柑橘采后生理代謝對膠孢炭疽菌粗毒素的動態響應

黃小蘭，王日葵,2,*，韓 冷,2，賀明陽,2，周 煉,2

（1.西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2.國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712）

柑橘采后生理代謝對膠孢炭疽菌粗毒素的動態響應

黃小蘭1，王日葵1,2,*，韓 冷1,2，賀明陽1,2，周 煉1,2

（1.西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2.國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712）

目的：探究膠孢炭疽菌毒素對柑橘生理代謝的動態影響，為研究膠孢炭疽菌的致病機理提供理論參考。方法：在有機溶劑浸提法獲得膠孢炭疽菌粗毒素的基礎上，采用針刺接種法進行毒素的生物測定，分析粗毒素和病原菌對柑橘采后生理代謝（總酚、類黃酮含量；過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，

炭疽菌；毒素；生理代謝；柑橘

炭疽病是嚴重影響柑橘采后貯藏的重要病害[1]，半知菌亞門炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）為柑橘炭疽病的主要致病菌，有較強的致病能力，能引起貯藏期間的柑橘產生病斑甚至腐爛，造成嚴重的經濟損失[2]。目前國內對柑橘炭疽病的研究主要集中于病原菌的生長特性[3]及其拮抗菌篩選[4-5]等方面，對于膠孢炭疽菌毒素致病機制報道較少。國外有關膠孢炭疽菌毒力大小的研究指出，環境pH值、病原菌的分泌蛋白和編碼與致病力有關的基因是病原菌的毒力因子，改變pH值等條件會影響病原菌的致病力[6-8]。然而，這些報道主要集中在毒素的產生條件、結構分析和是否具有寄主?；缘萚9-11]，對于毒素對寄主生理代謝影響等方面的探索較少，為此，本實驗在使用有機溶劑浸提法提取粗毒素的基礎上，研究其對柑橘在貯藏期間生理代謝的影響，旨在進一步解釋膠孢炭疽菌的致病機理和柑橘的抗性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠孢炭疽菌由本實驗室從北碚447＃錦橙（Citrus sinensis L. Osbeck cv. Jincheng 447#）果實上分離并保藏。錦橙采于重慶市歇馬鎮馮家槽果園，品種為北碚447＃錦橙。

改良察氏培養基：NaNO33 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖20 g，蒸餾水1 L。

1.2 儀器與設備

SPX-150-Z振蕩培養箱 上海博泰實驗設備有限公司；ZHWY-200B恒溫培養振蕩器 上海智械分析儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇泰集團蘇州安泰空氣技術有限公司；TU-1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；MIR-352H-PC通用環境實驗箱、MDF-U4186S醫用低溫培養箱 松下健康醫療器械株式公社；H1850R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠孢炭疽菌粗毒素的制備

根據文獻[12]方法并適當修改以制備膠孢炭疽菌粗毒素。將保存于4 ℃冰箱的菌株于馬鈴薯瓊脂培養基中活化，28 ℃連續培養7 d。用打孔器取出3 塊直徑5 mm的菌餅于500 mL液體改良察氏培養基中。28 ℃，黑暗，135 r/min連續培養20 d。培養液先用4 層無菌紗布過濾，再經冷凍離心機離心（10 000 r/min、10 min），得上清液。在分液漏斗中加入等體積的甲醇，振蕩使得兩種液體充分混合后移除有機相，連續萃取3 次，將合并的有機相使用旋轉蒸發儀減壓蒸發濃縮，即得到膠孢炭疽菌粗毒素，加入無菌水使得粗毒素體積為100 mL。

1.3.2 膠孢炭疽菌孢子懸浮液的制備

取活化的菌平板，將無菌水滴加于平板上，制備孢子懸浮液并用血球計數板于顯微鏡下觀察，計算孢子懸液濃度，使得終濃度為1×106spores/mL，備用。

1.3.3 粗毒素的活性檢測

選用大小均一的無傷錦橙果實，清洗干凈后用75%的酒精擦拭消毒，晾干備用。針刺接種10 μL粗毒液，以無菌水為對照，單果包裝后置于28 ℃、相對濕度為85%的培養箱內貯藏，測定果實的病斑直徑。每個處理設3 次重復，每個重復10 個果實，每個果實針刺數10 針。

