另一部分，取細胞上清檢測相關細胞因子IL-4、IFN-γ分泌情況。

2 結果

2.1 DCs純度鑒定 未經磁珠分選的細胞，CD11C純度較低，經磁珠分選后的細胞，CD11C純度可達90%以上，見圖1，符合實驗要求。

2.2 藥物最佳作用濃度 DCs由不同藥物濃度的丹參酮ⅡA刺激后，與未刺激組相比，當藥物濃度為100、300、500、700及900 ng/ml時，TNF-α分泌量均顯著降低(P<0.05)，但當藥物濃度為500、700及900 ng/ml時，實驗組細胞因子TNF-α分泌量變化無統計學意義(P>0.05)，因此選取500 ng/ml為藥物作用最佳濃度，具體見圖2。

2.3 DCs表面分子表達 與對照組相比，實驗組DCs表達MHCⅡ、CD86及CD80水平均顯著降低(P<0.05)，結果見圖3及表1。

圖1 流式細胞術分析并純化DCsFig.1 Evaluation and purify of DCs by fluorescence-activated cell sorting system

圖2 不同藥物濃度DCs細胞因子分泌變化Fig.2 Cytokine secretion of DCs with different concentrations of tanshinone Ⅱ±s,n=5)Note: Vs the unstimulated group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 DCs表面共刺激分子表達變化Fig.3 Phenotype expression of DCs in each group

GroupsCD80CD86MHCⅡExperimentalgroup15.4±5.91)45.2±5.91)35.1±6.81)Controlgroup40.9±5.662.6±5.151.7±6.5

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

2.4 DCs細胞因子分泌 與對照組相比，實驗組DCs分泌的TNF-α及IL-12含量均顯著降低(P<0.05)，具體見表2。

2.5 DCs刺激淋巴細胞增殖反應 與對照組相比，實驗組DCs刺激淋巴細胞增殖反應能力明顯降低(P<0.05)，具體見表3。

GroupsIL-12TNF-αExperimentalgroup208.6±5.21)201.8±5.21)Controlgroup340.6±5.6360.8±4.9

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

GroupsODExperimentalgroup1.6±0.41)Controlgroup3.2±0.3

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

GroupsIL-4IFN-γExperimentalgroup343.4±4.71)145.9±6.11)Controlgroup205.8±4.3315.4±6.4

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

2.6 DCs刺激T淋巴細胞分化 實驗組與對照組相比，DCs刺激T淋巴細胞分泌IL-4含量明顯高于對照組，IFN-γ含量明顯低于對照組，各組差異均存在統計學意義(P<0.05)，具體見表4。

3 討論

DCs作為目前功能最強的專職抗原提呈細胞，具有獨特的誘導T細胞活化的能力，是連接固有免疫和適應性免疫的“橋梁”。DCs在體內多以未成熟狀態存在，抗原提呈能力較強，但刺激T細胞的能力較弱，表現為多種表面因子及炎性細胞因子分泌較少[3]。當病菌等外來微生物刺激后，即可激活成活化狀態，可高表達多種表面分子，如CD86、CD80、MHCⅡ等，高分泌多種細胞因子，如TNF-α、IL-12，誘導幼稚的T細胞分化成熟，促進T細胞活化，從而激活免疫應答[4]。隨著 DCs研究的深入，發現該細胞的抗原呈遞能力及成熟狀態，可直接干預機體的免疫調節，影響機體穩態[5]。LPS作為最常見刺激DCs活化的物質，可較大程度地上調DCs的多種共刺激分子，體外模擬炎性因子刺激狀態。研究已證實，成熟的DCs可以誘導并加重多種自身免疫性疾病的發生發展，如多發性硬化、類風濕性關節炎[6,7]。因此選擇藥物抑制DCs成熟狀態已經成為改善多種免疫性疾病的突破口。

作為丹參藥物活性提取物之一，丹參酮ⅡA具有廣泛的生理作用，包括清除多種細菌，抑制炎癥；減少自由基和脂質過氧化物的形成，并促進抗氧化物質的合成；抑制多種膠原、透明質酸的合成，從而抑制肝臟纖維化，保護肝功能；促進氧自由基的代謝，降低自由基水平，保護腦神經元，對腦血管疾病也有一定的治療作用[8]。因其廣泛的藥理作用，丹參酮ⅡA在臨床的應用也極為廣泛。丹參酮ⅡA可應用于心肌炎、心臟手術、多種心律失常等心臟疾病，腦血管病及抗腫瘤的治療等。并且最新研究表明，丹參酮ⅡA可以減弱關節炎的免疫反應，改善多發性硬化疾病動物模型-自身免疫性脫髓鞘疾病的癥狀[9,10]。然而有關丹參酮ⅡA對DCs功能的調節卻仍鮮有研究。

