4 種防腐劑對副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

雷 歡，謝 婷，魏宇清，劉 歡，鐘青萍,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.中山大學附屬第三醫院，廣東 廣州 510630）

4 種防腐劑對副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

雷 歡1,2，謝 婷1，魏宇清1，劉 歡1，鐘青萍1,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.中山大學附屬第三醫院，廣東 廣州 510630）

在確定4 種防腐劑殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和ε-聚賴氨酸對副溶血弧菌（Vibro parahaemolyticus）的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的基礎上，研究其對副溶血弧菌生物膜的抑制作用。采用結晶紫染色法測生物膜形成量，XTT法測生物膜代謝活性，硫酸-苯酚法測定生物膜中胞外多糖的分泌量。結果表明，殼聚糖的MIC最小，為1.25 mg/mL。4 種防腐劑在MIC以及亞抑菌濃度條件下對副溶血弧菌生物膜均有明顯的抑制作用，不僅抑制生物膜的形成，而且能顯著降低細菌的代謝活性，減少胞外多糖的分泌，其中殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的抑制作用最強。

副溶血弧菌；生物膜；防腐劑；抑制

副溶血弧菌（Vibro parahaemolyticus）是嗜鹽性革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于近海岸海水、海底沉積和魚貝類海洋生物中，是沿海地區引起食物中毒的重要致病菌[1-3]。近年來副溶血弧菌已成為食源性致病菌之首，在我國一些省市引起的食物中毒占細菌性食物中毒的60%以上[4-5]。副溶血弧菌污染的主要食物是海產品或鹽腌漬品，常見的有蟹類、貝類、海蜇、魚蝦、田螺等，其次是肉蛋類和蔬菜[6-7]。在自然環境中副溶血性弧菌主要以生物膜的形式存在[8]。生物膜是微生物細胞及其產生的細胞外大分子多聚物所形成的一種特殊細菌群落，它也是細菌抵抗不利環境、產生耐藥性并導致持續感染的重要方式[9-10]。研究表明成熟的生物膜內細菌的耐藥性是游離菌的500～5 000 倍[11]。因此，生物膜一旦形成，使用一般的抗生素、消毒劑很難去除，在醫療和食品安全等領域帶來很大的風險[12-13]。

目前對副溶血弧菌生物膜的研究主要是對生物膜形成條件的探究[14-16]，關于不同的防腐劑對其抑制作用的研究較少。本實驗研究了4 種食品防腐劑殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、ε-聚賴氨酸對副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用，分析其對生物膜形成量、生物膜代謝活性以及胞外多糖分泌量的影響，以期為防治副溶血弧菌污染提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血弧菌標準菌株ATCC17802購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，副溶血弧菌標準菌株J5421由中國軍事醫學科學院微生物流行病研究所贈送。菌種均保藏在-80 ℃條件下20%的甘油管中。

殼聚糖 青島潛光生物工程有限公司；山梨酸鉀武漢萬榮科技發展有限公司；脫氫乙酸鈉 廣東辰源精細化工有限公司；ε-聚賴氨酸 河南潤誠化工產品有限公司；鏈霉蛋白酶E（pronase E）、甲萘醌（純度＞98%） 美國Sigma公司；XTT（純度為98%） 南京凱基生物科技有限公司。

含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 130 g、去離子水1 L。用1 mol/L NaOH溶液調節pH值為7.0～7.4；121 ℃，0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min。含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養基（TSA）：在上述TSB配方的基礎上加入2%的瓊脂，加熱融化后滅菌。水解酪蛋白胨肉湯（MH肉湯）：稱取MH肉湯培養基21 g，加入去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Multiskan FC酶標儀、Forma Class Ⅱ A2生物安全柜美國Thermo公司；150A恒溫培養箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將菌種活化后，從TSA斜面培養基上挑取適量菌體，轉接入含3% NaCl的TSB培養基中，37 ℃恒溫150 r/min振蕩培養12～16 h，然后于4 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水將菌濃度調整到108CFU/mL左右待用。

