補腎益精方對干性年齡相關性黃斑變性動物模型骨髓來源干細胞動員的影響

侯樂，唐由之，梁麗娜

·論著：實驗研究·

補腎益精方對干性年齡相關性黃斑變性動物模型骨髓來源干細胞動員的影響

侯樂，唐由之，梁麗娜

目的評價補腎益精方對干性年齡相關性黃斑變性動物模型骨髓來源干細胞動員的影響。方法通過尾靜脈注射碘酸鈉溶液的方法建立干性年齡相關性黃斑變性動物模型，比較不同組別小鼠外周血骨髓來源干細胞相對數量和相關細胞因子的改變。造模后第1 d給藥，中藥組每日予補腎益精方水煎劑灌胃，對照組以蒸餾水灌胃，空白組不做處理。給藥7 d、14 d、28 d后觀察3組外周血骨髓來源干細胞相對數量和相關細胞因子的改變。結果灌胃7 d后，中藥組外周血Lin-/Sca-1+/c-kit+細胞相對數量較對照組和空白組增高，差異有統計學意義；對照組外周血粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）含量較空白組和中藥組降低，差異有統計學意義；對照組和中藥組外周血基質細胞衍生因子-1α（Stromal Cell-Derived Factor 1 alpha，SDF-1a）及其受體趨化因子受體-4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR-4）含量較空白組降低，差異有統計學意義。灌胃14 d后，對照組外周血G-CSF含量仍較空白組和中藥組降低，差異有統計學意義；中藥組外周血SDF-1a、CXCR-4含量較對照組增加，差異有統計學意義。灌胃28 d后，中藥組外周血G-CSF含量較對照組和空白組增加，差異有統計學意義；中藥組外周血SDF-1a、CXCR-4含量仍較對照組增加，差異有統計學意義。結論補腎益精方能夠增加外周血BMCs、G-CSF、SDF-1a及其受體CXCR-4含量，對BMCs有一定的動員作用。其機制可能與補腎益精方增加外周血BMCs相關動員因子含量，促進BMCs從骨髓向外周血遷移有關。

補腎益精方；干性年齡相關性黃斑變性；骨髓來源干細胞；動員

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是發達國家65歲以上人群主要的致盲性眼病，可以導致不可逆的視力喪失。目前患病率在3%左右[1]。根據臨床表現分為干性年齡相關性黃斑變性（Dry age-related macular degeneration）和濕性年齡相關性黃斑變性（Wet age-related macular degeneration）。其中，干性AMD是最常見的臨床類型，占所有AMD的80%~85%[2]。目前，西醫對干性AMD的治療無較好方法，中醫采取補益肝腎的治法，臨床取得較好療效。

本實驗利用C57BL/6小鼠尾靜脈注射的方法建立干性AMD模型，通過對不同組別小鼠外周血骨髓來源干細胞相對數量和相關細胞因子的改變，評價補腎益精方對干性AMD動物模型骨髓來源干細胞動員的影響。希望對中醫治療干性AMD可能的分子機制探討提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6-8周齡清潔級C57BL/6小鼠72只，常規飼養1周，隨機分為空白組、對照組、中藥組，每組24只。對照組和中藥組參照Li[3]的方法以尾靜脈注射碘酸鈉溶液造模，注射劑量40 mg/kg?？瞻捉M不做處理，常規飼養。造模小鼠于造模后第1 d給藥，中藥組每日予補腎益精方水煎劑灌胃，對照組以蒸餾水灌胃，7 d、14 d、28 d后觀察各組小鼠外周血骨髓來源干細胞相對數量和相關細胞因子的改變，每個時間點樣本量為8只。

1.2 流式細胞儀檢測

分別于給藥后7 d、14 d、28 d取小鼠外周血離心后取上清進行流式細胞儀檢測外周血液中Lin-/ Sca-1+/c-kit+細胞數量。

1.3 ELSSA檢測

用ELISA方法檢測粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、基質細胞衍生因子-1α（SDF-1α）及其受體趨化因子受體-4（CXCR-4）的含量。給藥后7 d、14 d、28 d取小鼠外周血離心后檢測血清中上述因子。

1.4 統計學方法

使用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析。同一時間點多組間采用完全隨機設計的單因素方差分析，多組比較之后，兩兩比較用LSD方法，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血Lin-/Sca-1+/c-kit+細胞相對數量

