芫花醇提物對不同種屬體系UGTs及UGT1A1活性的影響

郭嫦娥，苗培培，陳紅影，陳寧，馬鵬凱，李紅品，朱虹宇，高興，張玉杰

北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102

芫花醇提物對不同種屬體系UGTs及UGT1A1活性的影響

郭嫦娥，苗培培，陳紅影，陳寧，馬鵬凱，李紅品，朱虹宇，高興，張玉杰

北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102

目的考察芫花醇提物對UGTs及UGT1A1活性的影響，為闡釋芫花毒性機制提供依據。方法采用體外肝微粒體孵育模型，以4-硝基酚為底物檢測UGTs活性，以β-雌二醇為底物檢測UGT1A1活性，利用UV和HPLC測定底物及代謝物含量。結果芫花醇提物中3種黃酮類成分芹菜素、羥基芫花素、芫花素含量分別為6.34%、8.72%、6.06%，UV測得總二萜含量為31.40%。體外實驗表明，在大鼠肝微粒體（RLM）和人肝微粒（HLM）孵育體系中，芫花醇提物均能顯著抑制UGTs活性；對UGT1A1活性，在RLM、HLM和重組酶（rhUGT1A1）孵育體系中，芫花醇提物均表現為中等強度的抑制作用，以羥基芫花素計，半數抑制濃度分別為46.32、32.49、8.382 μmol/L，抑制類型分別為競爭性抑制作用、反競爭性抑制作用和競爭性抑制作用。結論 芫花醇提物對不同肝微粒體孵育體系中UGTs及UGT1A1活性均可產生抑制作用且存在種屬差異性，這種抑制作用可能是芫花致肝損傷的機制之一。

芫花；醇提物；UGTs；UGT1A1；肝微粒體；毒性；抑制作用

芫花Genkwa Flos為瑞香科植物Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾，其性溫，味苦、辛，歸肺、脾、腎經[1]，為傳統峻下逐水藥[2]。芫花含有黃酮類、香豆素類、木脂素類、二萜原酸酯類、揮發油類等多種化學成分[3]，具有鎮咳、祛痰、鎮痛、抑菌、抗炎、抗驚厥、抗腫瘤等多種藥理活性[4]，但長期大劑量使用可致肝、腎、腦等器官出現嚴重損傷[5]，并對皮膚及黏膜具有嚴重的刺激性[6]。研究表明，芫花醇提物是芫花的主要活性部位，具有良好的鎮痛作用[7]、抗炎活性[8]、抗寄生蟲活性[9]，同時也具有明顯的肝腸毒性作用[10]。UGTs催化的葡萄糖醛酸結合反應是體內重要的Ⅱ相代謝途徑，可增加底物的親水性，使其更有效地從尿或膽汁中排出體外，對調節機體與外環境間的相互作用和保持機體內環境的穩定具有重要意義[11-12]。UGT1A1是葡萄糖醛酸轉移酶中重要的一員，是許多內源性激素、毒性代謝物（如膽紅素）和外源物的結合酶[13]，對維持體內平衡具有重要的作用。因此，研究基于UGTs介導的藥物相互作用對解釋中藥配伍原理及指導臨床用藥具有重要意義。曾有報道芫花對細胞色素P450酶活性的影響[14]，而其對Ⅱ相代謝酶UGTs活性的影響研究目前尚未見報道。本試驗采用肝微粒體體外孵育方法，以 4-硝基酚（4-NP）和β-雌二醇為探針底物，利用UV和HPLC分別測定底物及代謝產物的含量變化，考察芫花醇提物對人和鼠肝微粒體孵育體系中UGTs及UGT1A1活性的影響，為芫花致肝損傷的可能機理、芫花的開發利用，以及預測臨床可能的代謝性藥物相互作用提供依據。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（LC-20AT四元高壓泵，SPD-20A UV-vis檢測器，DGO-20A在線真空脫氣機，SIL-20A自動進樣器，GTO-10AS VP柱溫箱及LC色譜工作站），T10 basic勻漿器（IKA，德國），TGL 20M臺式高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司），TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），DKZ-450B型電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司），VOTEX GENIVS漩渦混勻儀（IKA），MTN-2800D型氮氣吹干儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