1.3.2 二倍稀釋法測定防腐劑對副溶血弧菌的最小抑菌濃度

采用96 孔板微量稀釋法測定不同防腐劑的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。參考4 種防腐劑在食品保鮮過程中所使用的質量濃度，將其用MH肉湯培養基二倍稀釋成6 個梯度，孔中再加入終濃度為105CFU/mL的菌液，同時設置未加防腐劑的對照組，在30 ℃條件下培養24 h后首先肉眼觀察渾濁度，防腐劑質量濃度最小但孔內卻澄清的質量濃度可推測為最小抑菌濃度，然后在595 nm波長處測定吸光度，只有相鄰兩孔的吸光度差異較大且極顯著時（P＜0.01），確定為該防腐劑的MIC。

1.3.3 防腐劑對生物膜形成量的抑制

將制備好的濃度為108CFU/mL的菌懸液與TSB培養基按1∶3的比例加入96 孔板中，加入終質量濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/8 MIC的防腐劑溶液，同時設不加防腐劑的對照組。將96 孔板放置于30 ℃的培養箱中培養48 h，取出孔板，棄去游離菌，用250 μL無菌生理鹽水清洗2 次，然后60 ℃干燥固定15 min，再每孔加入0.1%的結晶紫溶液200 μL，染色5 min，用250 μL無菌生理鹽水清洗3 次，干燥后加入33%的冰乙酸200 μL，放置10 min，在595 nm波長處測OD值[17]。抑制率計算參考下式：

1.3.4 生物膜代謝活性測定

將XTT用磷酸鹽緩沖液配制成1 g/mL的溶液，貯存在-80 ℃冰箱中。甲萘醌在用之前溶解在丙酮中，使其終濃度為1 mmol/L，每次實驗所用XTT與甲萘醌比例為12.5∶1。不同防腐劑處理條件下副溶血弧菌培養48 h后形成生物膜，移除浮游菌，用100 μL無菌磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，加入13.5 μL的混合液，輕輕振動孔板，然后放置在黑暗處37 ℃溫育2～3 h，另設對照組，測定OD450nm值[18]。

1.3.5 胞外多糖含量測定

將制備好的濃度為108CFU/mL的菌懸液按1%的接種量加入到含有載玻片的液體培養基試管中，加入終質量濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/8 MIC的防腐劑溶液，同時設不加防腐劑的對照組。副溶血弧菌在30 ℃條件下培養48 h后形成生物膜，取出玻片，放入10 mL的生理鹽水中，超聲振蕩后取出玻片，將菌懸液煮沸10 min，室溫冷卻20 min。再加入50 μL的pronase E，37 ℃孵育2 h，加入200 μL的質量分數為10%的TCA溶液，冰水放置30 min，10 000 r/min離心30 min。收集上清液，加入等體積的乙醇溶液，-20 ℃放置1 h，15 000 r/min離心20 min，除去上清液，沉淀物用95%的苯酚和5 mL濃硫酸復溶，沸水浴10 min，反應液呈紅色，設置對照組，測定OD450nm值[19]。

1.4 數據統計與分析

應用SPSS 22.0軟件進行平均值和標準偏差的計算，并對其進行顯著性分析（P＜0.01為差異極顯著，0.01≤P＜0.05為差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 不同防腐劑對副溶血弧菌的MIC

表1 不同防腐劑對副溶血弧菌的MICTable 1 MICs of different food preservatives for V. parahaemolyticus

從表1可以看出，殼聚糖的MIC為1.25 mg/mL；山梨酸鉀的MIC為10 mg/mL，防腐劑不同，對副溶血弧菌的抑制作用所需的質量濃度也有差異。4 種防腐劑都可以有效地抑制副溶血弧菌的生長。每種防腐劑對2 株菌的MIC是一致的。

2.2 不同質量濃度防腐劑抑制副溶血弧菌生物膜形成

圖1 不同防腐劑對ATCC17802菌株（A）和J5421菌株（B）生物膜形成的抑制率Fig. 1 Inhibitory effects of different food preservatives on V. parahaemolyticus ATCC17802 (A) and V. parahaemolyticus J5421 (B)