灌胃7 d后3組之間比較，差異有統計學意義（P=0.002），中藥組外周血Lin-/Sca-1+/c-kit+細胞相對數量較對照組（P=0.02）和空白組（P=0.001）增高，差異有統計學意義；對照組與空白組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。灌胃14 d和灌胃28 d后結果相似，三組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠外周血Lin-/Sca-1+/c-kit+細胞相對數量比較（x±s）

2.2 ELSSA檢測

外周血G-CSF含量各組間比較：灌胃7 d和灌胃14 d后結果相似，三組之間比較，差異有統計學意義（P=0.002），對照組外周血G-CSF含量較空白組（P7=0.002，P14=0.000）和中藥組（P7=0.012，P14=0.000）降低，差異有統計學意義；空白組與中藥組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。灌胃28 d后三組之間比較，差異有統計學意義（P<0.001），中藥組外周血G-CSF含量較對照組（P<0.001）和空白組（P=0.005）增加，對照組外周血G-CSF含量較中藥組（P<0.001）和空白組（P<0.001）降低，差異均有統計學意義。

表2 各組小鼠外周血G-CSF含量比較（x±s，pg/ml）

外周血SDF-1a含量各組間比較：灌胃7 d后三組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），對照組和中藥組外周血SDF-1a含量較空白組（兩個組均P＜0.001）降低，中藥組較對照組下降更明顯（P= 0.006），差異均有統計學意義。灌胃14 d后三組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），對照組和中藥組外周血SDF-1a含量較空白組（P對照＜0.001，P中藥= 0.022）降低，中藥組外周血SDF-1a含量較對照組增加（P＜0.001），差異均有統計學意義。灌胃28 d后三組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），對照組外周血SDF-1a含量較中藥組（P＜0.001）和空白組（P＜0.001）降低，差異有統計學意義；空白組與中藥組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠外周血SDF-1a含量比較（x±s，ng/ml）

外周血CXCR-4含量各組間比較：灌胃7 d后三組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），對照組和中藥組外周血CXCR-4含量較空白組（兩個組均P＜0.001）降低，中藥組較對照組下降明顯（P= 0.01），差異均有統計學意義。灌胃14 d后三組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），對照組和中藥組外周血CXCR-4含量較空白組（P對照＜0.001，P中藥=0.008）降低，中藥組外周血CXCR-4含量較對照組增加（P＜0.001），差異均有統計學意義。灌胃28 d后三組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），對照組外周血CXCR-4含量較中藥組（P＜0.001）和空白組（P＜0.001）降低，差異有統計學意義；空白組與中藥組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠外周血CXCR-4含量比較（x±s，ng/ml）

3 討論

3.1 外周血Lin-/Sca-1+/c-kit+細胞相對數量

Lin（lineage surface antigen）即譜系抗原，Lin-是指各系特征性分化抗原的表達是陰性的，代表干細胞還沒有分化成各系的祖細胞，細胞尚未表達各種細胞系的特征蛋白；Sca-1即干細胞抗原1，存在于小鼠骨髓，人骨髓中沒有，是小鼠HSC標志分子；c-kit即CD11，是一種干細胞的膜受體，是干細胞的特征性標記，主要存在于造血干細胞膜上。Lin-/Sca-1+/ c-kit+細胞可以定義為骨髓來源干細胞，可評價BMCs的動員作用。有文獻報道，C57BL/6小鼠只單純注射碘酸鈉溶液不會促進BMCs動員到外周血中。

本研究結果顯示：灌胃后7 d，中藥組外周血Lin-/Sca-1+/cvkit+細胞相對數量與對照組和空白組比較增高（P=0.02，P=0.001），差異有統計學意義；而對照組與空白組比較，兩者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。灌胃后14 d和灌胃后28 d三組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。上述結果提示：（1）補腎益精方早期（7 d）能增加外周血BMCs含量，對BMCs有一定的動員作用，中晚期（14 d，28 d）則不明顯。（2）單純注射碘酸鈉溶液（對照組）不會增加外周血BMCs含量，即單純的視網膜損傷不能促使BMCs動員到外周血中，這與國外文獻的描述相似。