1.3.4 粗毒素脅迫處理

選擇外觀無損傷、大小均一、無病蟲害的柑橘果實作為實驗材料。清洗干凈后用75%的酒精擦拭消毒。晾干備用。本實驗共分為3 個處理，每個處理設3 次重復，每個重復10 個果實，每個果實針刺數10 針。第1組為針刺接種10 μL粗毒素，第2組為針刺接種10 μL膠孢炭疽菌孢子懸浮液，對照組為針刺接種10 μL無菌水。果實晾干后單果包裝，置于28 ℃、相對濕度為85%的保濕恒溫培養箱內貯藏，于第0、1、2、4、6、8天測量病斑直徑后，取接種部位周圍1 cm×1 cm果皮組織，經液氮速凍研磨成粉后于-80 ℃冰箱冷凍保存，備用測定各生理指標。

1.3.5 生理生化指標測定

1.3.5.1 總酚、類黃酮含量測定

稱取2 g經液氮研磨的果皮粉，加入50%甲醇30 mL，搖床振蕩提取60 min后經冷凍離心（10 000 r/min、10 min），取上清液即為待測液體?？偡雍康臏y定采用福林-酚比色法[13]，以沒食子酸作為標準品制作標準曲線（回歸方程為y=0.281x-0.215，R2=0.996），其含量用等量沒食子酸（mg/g）表示。類黃酮含量的測定采用蘆丁法[14]，以蘆丁為標準品制作標準曲線（回歸方程為y=1.046x-0.004，R2=0.999），其含量用等量蘆?。╩g/g）表示。

1.3.5.2 防御酶系活性測定

稱取2 g果皮粉，加入適量不同的提取緩沖液，置于4 ℃冰箱中放置過夜，冷凍離心（10 000 r/min、10 min）取上清液，即得粗酶提取液。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測定采用兒茶酚法[15]，以每分鐘吸光度變化（ΔA410nm）0.01為一個酶活力單位；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測定采用愈創木酚法[15]，以每分鐘每克樣品吸光度變化（ΔA470nm）0.01為一個酶活力單位；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定采用氮藍四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）還原法[16]，以抑制NBT光還原反應50%所需的酶量為一個酶活性單位；苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活性測定采用張璐等[17]方法，以每小時每克果皮（鮮質量）酶促體系在290 nm波長處吸光度增加0.01為一個酶活力單位。β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）采用Luo Yang等[18]的方法，以每秒鐘每克樣品（鮮質量）中分解昆布多糖產生1×10-7mol葡萄糖為一個酶活性單位。每組實驗3 個重復。

1.3.5.3 丙二醛含量測定

參照李姝江[19]的方法，并做適當修改。稱取2 g果皮粉，加入30 mL 5%三氯乙酸，浸提過夜，離心（10 000 r/min、10 min）取上清液用于測定。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量單位為mmol/g。

1.3.5.4 纖維素、半纖維素、木質素、果膠含量測定

纖維素、木質素含量測定采用硫酸亞鐵銨-重鉻酸鉀滴定法，半纖維素含量測定采用DNS法[20-22]，纖維素、半纖維素、木質素的含量以其占樣品總量的質量百分數表示；果膠含量測定采用烘干的果皮粉進行測定，其含量以生成半乳糖醛酸的質量分數（%）表示。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0和Excel軟件對實驗數據分析，因素間差異顯著性采用鄧肯法分析，并用Origin 8.1軟件繪圖，實驗處理數據以±s的形式表示。

2 結果與分析

2.1 粗毒素的活性檢測結果

圖1 培養期間柑橘的病斑直徑變化Fig. 1 Changes in lesion diameter in citrus during storage

針刺法檢測中，膠孢炭疽菌粗毒素具有較高的活性，能引起柑橘果實產生深褐色、圓形病斑，隨著時間的延長，粗毒素對柑橘的傷害程度呈加重趨勢，其病斑逐漸增大（圖1）。當培養至第8天時，其病斑直徑為4.11 mm，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05）。對照組在整個實驗期間無明顯變化。