設定4 個防腐劑的質量濃度均為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，測定它們對兩株副溶血弧菌的生物膜形成的影響。從圖1可以看出，不同質量濃度的4 種防腐劑對副溶血弧菌生物膜的形成有顯著的抑制作用，隨著質量濃度的升高，抑制率明顯增大。殼聚糖質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜的抑制率分別為70.98%、14.38%和67.90%、13.94%；山梨酸鉀質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜的抑制率分別為50.16%、7.06%和43.07%、9.93%；脫氫乙酸鈉質量濃度為MIC和1/8 MIC時對ATCC17802菌株、J5421菌株生物膜的抑制率分別為66.35%、11.50%和55.74%、10.23%；ε-聚賴氨酸質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜的抑制率分別為56.50%、9.67%和50.97%、7.22%。其中殼聚糖的抑制效果最顯著。兩株菌之間無顯著差異。

2.3 不同質量濃度防腐劑對副溶血弧菌生物膜代謝活性的影響

圖2 不同防腐劑對ATCC17802菌株（A）和J5421菌株（B）生物膜代謝活性影響Fig. 2 Effects of different food preservatives on the metabolic activity of V. parahaemolyticus ATCC17802 (A) and V. parahaemolyticus J5421 (B)

將培養后的菌株ATCC17802和J5421，通過XTT法檢測4 種防腐劑在不同質量濃度條件下對兩株菌代謝活性的影響，結果如圖2所示?？梢钥闯鲭S著防腐劑質量濃度的增加，生物膜代謝活性抑制率逐漸增大。殼聚糖質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為46.83%、17.17%和52.40%、12.37%；山梨酸鉀質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為24.81%、8.66%和23.59%、8.77%；脫氫乙酸鈉質量濃度為MIC和1/8MIC時對兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為40.63%、10.57%和37.06%、13.85%；ε-聚賴氨酸質量濃度為MIC和1/8MIC時對兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為33.58%、7.79%和32.98%、9.60%。其中，殼聚糖的抑制作用最強，即使亞抑菌質量濃度，1/2 MIC處理時，仍有明顯的抑制作用。

2.4 不同質量濃度防腐劑對副溶血弧菌胞外多糖產生的影響

圖3 防腐劑對ATCC17802菌株（A）和J5421菌株（B）生物膜胞外多糖產生的影響Fig. 3 Effects of different food preservatives on EPS secretion of V. parahaemolyticus ATCC17802 (A) and V. parahaemolyticus J5421 (B)

胞外多糖是細菌生物膜的主要成分，既是生物膜結構的基礎，又是功能的主要承擔者[20]。因此，抑制或減少細菌分泌胞外多糖，是抑制生物膜形成的一種重要方法。將培養后的菌株ATCC17802和J5421，通過苯酚-硫酸法檢測4 種防腐劑在不同質量濃度條件下對兩株菌胞外多糖的影響，結果如圖3所示。隨著防腐劑質量濃度的增加，生物膜胞外多糖抑制率逐漸增大。殼聚糖質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為78.04%、27.01%和76.87%、29.38%；山梨酸鉀質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為55.53%、17.25%和48.56%、14.30%；脫氫乙酸鈉質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為67.53%、24.08%和64.65%、18.04%；ε-聚賴氨酸質量濃度為MIC和1/8 MIC時對兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為60.33%、18.14%和56.76%、 14.18%。而且，亞抑菌質量濃度1/2 MIC條件下的4 種防腐劑的抑制作用強度與MIC的抑制作用無顯著差異，與1/4 MIC和1/8 MIC的抑制作用有顯著性差異（P＜0.05）。其中，殼聚糖對兩株菌生物膜胞外多糖的產生影響最大。

3 結論與討論

4 種防腐劑在MIC以及亞抑菌質量濃度條件下對副溶血弧菌生物膜均有明顯的抑制作用，不僅抑制了生物膜的形成，而且生物膜內細菌的代謝活性明顯下降，胞外多糖的分泌也減少了。其中殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的抑制作用最強，其對兩株菌的生物膜抑制率分別為70.98%和67.90%，代謝活性抑制率分別為46.83%和52.40%，胞外多糖的抑制率分別為78.04%和76.87%。