3.2 外周血相關細胞因子

G-CSF是造血生長因子，主要作用于中性粒細胞系造血細胞的增殖、分化和活化。它能在體內動員HSCs，可以誘導BMCs動員到外周血中[4-5]。其在異基因造血干細胞移植中被廣泛用于供者動員和促進移植后髓系造血的重建[6]。目前，臨床上已將其用于單成分輸血、BMCs移植等后的干細胞動員[7]。早期研究發現，G-CSF導致骨髓中SDF-1含量的降低，其受體CXCR4含量的增加，而對它們在血液中蛋白表達的影響較小。人或動物應用G-CSF后外周血BMCs數量在5-6 d時達到最大值[8]。近期動物實驗發現，碘酸鈉造模小鼠在給予G-CSF治療后外周血BMCs增加了4倍，具有統計學意義。

SDF-1α是一種可以誘導多種類型細胞遷移的趨化蛋白，由骨髓基質細胞和其他相關間質細胞及上皮細胞分泌。CXCR4是SDF-1α的受體，其能介導SDF-1α的趨化作用，兩者結合并相互作用可以啟動相關下游信號通路[9-10]。SDF-1α和其受體CXCR4參與人CD34+細胞的歸巢和動員。CXCR4能在外周血CD34+細胞上表達[11]。而CD34是一種高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，選擇性地表達于人和其他哺乳類動物造血干/祖細胞的表面，并隨細胞的成熟而逐漸的減弱直至消失。目前，普遍認為CD34是外周血骨髓干細胞標志物。

本研究結果顯示：對照組外周血G-CSF、SDF-1a及其受體CXCR-4含量較空白組下降，并隨時間點的遞增而逐漸降低；14 d時中藥組外周血G-CSF、SDF-1a及其受體CXCR-4含量與對照組相比增加，差異有統計學意義；7 d及14 d時中藥組外周血G-CSF、SDF-1a及其受體CXCR-4含量與空白組相比降低，差異有統計學意義，到28 d時基本與空白組持平或高于空白組。上述結果提示：（1）碘酸鈉造模后外周血G-CSF、SDF-1a及其受體CXCR-4含量會降低，在不進行外在干預的情況下呈逐漸下降的趨勢；（2）補腎益精方具有促進外周血G-CSF、SDF-1a及其受體CXCR-4含量增加的作用，并且隨著時間的增加，其效應逐漸增強，最終在28 d時外周血G-CSF含量高于正常水平，SDF-1a及其受體CXCR-4含量則與正常水平持平。

3.3 補腎益精方對干性AMD動物模型BMCs動員的影響

目前，AMD的發病機制尚無明確定論，可能與易感基因、炎癥反應、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞老化和代謝改變有關[12]。治療方面亦尚無有效的療法。干細胞、睫狀神經營養因子、臭氧自血療法和前列腺素類在穩定或改善視力方面顯示了希望，但療效不十分確切。另外，年齡相關性眼病研究（AREDS）顯示維生素類可以減緩AMD進展成重度[13]。

中醫學認為AMD屬視瞻昏渺、視直如曲范疇，雖然臨床上所見證型復雜，但其主要病機應與衰老引起的腎中精氣虛衰，使目失所養有關，故補腎益精是臨床上治療AMD的常用治則。補腎益精方是唐由之研究員多年治療AMD總結出的經驗方，主要由制首烏、黃精、菟絲子等組成。方中諸藥合用，共奏補腎益精、養血明目之功效、前期臨床觀察基于此方加減治療的干性AMD患者30例41眼，結果顯示：同一患者6個時間點（治療后1、3、6、12個月及末診）的視力均好于初診視力，差異具有統計學意義（P<0.05）。我們推測，補腎益精方對視力的改善可能是通過其對視網膜損傷的保護修復作用，從而延緩了干性AMD的進程。動物實驗研究，補腎益精方能改善皇家外科學院（royal college of surgeon，RCS）大鼠暗視ERG（electroretinogram，ERG）、明視ERG和Ops波幅，改善其視網膜形態和外核細胞數，對RCS大鼠視網膜變性損傷具有一定保護作用[14]。