芫花（批號14010602），安徽本草國藥有限公司，經北京中醫藥大學中藥學院張貴君教授鑒定為瑞香科植物芫花 Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾；芫花素、芹菜素（批號分別為 111899-201202、111901-201102，純度均≥98%）、氫溴酸右美沙芬（批號100201-201003，純度≥98%），中國食品藥品檢定研究院；羥基芫花素（批號10540000，純度≥98%），上海標準品生物技術有限責任公司；丙甲菌素，北京拜耳迪生物技術有限公司（J&K Scientific，中國大陸）；尿苷-5′-二磷酸三鈉鹽（UDPGA）、D-葡萄糖二酸-1,4-內酯，Sigma-Aldrich；混合雄性大鼠肝微粒體（RLM）、男性混合人肝微粒體（HLM），匯智泰康生物技術（北京）有限公司；重組酶 UGT1A1（rhUGT1A1），BD公司（上海，中國）；脫水穿心蓮內酯（批號A0473，純度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；β-雌二醇，TCI公司；β-雌二醇-3-葡糖醛酸苷（E-3-G），Toronto Research Chemicals Inc.；4-NP，上海江萊生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，美國Fisher公司；其余試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 芫花醇提物的制備

稱取芫花1 kg，用10倍量95%乙醇加熱回流提取2 h，得提取液；殘渣用50%乙醇繼續加熱回流提取2 h，合并提取液，減壓濃縮，蒸干，得芫花醇提取物164.12 g。

2.2 芫花醇提物主要成分含量測定

2.2.1 HPLC測定3種黃酮成分 采用Agilent Zorbax Extend-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.2%甲酸水、B為乙腈，梯度洗脫（0～25 min，90%～80%A；25～60 min，80%～48%A；60～70 min，48%～10%A；70～80 min，10%～90%A），流速為1 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長280 nm[15]。3種黃酮成分分離良好，芫花素、羥基芫花素、芹菜素保留時間分別為54.25、48.68、41.78 min。色譜圖見圖1。

圖1 芫花醇提物中3種黃酮成分HPLC圖

2.2.2 比色法測定總二萜含量 選擇與芫花中二萜類成分結構相似的脫水穿心蓮內酯作為對照品，測定芫花醇提物中總二萜含量[16]。取脫水穿心蓮內酯對照品及芫花醇提物溶液各2 mL，分別置于10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，分別加入新鮮配制的 5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL及高氯酸0.8 mL，混勻，密塞，置60 ℃水浴中反應15 min，取出，迅速冷卻后精密加入冰乙酸5 mL，混勻，靜置10 min，以空白試劑作為對照，于400～800 nm波長處測定吸收光譜，結果見圖2、圖3。選擇410 nm為檢測波長，測定芫花醇提物中總二萜含量。

圖2 脫水穿心蓮內酯對照品UV圖

圖3 芫花醇提物UV圖

2.3 HPLC測定UGT1A1活性

采用Agilent Zorbax Extend-C18色譜柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm），流動相A為0.2%甲酸水、B為乙腈，梯度洗脫（0～10 min，90%～75%A；10～30 min，75%～48%A；30～45 min，48%～10%A，45～60 min，10%～90%A），流速1 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長280 nm。結果UGT1A1底物β-雌二醇的代謝產物E-3-G與內標（氫溴酸右美沙芬）峰形良好，分離完全，無雜質峰干擾，空白肝微粒體及提取物成分對測定無干擾，專屬性強。色譜圖見圖4。

圖4 RLM中E-3-G的HPLC圖

2.4 溫孵條件及樣品處理

2.4.1 UGTs活性測定 參照文獻[17-19]方法，以4-NP為底物，采用UV進行測定。200 μL溫孵體系包括 0.2 g/L RLM 或 HLM、丙甲菌素（50 μg/mg protein）、3 mmol/L UDPGA、100 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L D-葡萄糖二酸-1,4-內酯、1 mmol/L 4-NP及100 μmol/L芫花醇提物（以羥基芫花素計）。37 ℃預孵育5 min，加入UDPGA啟動反應，孵育30 min，加入5%三氯乙酸2 mL終止反應，13 000×g離心15 min，取上清液1 mL，加入2 mol/L NaOH 0.25 mL，于405 nm波長處測定吸光度。