近年來尋求天然、高效、安全的防腐劑以控制生物膜的研究逐漸興起，如有研究報道了天然產物（生姜提取物、大蒜提取物、茶多酚、留蘭香精油）可有效地抑制副溶血弧菌生物膜的形成[20-21]。殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、ε-聚賴氨酸是應用較廣的食品防腐劑，它們的抑菌譜不同，抑菌效果也大不相同。本實驗考察了這兩種天然防腐劑和兩種化學防腐劑對副溶血弧菌生物膜的抑制作用，研究發現這4 種防腐劑對副溶血弧菌生物膜均有顯著的抑制作用，在MIC以及亞抑菌質量濃度條件下，對生物膜的形成量、代謝活性、胞外多糖的產生皆表現出抑制效果，其中殼聚糖的抑制作用最強。殼聚糖對于細菌成熟生物膜的作用，可能是殼聚糖通過自身所帶的正電荷與微生物細胞膜所攜帶的負電荷相互作用，破壞細菌細胞壁原有結構，造成細胞成分的泄漏而起到抗菌作用[22]。一些小分子的殼聚糖可以滲透進入細胞內與帶陰離子的生物大分子發生作用，破壞細胞的正常代謝活動，從而抑制細菌的生長[23]。胡春紅等[24]研究發現，經過殼聚糖涂膜后的介質表面對細菌和真菌生物膜的形成具有抑制作用；Zheng Zhonghui等[25]研究發現殼聚糖結合抗生素對李斯特菌被膜的抑制和清除作用顯著。Costa等[26]研究表明低濃度的山梨酸鉀對金黃色葡萄球菌的生長和生物膜形成具有明顯的抑制作用，高鹽濃度下山梨酸鉀會導致細胞內外滲透壓改變，使得細胞膨脹細胞內物質外溢，生物膜結構受到破壞，從而導致細菌生存能力下降[27]。此外，脫氫乙酸鈉的抗菌作用主要在于氨基酸脫氫酶的活性[28]。也有研究報道ε-聚賴氨酸在酸性條件下與乳酸鏈球菌素復配使用，能夠更好地抑制微生物的生長[29]，其作用機制主要是因為靜電相互作用的影響以及進入生物膜的能力的差異性，對生物膜的抑制作用受到周圍液體中二價陽離子的影響，減小pH值和增加ε-聚賴氨酸的正電荷可以有效抑制生物膜形成[30]。因此，防腐劑在控制細菌生物膜方面具有較好的應用前景，可進一步開發復合抗生物膜制劑，減少使用量，提高效果。

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Inhibitory Effects of Four Kinds of Food Preservatives on Biof i lm Formation by Vibrio parahaemolyticus

LEI Huan1,2, XIE Ting1, WEI Yuqing1, LIU Huan1, ZHONG Qingping1,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. The Third Aff i liated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China)

In this study, we analyzed the minimum inhibitory concentrations (MICs) of four kinds of food preservatives (chitosan, potassium sorbate, sodium dehydroacetate and ε-polylysine) for Vibro parahaemolyticus, and we then investigated their inhibitory effects on biof i lm formation by V. parahaemolyticus. The crystal violet straining method was conducted to determine the amount of biof i lm, and XTT reduction assay and phenol-sufuric acid method were used to detect the changes of metabolic activities and extracellular polysaccharide of biofilm, respectively. The results showed that the MIC of chitosan was the lowest, which was 1.25 mg/mL. At both MIC and sub-MIC, these four food preservatives could not only demonstrate a remarkable inhibitory effect on biof i lm formation by V. parahaemolyticus, but also reduce the metabolic activity and the secretion of extracellular polysaccharides of cells in biof i lms. Among these preservatives, the inhibitory effect of chitosan was the strongest.

Vibrio parahaemolyticus; biof i lm; food preservatives; inhibition

10.7506/spkx1002-6630-201707002

TS201.3

A

1002-6630（2017）07-0006-05

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LEI Huan, XIE Ting, WEI Yuqing, et al. Inhibitory effects of four kinds of food preservatives on biofilm formation by Vibrio parahaemolyticus[J]. Food Science, 2017, 38(7): 6-10. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201707002. http://www.spkx.net.cn

2016-06-29

國家自然科學基金面上項目（31271956）

雷歡（1990—），女，碩士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：15017568226@163.com

*通信作者：鐘青萍（1967—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全、食品微生物。E-mail：zhongqp@scau.edu.cn