補腎益精方中制首烏，性味苦、甘、澀，溫；歸肝、心、腎經；具有補肝腎，益精血，強筋骨的功效。黃精，性味甘，平；歸脾、肺、腎經；功效補氣養陰，益腎。菟絲子，性味甘，溫；歸肝、腎、脾經；有滋補肝腎，明目之效。枸杞子，性味甘，平；歸肝、腎經；有滋補肝腎，益精明目之效。黃芪，性味甘，溫；歸肺、脾經；能補氣固表。當歸，性味甘、辛，溫；歸肝、心、脾經；能補血活血?，F代藥理學研究發現：何首烏可以增加骨多孔癥白鼠脊椎骨密度和骨無機質成分含量[15]。黃精含藥血清組能提高G-CSF mRNA水平的表達[16]。枸杞多糖能增加小鼠外周血粒細胞數目，并促進股骨骨髓細胞增殖。黃芪多糖可以促進骨髓細胞的動員[17]。

干性AMD是年齡相關性視網膜退行性疾病，年齡與其發病率密切相關。中醫學理論認為，隨著年齡的增加，人體五臟六腑的機能都會隨之發生相應的變化，隨著五臟六腑機能的變化，人體相應的生理結構功能也會發生相應的改變，而腎臟尤為明顯?！饵S帝內經·素問·上古天真論》中記載：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長；……八八，天葵竭，精少，腎臟衰，形體皆極，則齒發去。腎者主水，受五臟六腑之精而藏之，故五臟盛乃能瀉”。因此，中醫學上，許多與年齡相關或機體老化有關的疾病多采取補腎益精的治則?！饵S帝內經·素問·六節藏象論》記載：“腎藏精，精能生髓，髓以養骨”。腎中精氣充足，骨髓得到滋養，則能發揮精氣氣化化生的功能，這與BMCs在來源和功能上具有相似性。腎精充足，則BMCs來源充足，一旦人體發生病變，某些細胞因子啟動BMCs動員，參與受損組織的修復。

本實驗表明：補腎益精方能夠增加外周血BMCs、G-CSF、SDF-1a及其受體CXCR-4含量，對BMCs有一定的動員作用。其機制可能與補腎益精方增加外周血BMCs相關動員因子含量，促進BMCs從骨髓向外周血遷移有關。動員到外周血中的BMCs是否能趨化到受損的視網膜組織并分化成相應細胞參與組織修復尚需進一步的研究。

[1]Klein，ChouCF，KleinBE，et al.Prevalence of age-related macular degeneration in the US population[J].Arch Ophthalmol，2011，129（1）：75-80.

[2]Iejima D，Itabashi T，Kawamura Y，et al.HTRA1（high temperature requirement A serine peptidase 1）gene is transcriptionally regulated by insertion/deletion nucleotides located at the 3'end of the ARMS2（age-related maculopathy susceptibility 2）gene in patients with age-related macular degeneration[J].J Biol Chem，2015，290（5）：2784-2797.

[3]Yang Li，Pelin Atmaca-Sonmez，Carrie L，et al.Endogenous Bone Marrow-Derived Cells Express Retinal Pigment Epithelium Cell Markers and Migrate to Focal Areas of RPE Damage[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（3）：4321-4327.

[4]Molineux G，Pojda Z，Dexter TM.A comparison of hematopoiesis in normal and splenectomized mice treated with granulocyte colony stimulating factor[J].Blood，1990，75（3）：563-569.

[5]Bungart B，Loeffler M，Goris H，et al.Differential effects of recombinant human granulocyte colony stimulating factor（rhGCSF）on stem cells in marrow，spleen and peripheral blood in mice[J].Br J Haematol，1990，76（2）174-179.

[6]王亮，朱康兒，張濤，等.小鼠異基因造血干細胞移植后使用G-CSF對aGVHD的影響[J].中國病理生理雜志，2015，31（12）：2188-2194.

[7]John M.Gemery1，Andrew R.Forauer，Anne M.，et al.Hypersplenism in liver disease and SLErevisited：current evidence supports anactive rather than passive process[J].BMC Hematol，2016（16）：3.

[8]Petit I，Szyper-Kravitz M，Nagler A，et al.G-CSF induces stem cell mobilization by decreasing bone marrow SDF-1 and up-regulating CXCR4[J].Nat Immunol，2002，3（8）：787.