2.4.2 UGT1A1活性測定 參照苗培培等[18]方法，確定溫孵時間為30 min，蛋白終濃度為0.5 g/L。

2.5 芫花醇提物對UGT1A1的半數抑制濃度測定

取UGT1A1的特異性底物β-雌二醇，測定不同濃度芫花醇提物作為抑制劑對其代謝的抑制作用，計算半數抑制濃度（IC50）。在孵育體系中，固定探針底物濃度不變（RLM：35 μmol/L；HLM和rhUGT1A1：30 μmol/L），芫花醇提物的濃度（以羥基芫花素計）為0～150 μmol/L，按“2.4.1”項下步驟反應，終止后，HPLC測定探針代謝產物 E-3-G的含量，采用GraphPad Prism 5處理數據，計算芫花醇提物對UGT1A1抑制作用的IC50值。

2.6 芫花醇提物對UGT1A1抑制類型的確定

對IC50＜100 μmol/L的反應體系，進一步分析芫花醇提物對UGT1A1的抑制類型。配制3個不同濃度的探針底物溶液，在孵育體系中，分別加入不同濃度的探針藥物和芫花醇提物反應一定時間后，終止反應，按“2.4.1”項下處理樣品， HPLC分析代謝產物（E-3-G）的含量，根據Lineweaver-Burk和Dixon-Plot圖，計算抑制常數Ki，判斷抑制類型。

2.7 數據處理

采用 SPSS17.0統計軟件進行分析。數據用—x±s表示。各組數據均進行線性回歸分析，同時進行方差分析，方差不齊者采用非參數檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 芫花醇提物主要成分含量測定

1 kg芫花原材料所得芫花提取物為164.12 g。芫花醇提物中3種黃酮成分芹菜素、羥基芫花素、芫花素的含量分別為6.34%、8.72%、6.06%，即羥基芫花素＞芹菜素＞芫花素；總二萜含量為 31.40%。醇提物濃度以羥基芫花素計，濃度為80.51 μmol/L。

3.2 芫花醇提物對UGTs活性的影響

與空白組比較，芫花醇提物均可顯著抑制RLM、HLM孵育體系中UGTs活性，結果見表1。

表1 芫花醇提物對肝微粒體UGTs活性的影響[—x±s，μmol/(mg?min)，n＝6]

3.3 芫花醇提物對UGT1A1活性的影響

芫花醇提物濃度依賴性地抑制UGT1A1的活性，以羥基芫花素計，IC50分別為46.32 μmol/L（RLM）、32.49 μmol/L（HLM）、8.382 μmol/L（rhUGT1A1），見圖5A、圖6A、圖7A。Lineweaver-Burk和Dixon-plot圖表明，芫花醇提物在 RLM、rhUGT1A1體系中對UGT1A1的抑制類型為競爭性抑制作用（見圖5B、C，圖7B、C），以Lineweaver-Burk斜率和芫花醇提物濃度作圖計算出在RLM、rhUGT1A1體系中的抑制動力學參數Ki分別為32.31、5.59 μmol/L（見圖5D、圖7D）；芫花醇提物在HLM體系中對UGT1A1的抑制類型為反競爭性抑制作用（見圖6B、C），以Lineweaver-Burk斜率和芫花醇提物濃度作圖計算出抑制動力學參數Ki為1.464 μmol/L（見圖6D）。

圖5 芫花醇提物對RLM體系中UGT1A1活性的抑制作用（n＝3）

圖6 芫花醇提物對HLM體系中UGT1A1活性的抑制作用（n＝3）

圖7 芫花醇提物對rhUGT1A1體系中UGT1A1活性的抑制作用（n＝3）

4 討論

UGTs是體內最重要的Ⅱ相代謝酶，主要分布于肝臟、腸道、腎臟等器官。其功能是催化外源性藥物、內源性物質發生葡萄糖醛酸化結合反應，轉化為極性較強的結合物，增加底物的親水性，使其能更有效地從尿或膽汁中排出體外，這是機體的一個重要解毒過程[20-21]。已有學者通過血清生化指標和組織病理學篩選出芫花醇提物的氯仿萃取部位是芫花致肝毒性部位，并鑒定該部分含有黃酮類成分（芫花素、芹菜素、羥基芫花素）、木脂素類及二萜原酸酯類等成分[10]。本研究測定芫花醇提物對不同種屬肝微粒體中 UGTs和UGT1A1活性的影響發現，芫花醇提物對RLM和HLM孵育體系中UGTs均產生了顯著的抑制作用，并且其抑制率均大于50%，這提示在芫花醇提物中存在某些成分可作為UGTs抑制劑，具有導致毒性發生的潛在可能性。