2.2 粗毒素對柑橘酚代謝的影響

圖2 不同處理對柑橘果皮總酚含量和類黃酮含量的影響Fig. 2 Effect of different treatments on the contents of phenols and fl avonoids in citrus peel

如圖2所示，粗毒素接種柑橘果實后，總酚含量呈上升趨勢，而后下降。在第6天達到峰值，為4.07 mg/g，比對照組增加了27.18%，具有顯著性差異（P＜0.05）。接種孢子懸液也可使總酚含量上升，與接種粗毒素的趨勢相似。但其高峰出現較晚，原因可能是初期菌體生長緩慢，對柑橘造成的傷害較小，未能激發總酚的合成。類黃酮的含量在接種粗毒素后呈第1天急劇上升后緩慢上升再下降的趨勢，也在第6天達到峰值，為2.55 mg/g，相比對照增加了37.1%。接種孢子懸液的果實中類黃酮含量呈上升趨勢且在前期低于接種粗毒素的果實。說明粗毒素能對果實造成生理傷害，激發果實積累類黃酮并保持較高濃度。

2.3 粗毒素對柑橘防御酶系的影響

圖3 不同處理對柑橘防御酶系的影響Fig. 3 Effect of different treatments on the activities of antioxidant defense enzymes in citrus

PPO是一種以銅為輔基的酶，能催化多種酚類物質形成醌類化合物抵御外來有害物[23-24]，如圖3A所示，3 種處理方式對果皮PPO活性的影響變化相似，均呈先下降后上升再下降趨勢。接種粗毒素組的第1個酶活力高峰出現在第4天，相比對照增加了2.8%，第8天增加了8.4%且具有顯著性差異（P＜0.05）。在前期，接菌處理的酶活力高于接種粗毒素處理組，原因可能是病原菌對PPO活性的誘導性更強，產生大量醌類化合物以殺滅病原菌。而后期接菌處理組病原菌大量繁殖，產生毒素過量，進而破壞PPO酶系統使其酶活急劇下降，這說明低濃度粗毒素可誘導PPO活性，而高濃度則會損傷機體組織。

POD是一類普遍存在于植物組織內的氧化還原酶，它與光合作用、呼吸作用等密切相關[25-26]。如圖3B所示，接種粗毒素組其酶活呈先上升后下降趨勢，在第6天達到峰值。相比對照組增加了142.8%，達到極顯著差異（P＜0.01）。接菌組總體呈上升趨勢，且在后期酶活大于接種粗毒素組。表明粗毒素具有與病原菌相似的致病機制，但粗毒素接種在前期能更快地激發柑橘體內POD活性的提高。

SOD存在于大多數動植物和微生物體內，能清除超氧陰離子自由基，減少植物傷害[27]。因此常作為重要的抗性生理指標。如圖3C所示，兩實驗組的SOD活性均為先下降再上升，且都在第4天達到峰值，接種粗毒素組相比對照組酶活性增加了12.94%，達到顯著性差異（P＜0.05）。且接種粗毒素組的SOD活性整體均大于接菌組，可能是由于粗毒素對果實造成的生理傷害信號較強，產生的自由基多于接菌組，因此酶活性高于接菌組。但在后期機體組織損傷嚴重，酶系統受到損壞，使得SOD活性大幅下降。對照組SOD活性在第一天上升，之后緩慢下降。

PAL是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶，參與眾多植物次生物質（黃酮類物質、酚類物質、木質素等）的生物合成，對植物抵御病原菌及外界侵害起著至關重要的作用[28]。如圖3D中，果實接種粗毒素后，其PAL活性呈下降趨勢，第2天達到最小值，相比對照酶活力下降了23.25%，為1.65 U/（g·min）。后期有所上升，但變化不顯著，表明粗毒素中含有能夠破壞PAL酶系統的物質，使得酶活性低于對照組。接菌組酶活性先上升到達峰值后便急劇下降，表明膠孢炭疽菌在生長后期產生了高濃度的毒素等對酶系統具有嚴重損傷作用的物質。