[9]Li Y M，Schilling T，Benisch P，et al．Effects of high glucose on mesenchymal stem cell proliferation and differentiation[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，363（1）：209-215．

[10]Dhanasekaran M，Indumathi S，Rajkumar JS，et al．Effect of high glucose on extensive culturing of mesenchymal stem cells derived from subcutaneous fat，omentum fat and bone marrow cell biochemistry and function[J].Cell Biochem Funct，2013，31（1）：20-29．

[11]YANG K，WANG X Q，HE Y S，et al．Advanced glycation end products induce chemokine/cytokine production via activation of p38 pathway and inhibit proliferation and migration of bone marrow mesenchymal stem cells[J].Cardiovasc Diabetol，2010（9）：66．

[12]Lataillade JJ，Clay D，Dupuy C，et al.Chemokine SDF-1 enhances circulating CD34（+）cell proliferation in synergy with cytokines：possible role in progenitor survival[J].Blood,2000，95（3）：756-68.

[13]Hageman GS，Luthert PJ，Victor Chong NH，et al.An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch’s membrane interface in aging and age-related macular degeneration[J].Prog Retin，Eye Res，2001，20（6）：705-732.

[14]Leung E1，Landa G.Update on current and future novel therapies for dry age-related macular degeneration[J].Expert Rev Clin Pharmacol，2013，6（5）：565-579.

[15]李雪麗，唐由之，范吉平，等.補腎益精方對RCS大鼠視網膜變性損傷的保護作用研究[J].中國中醫眼科雜志，2016，26（3）：144-149.

[16]徐富一，樸芝河.制何首烏對骨多孔癥白鼠的脊椎骨密度和骨無機質成分的研究[J].河南中醫學院學報，2004，19（6）：28-29.

[17]HUANG JIN，ZHANG JIN，XU ZHIWEI.Promoting effect and mechanism of polygonatummedicated serum on bone marrow mesenchymal stem cells proliferation[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2010，14（49）：9221-9224．

[18]翁玲，劉學英，劉彥.黃芪多糖對小鼠骨髓及外周血造血干細胞的增殖及動員作用[J].基礎醫學與臨床，2003，23（3）：306-309.

Effect of BushenYijing formula on mobilization of bone marrow-derived stem cells in dry age-related macular degeneration animals

HOU Le,LIANG Lina,TANG Youzhi.
Eye Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100040,China

OBJECTIVE To assess effect of Bushen Yijing formula on mobilizing bone marrow-derived stem cells in dry age-related macular degeneration animal model.METHODS This study used an animal model of sodium iodate(NaIO3)-induced retinal pigment epithelial(RPE)degeneration to observe variations of relative number and related cytokines of bone marrow-derived stem cells in peripheral blood.The first day after modeling,treatment group was administered with BushenYijing formula while the control group with distilled water.The normal group received no medication.Bone marrow cells(BMCs)and cytokine indicators changes in those three groups were observed on 7thday,14thday,28thday after treatment.RESULTS At the 7thday after treatment,the Lin-/Sca-1+/c-kit+cell level in treatment group was significantly higher than counterparts of control group and normal group in peripheral blood(PB)and the difference was of statistical significance;The granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF) level in control group was significantly higher than treatment group and normal group in PB and the difference was statistically significant;The Stromal Cell-Derived Factor 1 alpha(SDF-1a)and chemokine receptor type 4(CXCR-4) level in control group and treatment group was significantly lower than normal group in PB in statistical dimension. Fourteen days after treatment.The G-CSF level in the control group was still significantly higher than it in treatment group and the normal group in PB;The SDF-1a and CXCR-4 levels in the treatment group were significantly higher than the controlgroup in PB.And these differences were all of statistical significance.Twenty-eight days after treatment,the G-CSF level intreatment group was still significantly higher than the control group and the normal group in PB;The SDF-1a and CXCR-4 levels in PB of the treatment group were still significantly higher than it of control group.And the differences between groups were all statistically significant.CONCLUSIONS Bushen Yijing formula increased BMCs, G-CSF,SDF-1a and its receptor CXCR-4 level in peripheral blood and played an important role in mobilizing BMCs to PB.The mechanism might be that Bushen Yijing formula increased BMCs mobilization related factors in PB which promoted BMCs mobilization to PB.

Bushen Yijing formula;dry age-related macular degeneration;bone marrow-derived stem cells; mobilization

R285.5

A

1002-4379（2017）01-0003-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.01.001

國家自然科學基金項目（81473736）

中國中醫科學院眼科醫院，北京100040

梁麗娜，E-mail：lianglina163@163.com