UGTs的數量和活性直接影響藥物在體內的代謝消除，對維持機體的穩定及藥物發生藥效至關重要。對于RLM和rhUGT1A1體系，芫花醇提物對UGT1A1表現為中等強度的抑制作用，其抑制類型均為競爭性抑制作用（IC50分別為 46.32、8.382 μmol/L）；對于HLM體系，芫花醇提物對UGT1A1表現為中等強度抑制作用，其抑制類型為反競爭性抑制作用（IC50為32.49 μmol/L）。由以上結果可知，芫花醇提物對不同種屬中 UGT1A1的抑制程度不同，其抑制作用為rhUGT1A1＞HLM＞RLM；推測原因可能為，藥物代謝酶存在種屬差異，藥物作用于不同種屬 UGT1A1時呈現出不同的效果。

本研究結果提示，當芫花與UGT1A1底物藥物聯合使用，或長時間大劑量單獨用藥時，均可能發生藥物代謝性相互作用或擾亂體內內源性物質的正常代謝。結合本實驗室前期研究羥基芫花素對UGT酶的活性影響[18]及Chen Y等[22]和張亞洲等[23]報道的芹菜素和芫花酯戊在體內的代謝消除均需UGTs的參與，本研究通過芫花醇提物對UGTs和UGT1A1活性的抑制作用，推測Ⅱ相代謝作用可能造成芫花的毒性成分如芫花二萜成分[24]或次生毒性代謝物在體內的代謝轉化受阻，導致其在體內滯留蓄積從而產生毒性，這可能為芫花致毒的機制之一，為芫花致肝損傷研究提供新思路、新方法，其具體作用機制還需進一步探討。

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Effects of Genkwa Flos Ethanol Extracts on UGTs and UGT1A1 Activities in Different Systems

GUO Chang-e, MIAO Pei-pei, CHEN Hong-ying, CHEN Ning, MA Peng-kai, LI Hong-pin, ZHU Hong-yu, GAO Xing, ZHANG Yu-jie (School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo investigate the inhibition of Genkwa Flos ethanol extracts on UGTs and UGT1A1 activities of different liver microsomes; To predict the toxicity mechanism of Genkwa Flos.MethodsBy adopting in vitro liver microsomes incubation model, 4-nitrophenol (4-NP) and β-estradiol were selected as substrates to determine activities of UGTs and UGT1A1 by UV and HPLC, respectively.ResultsContent determination results show that there were 6.34% of apigenin, 8.72% of hydroxygenkwanin and 6.06% of genkwanin in ethanol extracts, and total diterpene accounted for 31.40%. In vitro research showed that ethanol extracts significantly inhibited UGTs activity in rat and human liver microsome. UGT1A1 activity was inhibited by hydroxygenkwanin with IC50about 46.32, 32.49 and 8.382 μmol/L in rat liver microsome (RLM), human liver microsome (HLM) and recombinant UGT1A1 (rhUGT1A1), respectively. The inhibition types were competitive inhibition in RLM and rhUGT1A1, and uncompetitive inhibition in HLM.ConclusionEthanol extracts showed different inhibition of UGTs and UGT1A1 activities, and the inhibition may reveal one of the mechanisms of liver injury induced by Genkwa Flos.

Genkwa Flos; ethanol extracts; UGTs; UGT1A1; liver microsomes; toxicity; inhibition

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.021

R285.5

A

1005-5304(2017)04-0083-05

2016-08-02）

（

2016-08-25；編輯：陳靜）

國家自然科學基金（81274177、81073140）；北京中醫藥大學自主選題項目（2016-JYB-XS048、2016-JYB-XS081、2016-JYB-XS058）

張玉杰，E-mail：zhyj227@126.com