GLU能水解多聚糖，使真菌細胞壁受到損壞。當植物體被真菌侵染或受到機械損傷時，其活性可大幅度提高，以增強植物抗性。由圖3E可看出，3 種處理均能使GLU活性升高，兩實驗組達到峰值后便急劇下降，最后緩慢升高。對照組為總體緩慢上升的趨勢，表明對GLU活性影響最大的依次是接種病原菌、粗毒素和機械損傷。

2.4 粗毒素對柑橘果皮MDA含量的影響

圖4 不同處理對柑橘MDA含量的影響Fig. 4 Effect of different treatments on MDA contents in citrus

MDA是膜脂過氧化的主要產物之一，通常利用它的含量作為膜脂過氧化指標，反映細胞膜脂過氧化的程度。其含量越高，表明植物抵御外界逆境的能力越弱。圖4中兩實驗組與對照組相比果皮中MDA含量均更高，到第8天時，接種粗毒素組的MDA含量為對照組的1.44 倍，達到顯著性差異（P＜0.05）；接菌組為對照組的1.89 倍，達到極顯著差異（P＜0.01）。說明膠孢炭疽菌粗毒素和病原菌對果實細胞膜脂過氧化水平和膜系統傷害程度均較大，但前期接種粗毒素組的MDA含量高于接菌組，后期小于接菌組。原因可能是前期接種粗毒素組有害物質較接菌組濃度高，對膜系統損傷更大。后期病原菌繁殖產生大量有害毒素，增大了膜系統的傷害。由此說明隨著毒素濃度的增高，果實細胞膜損傷越大。

2.5 粗毒素對柑橘果皮細胞壁成分含量的影響

圖5 不同處理對柑橘果皮細胞壁成分含量的影響Fig. 5 Effect of different treatments on the contents of cell wall components in citrus peel

植物細胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素、木質素和果膠。它們相互連接構成細胞壁的機械屏障，以此抵御外界環境的改變。圖5為不同處理對柑橘果皮細胞壁成分的影響，可看出接種粗毒素和病原菌后，纖維素、半纖維素和果膠含量總體呈下降趨勢，并且在接種前期接種粗毒素組的下降速率大于接種病原菌組，后期逐漸變小，表明粗毒素中含有高濃度的能水解纖維素、半纖維素和果膠的酶類，這與大多數菌體在生長后期分泌多種水解酶類的報道一致[29-30]。但前期酶類消耗過大，在后期無法降解過多的細胞壁成分，因此其下降速率變小。而接種病原菌組在后期菌體繁殖，分泌較多的水解酶類，使得纖維素等含量急劇下降。

木質素是植物重要的抗性物質，它主要填充在細胞壁內，增加細胞硬度。接種粗毒素組在1～4 d內迅速累積木質素，達到峰值，相比對照增加了18.85%，隨后又下降。且相比接種病原菌組其木質素含量顯著增加，表明粗毒素能引起果實產生抗逆反應，誘導木質素的合成。后期木質素含量下降可能與相關降解酶的合成有關。對照組木質素含量呈上升趨勢，說明機械損傷也能誘導木質素的大量累積。

2.6 接種粗毒素組各生化指標與果皮病斑直徑的相關性分析

表1 各生化指標與病斑直徑的相關性分析Table 1 Correlation analysis between biochemical indexes and lesion diameter

病斑直徑可用于表示果實受傷害程度，采用SPSS 17.0軟件進行各生理生化指標和病斑直徑之間的相關性分析。如表1所示，病斑直徑與果實POD活性、MDA、類黃酮、纖維素、半纖維素和果膠含量之間有顯著關系（P＜0.05），PPO活性和木質素含量與病斑直徑有極顯著關系（P＜0.01）。其中病斑直徑與PPO活性、POD活性、類黃酮以及木質素含量呈正相關，與纖維素、半纖維素和果膠含量呈負相關，即當果皮細胞壁成分含量下降，PPO活性、POD活性、MDA、類黃酮以及木質素含量升高時，果實病斑直徑增大，機體受到損傷嚴重。