本研究可以看出，即便在LPS刺激下，一定濃度的丹參酮ⅡA(500 ng/ml)仍可以較大程度地抑制LPS導致的DCs的表面因子MHCⅡ、CD86及CD80的升高，丹參酮ⅡA刺激組的DCs分泌的TNF-α及IL-12含量也明顯降低。在刺激T淋巴細胞增殖和分化方面，丹參酮ⅡA可通過DCs抑制了LPS導致的細胞增殖。并且，經過丹參酮ⅡA預處理的DCs可刺激T細胞分泌較多的TH2型細胞因子(IL-4)，較少量的Th1型細胞因子(IFN-γ)，提示丹參酮ⅡA可通過干預DCs誘導T淋巴細胞向Th2炎性細胞方向偏移，說明了該藥物可抑制LPS誘導的DCs的成熟狀態，從而調節 Th1/Th2平衡來參與機體疾病的發生發展。已有動物實驗顯示，丹參酮ⅡA可減緩關節炎及多發性硬化的免疫反應[9,10]，但具體機制未知。本研究初步闡明了丹參酮ⅡA可通過抑制DCs功能及成熟度，從而影響T細胞分化，使T細胞向Th2方向偏移，導致體內抑炎性因子分泌增多，炎性因子分泌減少，從而起到減緩自身免疫性疾病的作用，表明丹參酮ⅡA可以通過調控DCs的功能來干預自身免疫性疾病的發生發展。

綜上所述，丹參酮ⅡA可以降低LPS誘導的DCs表面共刺激分子表達及細胞因子分泌，降低T淋巴細胞增殖，通過調控DCs的成熟狀態來干預機體免疫系統，從而參與自身免疫性疾病的發生發展。

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[收稿2016-08-12 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

A novel role for tanshinone ⅡA in modulation of dendritic cells maturation and function

XIAJin-Hua，XIAJian-Chuan，XIELi-Yan,LIAOChuan-Ying.

GuangzhouHealthScienceCollege,Guangzhou510450,China

Objective:Bone marrow-derived dendritic cells(DCs) were extracted and gave tanshinone ⅡA to intervene,and we observed the change of DCs function,which investigate the effects of tanshinone ⅡA in immune system. Methods: Extract bone marrow-derived DCs,and cells were cultured in complete medium with 10 ng/ml GM-CSF and IL-4.On day 5,magnetic cell sorting was used to purify DCs,and the purify must be up to 90%.Then,a certain concentration of tanshinone ⅡA or LPS was gave to the cell culture,and cells and supernatant were collected for following experiments.We used flow cytometry to detect phenotype ,and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect cytokine production of TNF-α and IL-12.Also,allogeneic mixed lymphocyte reaction was used to detect the ability of DCs to induce T cell proliferation and polarization. Results: When the concentration of tanshinone ⅡA was 500 ng/ml,the inhibition of secretion of TNF-α was maximal.So we chose that concentration.Compared with the control group,DCs in experimental group had reduced expression of CD80,CD86 and MHCⅡ(P<0.05).Compared with the control group,DCs in experimental group displayed the reduced level of IL-12 and TNF-α(P<0.05).Compared with the control group,DCs in experimental group had reduced ability to induce T cell proliferation(P<0.05).Compared with the control group,DCs in experimental group induced T cell to secret increased level of IL-4,and reduced level of IFN-γ(P<0.05).Conclusion: Tanshinone ⅡA can inhibit the dendritic cells maturation induced by LPS,which takes part in immune system and autoimmune diseases.

Dendritic cells;Tanshinone ⅡA;LPS;Maturation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.012

夏金華(1964年-)，男，碩士，副教授，主要從事腫瘤免疫治療、細胞因子與自身免疫病方面的研究。

R392.12

A

1000-484X(2017)03-0374-04

①中山大學附屬腫瘤醫院,廣州510060。