3 結 論

膠孢炭疽菌粗毒素能影響采后柑橘果實的多種生理代謝功能。酚代謝能力增強，使得總酚和類黃酮含量比對照組大幅度增加；防御酶活性上升，表明粗毒素能誘發果實的抗性反應；MDA含量增加，果實細胞膜脂過氧化加重，表明果實細胞膜受到粗毒素的損傷；果皮細胞壁成分含量降低，說明粗毒素中含有某些水解酶類降解了纖維素、半纖維素和果膠等大分子成分。粗毒素在引起果實抗性反應的同時，增加了木質素的生成量，果實的抗逆性得到增強。當毒素處于一定濃度范圍內時，果實病斑直徑與各生理代謝指標存在線性關系，而當毒素濃度高于果實所承受的范圍時，寄主機體組織損傷，造成嚴重生理傷害。其原因可能是毒素對寄主的細胞組分造成的損傷導致的。在初步弄清毒素對寄主生理代謝影響的基礎上，可以進一步將毒素提純，明確毒素的化學性質，進而可將毒素用于篩選抗病品種等。

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Dynamic Response of Physiological Metabolism in Postharvest Citrus to Crude Toxin from Colletotrichum gloeosporioides

HUANG Xiaolan1, WANG Rikui1,2,*, HAN Leng1,2, HE Mingyang1,2, ZHOU Lian1,2
(1. Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China; 2. National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712, China)

Objective: The dynamic response of physiological metabolism in postharvest citrus to toxin from Colletotrichum gloeosporioides was studied to obtain a better understanding of the interaction between citrus and C. gloeosporioides. Methods: The crude toxin was isolated by organic solvent extraction, and its bioassay was performed by the acupuncture method in postharvest citrus. Moreover, the dynamic effects of the crude toxin and pathogenic bacteria on physiological metabolism of citrus fruits in terms of the contents of phenols, flavonoids, and malondialdehyde (MDA), cell wall components in citrus peel and the activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), phenylalanine ammonialyase (PAL), and β-1,3-glucanase (GLU) were analyzed. Results: Typical lesion caused by the toxin was observed, and the content of MDA was signif i cantly increased, while the content of cell wall compounds was decreased. Upon treatment with the crude toixn at a low concentration, there was a positive correlation of lesion diameter with the content of fl avonoids, lignin and the activities of PPO and POD, whereas a negative correlation existed between cell wall compounds and lesion diameter. However, the defense enzyme system and citrus fruits were damaged by the crude toxin at a high concentration, causing a dramatic decrease in the enzyme activities. Conclusion: Physiological metabolism of citrus fruits can be inf l uenced by the crude toxin of C. gloeosporioides , and thus it plays an important role in the pathogenicity of C. gloeosporioides.

Colletotrichum gloeosporioides; toxin; physiological metabolism; citrus

10.7506/spkx1002-6630-201707039

TS201.3

A

1002-6630（2017）07-0247-06

2016-06-07

重慶市科技計劃項目（cstc2016shms-ztzx80005）；國家科技支撐計劃項目（2015BAD16B07）

黃小蘭（1991—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：793105210@qq.com

*通信作者：王日葵（1962—），男，副研究員，學士，研究方向為果蔬貯藏保鮮及物流。E-mail：ewrk@163.com

黃小蘭, 王日葵, 韓冷, 等. 柑橘采后生理代謝對膠孢炭疽菌粗毒素的動態響應[J]. 食品科學, 2017, 38(7): 247-252. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707039. http://www.spkx.net.cn

HUANG Xiaolan, WANG Rikui, HAN Leng, et al. Dynamic response of physiological metabolism in postharvest citrus to crude toxin from Colletotrichum gloeosporioides[J]. Food Science, 2017, 38(7): 247-252. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707039. http://www.spkx.net.cn

PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、

β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活性；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、果皮細胞壁成分含量）的動態影響。結果：膠孢炭疽菌粗毒素能使柑橘果實產生典型的病斑癥狀，且使MDA含量顯著增高，細胞壁成分含量降低。當毒素濃度較低時，果實病斑直徑與PPO活性、POD活性、類黃酮以及木質素含量呈正相關；與纖維素、半纖維素和果膠含量呈負相關。毒素濃度增高時，果實機體及防御酶系統遭到破壞，酶活性急劇下降。結論：膠孢炭疽菌粗毒素能影響柑橘果實生理代謝，引起果實發病，最終導致病斑的形成。由此證明毒素在膠孢炭疽菌對柑橘的致病過程中起到重要作用。